本發(fā)明涉及一種軟骨素合酶突變體及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

軟骨素(chondroitin)為糖胺聚糖(GAG)的多糖家族。糖胺聚糖是一類由重復(fù)的二糖單元組成的無(wú)支鏈的、帶負(fù)電荷的多糖鏈，由于其獨(dú)特的非柔性的性質(zhì)和高的負(fù)電荷，GAG表現(xiàn)出高度延展的構(gòu)象，占用大量空間，吸收陽(yáng)離子和水并在細(xì)胞外基質(zhì)中形成多孔的凝膠，在大多數(shù)動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)的GAG幫助水合和擴(kuò)展組織，并使基質(zhì)能夠承受壓力(compressive force)。因此，糖胺聚糖組成了一類具有巨大治療應(yīng)用潛力的化合物。軟骨素一種構(gòu)為4-GlcA-β-1,3-GalNAc-β-1(GlcUA：葡糖醛酸，GalNAc：乙酰半乳糖胺)二糖單體以β-1,3鍵交替連接而成的聚多糖。硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)，是軟骨素糖鏈生成后由磺基轉(zhuǎn)移酶在GalNAc的碳4位或碳6位進(jìn)行硫酸化。根據(jù)其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)差異可分為A、B、C、D、E、F、H等多種，通常從哺乳動(dòng)物組織中提取得到的硫酸軟骨素以CS-A、CS-C為主。一般硫酸軟骨素約含有50-70個(gè)雙糖單位，分子量在10000-50000道爾頓之間。

硫酸軟骨素是一類重要的生物高分子，具有廣泛的生物活性，具有多種藥理作用與生理功能。研究發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，鎮(zhèn)痛抗炎作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞增生，誘導(dǎo)新骨形成；抗腫瘤作用，免疫調(diào)節(jié)作用，抗氧化、清除自由基和廷緩衰老的作用，還具有抗炎、抗病毒、抗過(guò)敏和加速傷口愈合的作用，如抗HIV活性。隨著對(duì)硫酸軟骨素生理功能及生化性質(zhì)的深入研究，在歐、美、日等發(fā)達(dá)國(guó)家，硫酸軟骨素作為流行的保健品長(zhǎng)期應(yīng)，用于防治冠心病、心絞痛、心肌梗塞、冠狀動(dòng)脈機(jī)能不全、心肌缺血等疾病，無(wú)明顯的毒副作用，能顯著降低冠心病患者的發(fā)病率和死亡率，也做為膳食補(bǔ)充用于保護(hù)關(guān)節(jié)。盡管CS已有很多的藥效，但小分子的CS藥效更為顯著。小分子的CS，以硫酸軟骨素為主體構(gòu)成的蛋白聚糖在軟骨基質(zhì)中起著一種“分子彈簧”的作用，具有止痛、促進(jìn)軟骨再生的功效，可從根本改善關(guān)節(jié)問(wèn)題。且低分子量的CS，無(wú)論口服或者注射用，吸收效果均優(yōu)于高分子量CS。

硫酸軟骨素主要存在于動(dòng)物的軟骨組織中，硫酸軟骨素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是采用酶法與堿法相結(jié)合等傳統(tǒng)的提取工藝，從氣管、鼻中隔、雞龍骨及鯊魚軟骨等動(dòng)物軟組織中提取硫酸軟骨素。傳統(tǒng)的提取方法造成軟骨素的收率低，成本較高，且堿解產(chǎn)生的大量工業(yè)廢水易對(duì)環(huán)境產(chǎn)生較大影響。同時(shí)，原材料的短缺和下游純化工藝的復(fù)雜程度限制了該活性成分的全球利用度，因此市場(chǎng)受限于不能滿足不斷增長(zhǎng)的需求。而且，從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，由于不斷頒布對(duì)動(dòng)物來(lái)源藥物的安全性日益嚴(yán)格的管理?xiàng)l例，動(dòng)物組織提取獲得的硫酸軟骨素可能將被限制在生藥市場(chǎng)之外。為此，采用安全有效的方法制備硫酸軟骨素已成為需要首要解決的問(wèn)題。這就迫切需求人們開始尋求新的替代途徑。

