本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新型金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑開(kāi)鏈吡啶羧酸衍生物及其制備方法。

背景技術(shù)：

自20世紀(jì)30年代抗生素應(yīng)用于臨床治療細(xì)菌感染以來(lái)，多種類(lèi)抗菌藥物被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于臨床，開(kāi)啟了抗感染治療的新時(shí)代。然而，隨著抗菌藥物的不合理使用和濫用導(dǎo)致細(xì)菌獲得性耐藥日益嚴(yán)重，耐藥菌的比例逐年上升，不同程度影響到抗菌藥物的臨床治療效果。在抗菌藥物篩選壓力下，可水平傳播的獲得性耐藥發(fā)展越來(lái)越快，導(dǎo)致新藥耐藥迅速，使抗菌新藥研發(fā)陷入瓶頸期。例如2000年美國(guó)輝瑞公司上市的第一個(gè)人工合成惡唑烷酮類(lèi)化合物利奈唑胺，該藥針對(duì)甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌和萬(wàn)古霉素耐藥的腸球菌表現(xiàn)良好的抗菌活性。然而僅上市一年就出現(xiàn)了利奈唑胺耐藥的陽(yáng)性球菌報(bào)道。細(xì)菌獲得性耐藥的機(jī)制主要有四種：1)對(duì)藥物結(jié)構(gòu)修飾的鈍化酶和對(duì)藥物結(jié)構(gòu)破壞的水解酶；2)藥物作用靶點(diǎn)的改變或修飾；3)菌體細(xì)胞細(xì)胞膜通透性的改變；4)主動(dòng)外排機(jī)制。其中，β-內(nèi)酰胺酶是臨床菌株中較為常見(jiàn)的一大類(lèi)水解酶，按照該酶分子結(jié)構(gòu)中氨基酸序列同源性的差異，Ambler分類(lèi)法將其分為A、B、C和D四類(lèi)，其中由于其末端氨基殘留不同又將其分為絲氨酸類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶。其中A、C和D屬于絲氨酸類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶，B類(lèi)屬于金屬β—內(nèi)酰胺酶。目前已上市的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦。其與頭孢類(lèi)抗菌藥物聯(lián)用可以提高抗菌藥物的活性。但是其都屬于絲氨酸類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，而有關(guān)金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑目前沒(méi)有任何上市藥物報(bào)道。

2014年，Gerard D.Wright等人報(bào)道了從真菌中得到的一種天然的化合物AMA，它可以快速、有效的抑制含有NDM-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性，與美羅培南聯(lián)合用藥的情況下可使產(chǎn)NDM‐1酶菌株對(duì)美羅培南恢復(fù)敏感(Nature 2014,510,503.)。2015年，Sabiha Y.Essack等人報(bào)道了兩種鋅離子螯合劑NOTA和DOTA，此兩種螯合劑可以攜帶金屬β-內(nèi)酰胺酶的菌株恢復(fù)對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的敏感性(Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2015,70,1594.)。2015年，西北大學(xué)楊科武課題組報(bào)道了一系列巰基乙酸硫酯氨基酸衍生物，其對(duì)于金屬β‐內(nèi)酰胺酶L1的IC₅₀最小可以達(dá)到18nM，但是其體外活性實(shí)驗(yàn)證明其恢復(fù)美羅培南敏感性效果并不理想(Acs Medicinal Chemistry Letters 2015,6,660.)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可以使產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶菌株恢復(fù)對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感性的非環(huán)螯合類(lèi)衍生物；另一目的在于提供其制備方法。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，技術(shù)方案如下：

具有聯(lián)合抗菌活性的氮雜環(huán)類(lèi)衍生物，該化合物結(jié)構(gòu)式如下：

合成本發(fā)明金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑1路線如下：

具體合成方法如下：

取2,6-吡啶二甲酸二甲酯于圓底燒瓶中，冰浴下加入甲醇，攪拌，分批次加入NaBH₄，接三通空氣球，TLC觀測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑減壓蒸干，加入飽和NaHCO₃溶液，除去過(guò)量的NaBH₄，經(jīng)萃取，洗滌，干燥，抽濾旋干，得化合物b。

