本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種長非編碼RNA及其在診斷/治療非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌是世界范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)死亡的最常見的原因，其中非小細(xì)胞肺癌約占所有的肺癌病例的80％-85％。肺腺癌(LUAD)和肺鱗狀細(xì)胞癌(LUSC)是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的兩種主要病理類型。雖然臨床NSCLC的治療在不斷發(fā)展，但患者的5年生存率仍然是令人失望的。因此，更好地了解NSCLC的發(fā)病機(jī)理和分子機(jī)制對NSCLC的早期診斷和治療至關(guān)重要。

最近，大量的原癌基因和抑癌基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控者。除了蛋白編碼基因，長非編碼RNA(lncRNA)也逐漸成為包括NSCLC在內(nèi)的腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。lncRNA是一類長度超過200nt，無蛋白質(zhì)編碼能力的RNA分子。文獻(xiàn)報道，lncRNA在多個水平上調(diào)控基因表達(dá)，包括染色質(zhì)重塑，表觀遺傳學(xué)修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控RNA穩(wěn)定性等。除此之外，lncRNA的失調(diào)能夠改變多種多樣的細(xì)胞生物學(xué)過程，并導(dǎo)致各種人類疾病，特別是癌癥。證據(jù)表明，lncRNA在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。例如，lncRNA PANDAR的低表達(dá)預(yù)示著NSCLC不良預(yù)后，并通過調(diào)控Bcl-2影響細(xì)胞凋亡；LINC00673的上調(diào)通過與LSD1的相互作用，進(jìn)而抑制NCALD的表達(dá)來促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖。雖然，在NSCLC中已有一些lncRNAs的功能和幾種分子機(jī)制被報道，但其他lncRNAs在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中的作用至今仍然不明。

鑒于lncRNAs在NSCLC中的重要性，我們探究了lncRNA SFTA1P，通過GEO數(shù)據(jù)庫，TCGA RNA測序數(shù)據(jù)分析和qPCR的檢測，與鄰近正常組織相比，SFTA1P在NSCLC組織中表達(dá)顯著減少。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，NSCLC中SFTA1P的下調(diào)與腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期晚相關(guān)；低表達(dá)水平的SFTA1P患者預(yù)后相對較差。而且，功能實(shí)驗(yàn)表明異位過表達(dá)SFTA1P能夠抑制NSCLC細(xì)胞侵襲和和體內(nèi)轉(zhuǎn)移，該過程部分通過調(diào)控EZH2表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果表明，SFTA1P是NSCLC的一個重要轉(zhuǎn)移抑制因子，可作為NSCLC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的潛在分子標(biāo)記物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供用于診斷非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)預(yù)后情況或作為治療非小細(xì)胞肺癌藥物靶點(diǎn)的lncRNA SFTA1P，其基因位于10p14，長度為693核苷酸，其核苷酸序列為SEQ ID NO：1，

SEQ ID NO:1：

CTTGGCAGAGAGCGCCCTGGGAAATGCGGATATAGAAGGTCAGGAGAACATCTCTCCTGGTTATACAGCATTCCAGGTGGGCTTTCATGTGGTTGAGGATAATATCATTAGCACCAAAGGTGAAAATCCGTGGAAGCTCATCTTATTTCAGCAGAAGAGTAGGATGGGCCTTGTGGCACGAGTAAGCCAAACAAGGGAAAGGCATTCACCATCAATTGACTCCTCATCTGTTTTTAAGAGGGAAATCTGAGTTTTCAAGGAAAGCCGAATACAGTTGCCAAGTTGCCAGTCAAAGAAACAATGTCAACACCTGCTCATAGAGATGGAATTCCTAACCCGGAATATTGCCCTTGAATTACAACGAGAAAAAGCACCTCTTCAAGTGAGATGGCAGACCACCTCAGGATGGAAATGTATTTCTTCATCCCCCTCTCTACTTCCCTGTGACCTCCTGCAAATAAGGGAGAGACAAAGAGAAGAGCAGAAGAACAGAAGAATGGAGTGGCAAAGAGAAGAGAAGGAGTGACTGAACATTGACAAGACTTTGGTTGGGGATGGTCAGAGAGGAGATTAGCTGCTAGACGGCCACACTGCGGAGAAAGATCATTTTCCCACTCCATCCCCCTTCCAGCTCCCCATCCATCTCACCAAGAGCCAGCTCCACCACTCAATAAAACCTTACATTCATCTTTC