自然界中許多真菌和細(xì)菌等微生物均能合成低聚合度的硫酸軟骨素或其類似物，目前研究發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)軟骨素的微生物主要集中在巴斯德桿菌Pasteurellamultocida、大腸桿菌Escherichia coli K4。但作為工業(yè)生產(chǎn)菌株需具備：人畜安全；生長(zhǎng)迅速，發(fā)酵周期短；遺傳背景清楚；能大量合成硫酸軟骨素或其類似物等條件。由于上述菌株都存在一定的致病性及大腸桿菌產(chǎn)內(nèi)毒素及熱源物質(zhì)等，不能滿足現(xiàn)在的食品醫(yī)療安全要求。因此本發(fā)明選用枯草芽孢桿菌這一食品級(jí)基因工程菌，具備上述條件。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種軟骨素合酶突變體，所述突變體是：(a)或(b)或(c)：

(a)在SEQ ID NO.2所示序列基礎(chǔ)上，A²³⁶-P²⁴⁶區(qū)域的氨基酸序列突變?yōu)镈ILDCDMAPYA，D⁴⁶¹-D⁴⁷³區(qū)域的氨基酸序列突變?yōu)镈LEVCTSEDGSPD，I⁶⁰⁰-Y⁶⁰⁹區(qū)域的氨基酸序列由突變?yōu)镸TNAVDYDVG；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有軟骨素合酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；

(c)與(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有軟骨素合酶活性的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述軟骨素合酶突變體的基因。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含有所述基因的載體或細(xì)胞。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供獲得所述軟骨素合酶突變體的方法，所述方法對(duì)大腸桿菌K4來(lái)源的軟骨素合酶A²³⁶-P²⁴⁶，D⁴⁶¹-D⁴⁷³，G⁵¹⁶-E⁵³⁰和I⁶⁰⁰-Y⁶⁰⁹區(qū)域進(jìn)行組合突變。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法通過(guò)對(duì)大腸桿菌K4來(lái)源的軟骨素合酶的所述區(qū)域中非保守氨基酸進(jìn)行組合突變，并在枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法還包括對(duì)軟骨素產(chǎn)量提高，分子量降低的突變體的高通量篩選。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種重組表達(dá)所述軟骨素合酶突變體的基因工程菌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌以枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168為宿主，以誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA啟動(dòng)編碼軟骨素合酶突變體的基因的表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因工程菌是利用具有整合于Bacillus subtilis 168上lacA位點(diǎn)的上下游同源臂和紅霉素抗性標(biāo)記的pAX01為表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素的方法，是將重組菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)54-80h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖作為碳源。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，硫酸鉀3.9g/L，硫酸鎂1.5g/L，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0。

本發(fā)明還提供了所述突變體及含有該突變體的細(xì)胞株系在生產(chǎn)軟骨素中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌僅在基因組上整合表達(dá)SEQ ID NO.1所示合酶基因kfoC，并共表達(dá)SEQ ID NO.3所示半乳糖胺異構(gòu)酶基因kfoA。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組枯草芽孢桿菌在基因組上整合表達(dá)軟骨素合酶基因突變體庫(kù)VkfoC，并共表達(dá)半乳糖胺異構(gòu)酶基因kfoA，篩選得到1株軟骨素產(chǎn)量提高，分子量降低的突變株，其突變后合酶基因?yàn)閂kfoC1。

有益效果：本發(fā)明利用快速進(jìn)化軟骨素合酶在枯草芽孢桿菌中產(chǎn)軟骨素，具有較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。首先，本發(fā)明過(guò)程中使用的宿主為食品級(jí)，可滿足醫(yī)療衛(wèi)生和食品安全的要求，無(wú)內(nèi)毒素和病原感染的風(fēng)險(xiǎn)；其次，經(jīng)分子改造后的軟骨素合酶，合成軟骨素的產(chǎn)量有較大幅度的提高，并獲得了分子量降低的產(chǎn)物，通過(guò)3L罐放大發(fā)酵，可以獲得進(jìn)一步提高的軟骨素產(chǎn)量，3L罐上產(chǎn)物產(chǎn)量為7.25g/L，產(chǎn)物平均分子量為41.62kDa?；趹?yīng)用分析，本發(fā)明方法在工業(yè)上用于制備高產(chǎn)量、低分子的軟骨素具有潛在而廣泛的價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1所示為高通量篩選中獲得的產(chǎn)量正向突變株的軟骨素產(chǎn)量趨勢(shì)；

圖2所示為搖瓶復(fù)篩中獲得的1株產(chǎn)量提高、分子量減小的突變株B.subtilis VCH及野生菌株B.subtilis ECH的軟骨素產(chǎn)量曲線；

圖3所示為3L罐上突變株B.subtilis VCH和野生菌株B.subtilis ECH的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和軟骨素產(chǎn)量曲線。