本發(fā)明還涉及識別所述的長非編碼RNA的標(biāo)記物在制備判斷非小細(xì)胞肺癌治療預(yù)后情況的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的標(biāo)記物包括但不限于：

(1)結(jié)合所述長非編碼RNA的引物/引物組或熒光標(biāo)記的結(jié)合所述長非編碼RNA的引物/引物組；

(2)結(jié)合所述長非編碼RNA的小分子化合物；

(3)結(jié)合所述長非編碼RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗體或抗體功能片段、熒光標(biāo)記的抗體或抗體功能片段、RNA結(jié)合蛋白或其功能片段、熒光標(biāo)記的RNA結(jié)合蛋白或其功能片段。

優(yōu)選的，所述的引物組或熒光標(biāo)記的引物組的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，

SFTA1P Primer F(SEQ ID NO：2)：5'CAGCATTCCAGGTGGGCTTT3',

Primer R(SEQ ID NO：3)：5’-CCTTGTTTGGCTTACTCGTGC-3’。

GAPDH Primer F(SEQ ID NO：4)：5'GGGAGCCAAAAGGGTCAT 3',

Primer R(SEQ ID NO：5)：5'GAGTCCTTCCACGATACCAA 3'。

本發(fā)明還涉及包含所述的識別所述的長非編碼RNA的標(biāo)記物的用于判斷非小細(xì)胞肺癌治療預(yù)后情況的試劑或試劑盒。

本發(fā)明還涉及所述的識別所述的長非編碼RNA的標(biāo)記物或包含所述標(biāo)記物的試劑或試劑盒在判斷非小細(xì)胞肺癌的治療預(yù)后情況中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及所述的長非編碼RNA在制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用；

本發(fā)明還涉及所述的長非編碼RNA在作為篩選判斷非小細(xì)胞肺癌預(yù)后情況的診斷試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及所述的長非編碼RNA在作為篩選治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)方案

組織收集

60對NSCLC和對應(yīng)的鄰近的非腫瘤樣本是從病人中獲得，這些病人是在2010年到2012年間，在南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)。所有病例根據(jù)組織病理學(xué)評價確認(rèn)為非小細(xì)胞肺癌。這些病人手術(shù)前沒有進(jìn)行局部的或系統(tǒng)的治療。所有收集的組織樣本立即速凍在液氮里，并儲存在-80℃?zhèn)溆?。我們的研究得到了南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的研究倫理委員會批準(zhǔn)。并從所有的病人中獲得書面知情同意。

細(xì)胞培養(yǎng)

五個腺癌非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(SPC-A1,A549,PC9,NCI-H1299,NCI-H1975)，一個非小細(xì)胞肺癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(SK-MES-1)，和一個正常的人類支氣管上皮細(xì)胞系(16HBE)，這些是從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購買(上海，中國)。NCIH1299，NCI-H1975，SK-MES-1和16HBE細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；SPC-A1和PC9細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基中含有10％的胎牛血清，100U/毫升青霉素和100毫克/毫升的鏈霉素的，在37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

RNA提取和定量PCR分析

根據(jù)試劑的使用說明，用Trizol試劑分離總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用TaKaRa Prime Script試劑盒(TaKaRa，大連，中國)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最終體積為20μl。結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，采用相對量法與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析。計算公式為：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

質(zhì)粒構(gòu)建

人SFTA1P全長cDNA序列合成并插入到pcDNA3.1載體中。SFTA1P的異位過表達(dá)是通過pcDNA-SFTA1P轉(zhuǎn)染獲得的，以一個空的pcDNA載體為對照。48小時后qRT-PCR檢測SFTA1P的表達(dá)水平。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)操作說明用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體(pcDNA3.1-SFTA1P和空的pcDNA載體)。A549和PC9細(xì)胞融合滿了就接種到六孔板里，然后根據(jù)說明操作。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞，用于qRT-PCR或免疫印跡分析。

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

24孔板中放置8μm孔徑大小的Transwell小室。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，用50mg/l BD Matrigel 1：5稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，包被好的小室放入24孔板中，孵箱中孵育2h。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1x10⁵。取細(xì)胞懸液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入600μl含10％FBS的培養(yǎng)基，放入孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24h。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞密度至1-10x10⁴。取細(xì)胞懸液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入600μl含10％FBS的培養(yǎng)基，放入孵箱中常規(guī)培養(yǎng)24h。取小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，用0.1％結(jié)晶紫將小室外底面的細(xì)胞染色利用倒置顯微鏡對Transwell小室底膜上下室側(cè)附著的染色的細(xì)胞拍照計數(shù)。

裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)

4周齡雌性裸鼠BALB/c小鼠，購自南京大學(xué)模式動物中心；培養(yǎng)A549細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染pCDNA-SFTA1P或空載體；細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時，胰酶消化，PBS洗兩遍，重新懸浮在無血清培養(yǎng)基中，并計數(shù)。2組細(xì)胞均取1×107個細(xì)胞懸浮在0.1ml無血清1640培養(yǎng)基中，尾靜脈注射建立實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型。注射細(xì)胞6周后處死裸鼠，取肺部組織標(biāo)本，觀察肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)目、大小，并拍照。以上所有的實(shí)驗(yàn)程序都是按著NIH1996年版的動物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)來執(zhí)行的。用全價顆粒飼料喂養(yǎng)小鼠，自由飲水，室溫(22±2)℃，濕度50～60％，通風(fēng)良好，12:12h光照/黑暗周期。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)動物保護(hù)和倫理委員會(IACUC)批準(zhǔn)。

免疫印跡分析和抗體

細(xì)胞蛋白裂解產(chǎn)物通過10％SDS-PAGE分離開，轉(zhuǎn)移到0.22μm NC膜，用特定的抗體孵育。放射自顯影用密度測定法從而被量化。GAPDH抗體被用來作為對照。EZH2，GAPDH 抗體(1:1000)從CST公司購買。

數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)皆用SPSS17.0軟件分析，以三次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間差異用雙尾Student’s T檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。DFS和OS分析用Kaplan-Meier方法。生存數(shù)據(jù)還用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險模型分析?；贑ox回歸分析，單因素分析中p<0.05的隨后再使用多因素分析。相關(guān)性分析用線性回歸模型分析SFTA1P和LATS2或KLF2表達(dá)間的聯(lián)系。計算雙尾p值，選取a＝0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

附圖說明

圖1.SFTA1P在NSCLC組織中表達(dá)下調(diào)

1A、1B：SFTA1P在NSCLC組織表達(dá)較正常組織下調(diào)；

1C：SFTA1P在NSCLC組織表達(dá)較正常組織下調(diào)

1D：SFTA1P在人NSCLC組織(n＝60)與配對的非腫瘤組織表達(dá)水平比較；

圖2.低表達(dá)SFTA1P與病人預(yù)后差密切相關(guān)

根據(jù)SFTA1P在NSCLC組織中的表達(dá)水平，將60位NSCLC病人分為兩組：SFTA1P高表達(dá)組(n＝30)，SFTA1P低表達(dá)組(n＝30)。Kaplan-Meier生存函數(shù)用于分析兩組病人的SFTA1P表達(dá)水平與病人預(yù)后的相關(guān)性。

圖3.SFTA1P在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)水平

3A：SFTA1P在NSCLC細(xì)胞中表達(dá)較正常細(xì)胞下調(diào)

3B：NSCLC細(xì)胞中過表達(dá)SFTA1P

圖4.SFTA1P對NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲的影響

4A，4B：過表達(dá)SFTA1P能夠抑制A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力；

4C，4D：過表達(dá)SFTA1P能夠抑制PC9細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

圖5.SFTA1P對NSCLC細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響

5A，5B：過表達(dá)SFTA1P能夠抑制A549細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力；

5C：過表達(dá)SFTA1P能夠抑制A549細(xì)胞肺組織轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量

圖6.參與SFTA1P抑癌功能的潛在的靶基因

6A：TCGA NSCLC組織測序數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析，EZH2作為SFTA1P潛在的靶基因；

6B：蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，EZH2，MMP2，MMP9是SFTA1P的下游靶基因

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。

一般性說明：

實(shí)施例中末注明具體條件的的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照Sambrook，J等人編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第3版)》(MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rded.黃培堂等譯，科學(xué)出版社.2002.8)中所述的條件及方法或按照材料提供商所建議的條件及方法進(jìn)行，其它沒有詳細(xì)描述的技術(shù)相應(yīng)于本領(lǐng)域人員來說是熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。

本發(fā)明的材料：本申請中提及的細(xì)胞株、慢病毒干擾載體以及培養(yǎng)基均有商品供應(yīng)或以別的途徑能為公眾所得，它們僅作舉例，對本發(fā)明不是唯一的，可分別用其它適合的工具和生物材料來代替。