具體實(shí)施方式

軟骨素發(fā)酵產(chǎn)物分子量檢測(cè)分析方法：采用高效體積排阻色譜-多角度激光散射進(jìn)行分析，選擇示差折光檢測(cè)器RI，使用凝膠色譜柱Ultrahydrogel Linear進(jìn)行分析。流動(dòng)相選擇0.1M硝酸鈉進(jìn)行洗脫，流速為0.5mL/min，柱子溫度設(shè)定為50攝氏度，進(jìn)樣量為20μL，每個(gè)樣品洗脫時(shí)間為20min，利用軟件進(jìn)行平均分子質(zhì)量的計(jì)算。

實(shí)施例涉及的核苷酸序列信息：

(1)SEQ ID NO.1序列信息為來(lái)源于大腸桿菌K4(E.coli O5:K4(L):H4，E.coli K4)的軟骨素合酶編碼基因kfoC編碼序列；

(2)SEQ ID NO.2序列信息為來(lái)源于大腸桿菌K4(E.coli O5:K4(L):H4，E.coli K4)的軟骨素合酶KfoC的氨基酸序列；

(3)SEQ ID NO.3序列信息為來(lái)源于大腸桿菌K4(E.coli O5:K4(L):H4，E.coli K4)的半乳糖胺異構(gòu)酶編碼基因kfoA編碼序列；

(4)SEQ ID NO.4序列信息為枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P_xylA的基因序列；

實(shí)施例1大腸桿菌K4軟骨素合酶的突變位點(diǎn)選擇及突變體庫(kù)構(gòu)建

通過(guò)將大腸桿菌K4來(lái)源的軟骨素合酶氨基酸序列與其它來(lái)源的軟骨素合酶氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，找出如下6個(gè)相對(duì)保守的基序，分別為L(zhǎng)²³⁸DCDMAP²⁴⁴，D⁴⁶¹LEVC⁴⁶⁵，D²³¹GS-D²³⁵，G⁵¹⁶QLDSDD⁵²²，P⁵²⁶DAVE⁵³⁰，N⁶⁰²AVDYD⁶⁰⁷。設(shè)計(jì)將這6個(gè)基序附近的非保守氨基酸同時(shí)進(jìn)行突變，而保守位點(diǎn)不變，即選定4段區(qū)域A²³⁶-P²⁴⁶，D⁴⁶¹-D⁴⁷³，G⁵¹⁶-E⁵³⁰和I⁶⁰⁰-Y⁶⁰⁹進(jìn)行組合突變。采用“RECODE”突變策略，設(shè)計(jì)4條簡(jiǎn)并引物，其中當(dāng)三聯(lián)密碼子同時(shí)突變時(shí)應(yīng)避免終止密碼子，比如使用“VNN；V＝A，C，G；N＝A，T，C，G”，以構(gòu)建的pAX01-kfoC-kfoA質(zhì)粒(Efficient biosynthesis of polysaccharides chondroitin and heparosanby metabolically engineered Bacillus subtilis，Carbohydrate Polymers，2016，Jinpeng)為模板，分別擴(kuò)增突變基因庫(kù)VkfoC和載體pXYKA，pXYKA包括pAX01表達(dá)載體和kfoA基因。