實(shí)施例1檢測SFTA1P在組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況

取0.1g組織，液氮研磨充分(成粉末狀)或1-5×10⁷細(xì)胞棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS潤洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以無酶槍頭吹打混勻，靜置5min，將裂解液移入預(yù)先標(biāo)記好的無酶1.5ml的離心管中。4℃7500g離心5分鐘，取上清加入1/5體積的氯仿，顛倒混勻30s，靜置2min。4℃，12000g離心，15min。溶液分三層(水相-白色沉淀-紅色有機(jī)物)，轉(zhuǎn)移水相層至新的1.5ml離心管中，盡量不要吸到白色沉淀。加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，放置5-10min。4℃，12000g離心，10min。吸棄上清，加入1ml 75％的乙醇(現(xiàn)配)，洗滌RNA沉淀。4℃，7500g離心，5min，棄上清。盡量去除75％的酒精，于室溫中晾干，約15min。用無RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

紫外吸收測定法測定RNA的濃度。使用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，測量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零。在260nm處讀值1為表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA純度的檢測，比值范圍在1.8到2.1表明符合要求。瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。配制1％的瓊脂糖膠。加熱溶解瓊脂糖，冷卻，加入1μl溴化乙錠(EB，10mg/ml)。搖勻后倒膠，待膠冷凝后，置于電泳槽中，浸于1×TAE緩沖液中平衡10min，待用。點(diǎn)樣。按1：4(v/v)將5×核酸電泳上樣緩沖液與樣本混合，準(zhǔn)確將各樣本含有1μg的RNA加入凝膠孔中。80V恒壓電泳50min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

Tris-乙酸(TAE)緩沖液配方(1L)50×：

實(shí)時定量PCR

NSCLC組織及癌旁組織標(biāo)本，NSCLC細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)用TaKaRa PrimeScript試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37℃15min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；85℃5sec(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))。根據(jù)Genebank提供的基因序列，設(shè)計引物序列，

QPCR應(yīng)用7300PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA樣品采用三部法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。反應(yīng)體系：

反應(yīng)條件：

結(jié)果分析：分析引物的特異性及擴(kuò)增效率，根據(jù)溶解曲線判斷引物的反應(yīng)特異性。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，采用相對量法與內(nèi)參GAPDH進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的分析。計算公式為：2^{^(-△Ct)}，△Ct＝Ct gene-Ct control。

SFTA1P的引物如下：

Primer F(SEQ ID NO：2)：

5’-CAGCATTCCAGGTGGGCTTT-3’，

Primer R(SEQ ID NO：3)：

5’-CCTTGTTTGGCTTACTCGTGC-3’。

結(jié)果表明，SFTA1P在NSCLC組織表達(dá)較正常組織下調(diào)(圖1A、1B)。利用實(shí)時定量PCR檢測了60對NSCLC組織/癌旁正常組織中SFTA1P的表達(dá)水平。結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比，SFTA1P的表達(dá)在癌組織中較正常組織表達(dá)降低(倍數(shù)>1.5，P<0.01)(圖1C)。。

實(shí)施例2下調(diào)的SFTA1P與NSCLC入侵性的腫瘤特點(diǎn)和不良預(yù)后有顯著相關(guān)

為了檢測SFTA1P表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性，NSCLC病人根據(jù)腫瘤組織中相對SFTA1P表達(dá)的中位值被分為兩組：SFTA1P相對低表達(dá)組和SFTA1P相對高表達(dá)組。顯而易見的是，NSCLC中SFTA1P低表達(dá)與TNM分期(p＝0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p＝0.019)顯著相關(guān)。然而，SFTA1P的表達(dá)與別的參數(shù)如性別(p＝0.551)和年齡(p＝0.383)等(表1)不相關(guān)。為了確定SFTA1P的表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后之間的關(guān)系，無進(jìn)展生存期(PFS)和總生存率(OS)曲線根據(jù)Kaplan-Meier分析和對數(shù)秩檢驗(yàn)中SFTA1P的表達(dá)水平而作圖(圖2)。這些結(jié)果表明低表達(dá)SFTA1P組病人三年總的生存率明顯低于高表達(dá)組病人。這些結(jié)果提示NSCLC中SFTA1P表達(dá)下調(diào)與患者的存活時間顯著相關(guān)。

實(shí)施例3過表達(dá)SFTA1P抑制NSCLC細(xì)胞侵襲和遷移

用50mg/l BD Matrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，包被好的小室放入24孔板中，孵箱中孵育2h。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1－10×104。取細(xì)胞懸液200μl加入Transwell小室。24孔板下室加入500μl含20％FBS或趨化因子的培養(yǎng)基，放入孵箱中常規(guī)培養(yǎng)12-48h。取小室用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，用0.1％結(jié)晶紫將小室外底面的細(xì)胞染色利用倒置顯微鏡對Transwell小室底膜上下室側(cè)附著的染色的細(xì)胞拍照計數(shù)。

細(xì)胞侵襲和遷移在腫瘤的發(fā)展發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。因此，我們用Transwell小室實(shí)驗(yàn)來評價SFTA1P對NSCLC細(xì)胞侵襲和遷移的影響。如圖4,所示，過表達(dá)SFTA1P能夠抑制A549和PC9細(xì)胞的侵襲和遷移能力；與對照細(xì)胞相比，侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)目是顯著減少的(圖4B和4D)。

實(shí)施例4過表達(dá)SFTA1P抑制NSCLC細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移

4周齡雌性裸鼠BALB/c小鼠，購自南京大學(xué)模式動物中心；培養(yǎng)SPC-A1細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染pCDNA-BANCR或空載體；細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時，胰酶消化，PBS洗兩遍，重新懸浮在無血清培養(yǎng)基中，并計數(shù)。2組細(xì)胞均取1×107個細(xì)胞懸浮在0.1ml無血清DMEM培養(yǎng)基中，尾靜脈注射建立實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型。注射細(xì)胞6周后處死裸鼠，取肺部組織標(biāo)本，觀察肉眼可見的轉(zhuǎn)移灶結(jié)節(jié)數(shù)目、大小，并拍照。以上所有的實(shí)驗(yàn)程序都是按著NIH1996年版的動物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)來執(zhí)行的。用全價顆粒飼料喂養(yǎng)小鼠，自由飲水，室溫(22±2)℃，濕度50～60％，通風(fēng)良好，12:12h光照/黑暗周期。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過南京醫(yī)科大學(xué)動物保護(hù)和倫理委員會(IACUC)批準(zhǔn)。

取小鼠肺組織用預(yù)冷的PBS沖洗后浸泡于4％多聚甲醛固定16h以上；組織水化：自甲醛中取出標(biāo)本，放在特制鐵筐中，并用自來水持續(xù)輕微沖淋2h；組織脫水：30％酒精中浸泡5min；50％酒精中浸泡10min；70％酒精中浸泡20min；80％酒精中浸泡30min；90％酒精中浸泡30min；95％酒精Ⅰ中浸泡30min；95％酒精Ⅱ中浸泡30min；100％酒精Ⅰ中浸泡10-20min；100％酒精Ⅱ中浸泡20-40min；(具體時間隨組織塊時期及大小而異，胚胎組織及小組織塊時間要短)。組織透明：酒精/二甲苯1:1中，浸泡30分鐘；二甲苯Ⅰ中浸泡20-30min；二甲苯Ⅱ中浸泡20-30min；石蠟/二甲苯1:1中浸泡30min；石蠟1中浸泡60min；石蠟2中浸泡60min；石蠟3中浸泡30min。石蠟包埋：將模具按需要擺放在干凈的玻璃板上，倒入融化完全的石蠟液，馬上把組織塊從石蠟3中鑷出，浸入模塊中，室溫下14h后待蠟干透。

處理載玻片，載玻片酸缸浸泡過夜、洗滌劑、去離子水依次清洗，架于鐵架上烘干晾涼待用配制明膠處理液：0.75％gelatine(明膠)，0.005％chrome ablum(硫酸鉻鉀)將架于鐵架上待處理玻片在溶液中浸泡1min，將玻片放37℃溫箱，過夜。用特制烙鐵銅片融化蠟塊一面，并將蠟液滴在蠟浸過的特制木塊表面，迅速將蠟塊粘于木塊上，將木塊固定在石蠟切片機(jī)上連續(xù)切片(5μm連續(xù)切片，用于相臨切片免疫組織化學(xué)檢測；5μm切片，用于免疫熒光組織化學(xué)檢測)；用沾水毛筆粘取需要的切片，順其卷折方向浸入盛有清水的不銹鋼盆中，蠟片即自然舒展，然后將明膠處理過的載玻片浸入水中，令舒展開的蠟片部分自然貼上，用毛筆幫助輕輕將將切片卷折處刷開，小心的鋪于玻片上；將載玻片到事先已預(yù)熱好的展片機(jī)熱水(50℃左右)中浸一下(不能久，蠟片會化)，蠟片即自然充分舒展鋪于玻片上；將載玻片放于46℃左右(不能超過50℃)的烤片機(jī)中過夜。次日收集玻片即可。