引物序列信息：5’-3’方向

KfoC-F0：GGATCCGAGCTCCCGCGGGCATGTCTATCTTAAATCAAGC

MC-F1：

GCTAAATACAATTACGTCGCNATNCTTGATTGTGATATGGCACCTANCNCACTGTGGGTACAGTCCTAC

MC-F2：

TACAGACTTGGAAGTGTGCANCNGTGANGATGGTTCTNCTGACGACACTTTGCGGATA

MC-F3：

CTATATNGGGCAACTGGACTCTGATGACTTNNTGGNACCTGATGCAGTCGAACTTT

MC-F4：

GAAGGATTTAATGAGTCCATNNCAAACGCCGTGGATTACGATANGNACTTAAAGCTGTCCGAGGTGKfoC-R0：ATGTAAATGCCTCCTTTTTATTACAAATCGTTTTCGATTTTCTC

pXYKA-F：TAAAAAGGAGGCATTTACAT

pXYKA-R：GCCCGCGGGAGCTCGGATCC

RECODE突變時(shí)，先將簡(jiǎn)并引物磷酸化，體系50μL：300pmol各簡(jiǎn)并引物混合物，1×T4連接液buffer，8U多聚核苷酸激酶。37℃溫育30min，75℃使酶失活10min。RECODE反應(yīng)體系50μL：0.1μM各磷酸化兼并引物和上游錨定引物KfoC-F0，0.2μM反向引物KfoC-R0，0.01pmol DNA模板，1U Phusion DNA聚合酶，5UAmpligase熱穩(wěn)定性DNA連接酶，1×優(yōu)化RECODE buffer(20mM Tris-HCl，25mM KCl，0.5mM NAD，2mM dNTPs，5mM Mg²⁺，0.1％Triton X-100，pH 8.3)，一步PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，2min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，2min；25個(gè)循環(huán)；66℃，3min；4℃，保持。PCR擴(kuò)增獲取的VkfoC基因突變體庫(kù)和載體pXYKA進(jìn)行Gibson一步組裝，體系10μL：(0.01×bp/DNA濃度)μL載體，(0.02×bp/DNA濃度)μL片段，1μL Exnase II，2μL 5×CE buffer。37℃連接30min，冰上放置5min，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，收集所有重組質(zhì)粒突變庫(kù)，轉(zhuǎn)化至B.subtilis 168細(xì)胞，以1μg/mL的紅霉素平板進(jìn)行篩選整合突變重組子，獲得重組枯草芽孢桿菌突變庫(kù)。

實(shí)施例2重組枯草芽孢桿菌突變庫(kù)的高通量篩選與搖瓶復(fù)篩

挑取上述獲得的1000個(gè)枯草芽孢桿菌突變株，單菌落接種于96淺孔板的LB培養(yǎng)基，置于200rpm 37℃過(guò)夜培養(yǎng)。按10％的接種量轉(zhuǎn)接于96深孔板的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并于發(fā)酵第2h加入終濃度2％木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)酵培養(yǎng)基為：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，硫酸鉀3.9g/L，硫酸鎂1.5g/L，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0。每個(gè)孔裝液量不超過(guò)孔體積的1/3，且使用透氣性良好的板蓋，置于200rpm 37℃培養(yǎng)48h。

對(duì)于高通量篩選得到的正向突變株，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，同時(shí)以原始株B.subtilis ECH作為對(duì)照，單克隆接種于5mL LB培養(yǎng)基，并加入2％葡萄糖和2％木糖，置于200rpm 37℃過(guò)夜培養(yǎng)。16h后按10％的接種量轉(zhuǎn)接于250ml三角瓶，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為50mL，并于發(fā)酵第2h加入終濃度2％木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為48h，并間隔取樣，取樣時(shí)間為12h，24h，36h，48h，54h。

高通量篩選及搖瓶培養(yǎng)中，軟骨素的收集與純化方法為將96孔板或搖瓶中發(fā)酵液10000×g離心5min，上清液轉(zhuǎn)移。向上清液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇充分混勻，沉淀發(fā)酵液中的軟骨素。4℃下靜置1h，再10000×g下室溫離心10min，倒掉上清，向沉淀中加入與發(fā)酵液等體積的超純水充分溶解。

搖瓶發(fā)酵過(guò)程中各取樣時(shí)間點(diǎn)的樣品的軟骨素含量采用Bitter-Muir硫酸咔唑法測(cè)定，同時(shí)96孔板中第48h發(fā)酵液中的軟骨素含量也通過(guò)Bitter-Muir硫酸咔唑法進(jìn)行批量測(cè)定，但體系按搖瓶發(fā)酵樣品的測(cè)定體系成倍縮小，反應(yīng)條件不變。搖瓶發(fā)酵樣品測(cè)定方法為，在比色管中加入1ml硼砂硫酸試劑和200μl經(jīng)一定倍數(shù)稀釋后的軟骨素樣品，混勻后在沸水中煮15min后，冷卻至室溫，再加入50μl咔唑試劑，混勻后再在沸水中煮15min，冷卻至室溫，并在530nm處測(cè)定吸光值。利用標(biāo)品硫酸軟骨素A繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算軟骨素產(chǎn)量。在96深孔板篩選的1000株枯草芽孢桿菌突變株中，相比于野生型軟骨素合酶KfoC所產(chǎn)軟骨素的產(chǎn)量約0.97g/L，有6％的突變株產(chǎn)軟骨素的產(chǎn)量明顯提高(附圖1)。