二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯5min→二甲5min→100％乙醇2min→95％乙醇2min→90％乙醇2min→85％乙醇2min→80％乙醇2min→70％乙醇2min→50％乙醇2min→30％乙醇2min→蘇木精染色5min→ddH2O沖洗5min→弱氨水5s→ddH2O 2min→30％乙醇2min→50％乙醇2min→70％乙醇2min→80％乙醇2min→85％乙醇2min→85％乙醇30min→90％乙醇2min→95％乙醇，伊紅染色10min→95％乙醇2min→100％乙醇2min→100％乙醇2min→二甲苯5min-二甲苯5min。中性樹膠封片，晾干，即可顯微鏡下觀察組織病理改變情況

為了驗(yàn)證SFTA1P是否在活體水平亦能抑制NSCLC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，我們將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SFTA1P過表達(dá)質(zhì)粒的A549尾靜脈注射免疫缺陷小鼠。8周后處死小鼠，觀察計數(shù)各個小鼠肺表面的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目并通過H&E染色確定。結(jié)果顯示，與對照組相比上調(diào)SFTA1P后能顯著抑制NSCLC細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力(圖5A，圖5B)；H&E染色結(jié)果進(jìn)一步確定SFTA1P過表達(dá)組中肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目較對照組顯著減少(圖5C)。

實(shí)施例5 EZH2可能是SFTA1P潛在的靶基因

蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)

蛋白質(zhì)的變性：樣本按1:4的體積比例加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，混勻，99℃加熱10min，-20℃保存。

蛋白電泳：將變性完成的蛋白樣品按40μg/孔，加入預(yù)先制好的變性聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)的加樣孔中；先以80V電壓恒壓使蛋白樣本經(jīng)濃縮膠壓縮，待樣品進(jìn)入分離膠后，切換成120V電壓恒壓繼續(xù)電泳45-50min，使樣本中的蛋白分離。

SDS-PAGE膠配方：

4％濃縮膠(總4ml)：

10％分離膠(總6ml)：

12.5％分離膠(8ml)：

5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(1L)：

轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后按蛋白marker根據(jù)目的蛋白的大小，將特定位置的膠條切至合適大小(切角標(biāo)記)，用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡10min。膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙(上下各兩層)和醋酸纖維素(NC)膜(剪角標(biāo)記)，轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10min。半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按照陽極碳板、濾紙、NC膜、凝膠、濾紙、陰極不銹鋼板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步均需去除氣泡，蓋上陰極不銹鋼板。接通電源，恒流1mA/cm²，根據(jù)不同蛋白分子量的大小選擇合適的轉(zhuǎn)膜時間。

1×半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液配方(1L)：

封閉：待轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將轉(zhuǎn)移了蛋白的NC膜取出，用1×TBST沖洗膜一次。隨后用1×TBST緩沖液(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,0.05％Tween-20,pH7.6)配制的5％脫脂牛奶于室溫中封閉2h，以封閉膜上非特異性蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

抗體孵育：用1×TBST緩沖液配制的5％脫脂牛奶稀釋一抗(EZH2,GAPDH，1:1000)，4℃，輕搖過夜。1×TBST緩沖液洗膜，5min×3次。分別加入1×TBST緩沖液配制的5％脫脂牛奶稀釋的抗兔或小鼠的辣根過氧化物偶聯(lián)IgG，室溫中振搖孵育2h。1×TBST緩沖液洗膜，10min×3次。

ECL檢測：避光配制ECL-plus顯色液，混勻后滴加在放置平整的塑封膜上，待反應(yīng)1min，隨即將NC膜夾入塑封膜中。在暗室中覆蓋感光膠片，根據(jù)熒光的強(qiáng)度決定曝光的時間。

TCGA NSCLC組織測序數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析，為了探索NSCLC中參與SFTA1P抑癌功能的潛在的靶基因，來自TCGA NSCLC組織測序數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析。如圖6所示，SFTA1P與EZH2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。EZH2是腫瘤侵襲和遷移過程中的重要調(diào)控基因，在人類多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、患者預(yù)后密切相關(guān)。同時蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)NSCLC細(xì)胞中上調(diào)SFTA1P的表達(dá)下調(diào)了EZH2的蛋白水平 。