選出其中8株產(chǎn)量明顯提高的突變株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩后，淘汰其中產(chǎn)量未見(jiàn)明顯提高且分子量未見(jiàn)降低的突變株，獲得僅一株突變株B.subtilis VCH所產(chǎn)軟骨素產(chǎn)量明顯提高，且分子量減小。通過(guò)Bitter-Muir硫酸咔唑法檢測(cè)該突變株與對(duì)照株B.subtilis ECH各取樣時(shí)間點(diǎn)軟骨素的含量，并繪制產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間變化曲線。同時(shí)采用HPSEC-MALLS測(cè)定第48h軟骨素的質(zhì)量平均分子量(M_w)，數(shù)量平均分子量(M_n)和分散系數(shù)I_p。附圖2顯示原始菌B.subtilis ECH搖瓶上最高產(chǎn)量為1.83g/L，所產(chǎn)軟骨素的M_w為83.51kDa。而突變株B.subtilis VCH搖瓶上最高產(chǎn)量達(dá)到2.41g/L，為原始菌的131.7％，所產(chǎn)軟骨素的M_w為50.33kDa，比原始菌的產(chǎn)物分子量降低39.7％。

對(duì)突變株B.subtilis VCH中軟骨素合酶進(jìn)行測(cè)序，獲知設(shè)計(jì)突變的4段區(qū)域中有3段發(fā)生了突變，由原來(lái)的A²³⁶ILDCDMAPNP²⁴⁶變?yōu)镈²³⁶ILDCDMAPYA²⁴⁶；D⁴⁶¹LEVCICDDGSTD⁴⁷³變?yōu)镈⁴⁶¹LEVCTSEDGSPD⁴⁷³，I⁶⁰⁰SNAVDYDMY⁶⁰⁹變?yōu)镸⁶⁰⁰TNAVDYDVG⁶⁰⁹。由于軟骨素合酶目前尚無(wú)相關(guān)結(jié)構(gòu)分析，如酶晶體結(jié)構(gòu)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，因此對(duì)于保守區(qū)域的討論也僅停留在非理性層面，推測(cè)上述突變區(qū)域中氨基酸的改變可能造成了合酶對(duì)于底物結(jié)合能力的加強(qiáng)或催化能力提高。

實(shí)施例3產(chǎn)軟骨素枯草芽孢桿菌突變株的3L罐發(fā)酵

挑取重組枯草芽孢桿菌菌株B.subtilis VCH，單克隆接種于15mL LB培養(yǎng)基，并加入2％葡萄糖和2％木糖，置于200rpm 37℃過(guò)夜培養(yǎng)。16h后按10％的接種量轉(zhuǎn)接于500ml三角瓶，LB培養(yǎng)基裝液量為150mL，同時(shí)加入2％葡萄糖和2％木糖，繼續(xù)置于200rpm 37℃過(guò)夜培養(yǎng)作為種子液。16h后按10％的接種量轉(zhuǎn)接于3L發(fā)酵罐，裝液量為1.5L，37℃恒溫培養(yǎng)，通氣量為2vvm，通過(guò)5M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH維持在7.0。前4h攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，之后變?yōu)?00rpm。第7h待初糖耗盡開始補(bǔ)料，第7-9h補(bǔ)料為10g/L/h，第10-12h補(bǔ)料為15g/L/h，第13-24h補(bǔ)料為8g/L/h，第25h以后至發(fā)酵結(jié)束補(bǔ)料均為5g/L/h，發(fā)酵時(shí)間為80h。取樣時(shí)間為第2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h，30h，36h，42h，48h，54h，60h，70h，78h，80h。分別測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)取樣樣品的細(xì)胞密度OD₆₀₀和軟骨素產(chǎn)量，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵終點(diǎn)的產(chǎn)物分子量(M_w)。測(cè)定細(xì)胞密度時(shí)，取1ml發(fā)酵液，8000×g離心10min，除去上清，將菌體用1ml ddH₂O重懸，以ddH₂O調(diào)零，在600nm處測(cè)定細(xì)胞密度OD₆₀₀。軟骨素產(chǎn)量按照實(shí)施例2中所述實(shí)施。從附圖3中看出，菌體隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，到24h時(shí)菌體量達(dá)到最大，OD₆₀₀約為45。軟骨素產(chǎn)量呈持續(xù)增加狀態(tài)，但與菌體生長(zhǎng)非偶聯(lián)，當(dāng)菌體量恒定時(shí)，產(chǎn)量仍繼續(xù)上升，在第78h時(shí)達(dá)到最大，為7.25g/L，為原始株B.subtilis ECH產(chǎn)量的139％，此后產(chǎn)量保持穩(wěn)定，可停止發(fā)酵。對(duì)發(fā)酵結(jié)束時(shí)期第80h純化產(chǎn)物的分子量M_w進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為41.62kDa，較搖瓶上分子量低，可能因?yàn)?L罐發(fā)酵時(shí)攪拌剪切力的作用使多糖分子鏈減小。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。