冰浴條件下，將化合物b加入氯仿中，攪拌溶解，隨后緩慢滴加PBr₃，室溫反應(yīng)，TLC觀測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸餾除去溶劑，經(jīng)萃取，洗滌，干燥，過(guò)濾，合并有機(jī)相，得到化合物c。

將化合物d加入盛有二氯甲烷的圓底燒瓶中，攪拌均勻。滴入二氯甲烷和乙二胺的混液?；亓鞣磻?yīng)。18h后，待體系冷卻后，用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到黃白色固體，抽濾得化合物e。

將化合物e溶解于甲醇中，攪拌溶解，冰浴下，加入NaBH₄，TLC觀測(cè)。待反應(yīng)完成后，減壓蒸餾除去溶劑，經(jīng)萃取，洗滌，干燥，合并有機(jī)相，減壓蒸餾，得到亮黃色油狀物，柱層析(乙酸乙酯:甲醇＝10:1)后得到黃色油狀物為化合物f。

將化合物f溶解于乙腈溶液中，依次加入化合物c，無(wú)水碳酸鈉，保溫65℃-70℃反應(yīng)過(guò)夜，TLC觀測(cè)。待反應(yīng)完成后，將體系過(guò)濾，濾液減壓蒸餾得到黃棕色油狀物，柱層析(二氯：甲醇＝20:1)得到亮黃色油狀物化合物g。

將化合物g溶解于四氫呋喃和水溶劑中(四氫呋喃：水＝3:1)，隨后加入氫氧化鋰室溫?cái)嚢?，TLC觀測(cè)。待體系反應(yīng)完全后，減壓蒸餾除去溶劑，緩慢滴加鹽酸溶液析出類(lèi)白色固體，經(jīng)過(guò)濾，得到黃白色固體化合物1。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：該化合物在一定條件下可以將碳青霉烯類(lèi)抗生素美羅培南的的MIC(最小殺菌濃度)值降低約小于40960倍，并且毒性小，有利于新金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研發(fā)。合成方法簡(jiǎn)單可行，收率高，達(dá)44％以上。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明化合物1體外紅細(xì)胞溶血性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由圖可知，本發(fā)明化合物1在1000μg/mL時(shí)紅細(xì)胞溶血率小于3％，對(duì)紅細(xì)胞沒(méi)有明顯的損傷，由此可以證明其對(duì)于哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞損傷很小。

圖2為本發(fā)明化合物1在體外對(duì)于Hela細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由圖可知，化合物1在1000μg/mL時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率在48.71％，由此可以初步證明，在體外實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，化合物1具有較小的細(xì)胞毒性。

圖3為本發(fā)明化合物1在體外對(duì)于Hela細(xì)胞毒性的活死細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中，a–c陰性對(duì)照(不加藥組)，d–f本發(fā)明化合物1(64μg/mL)，g–i本發(fā)明化合物1(32μg/mL)，j–l陽(yáng)性對(duì)照組0.1％Triton X-100。圖中比例尺為100nm。由圖可以顯著的觀察到，本發(fā)明化合物1于64μg/mL作用于Hela細(xì)胞后，對(duì)于細(xì)胞維持正常形態(tài)的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響。

圖4為本發(fā)明化合物1在體外對(duì)于大腸埃希菌14-55的殺菌動(dòng)力學(xué)結(jié)果對(duì)比圖，圖中，a為本發(fā)明化合物1，b為NOTA，c為濁度實(shí)驗(yàn)，c-1為空白對(duì)照，c-2為本發(fā)明化合物1(0.125μg/mL)，c-3為本發(fā)明化合物1(0.25μg/mL)。由圖可知，當(dāng)本發(fā)明化合物1在4×MIC和8×MIC兩個(gè)濃度作用24h后，對(duì)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的細(xì)菌有很好的殺菌活性。與陽(yáng)性對(duì)照NOTA的活性相當(dāng)。從24h后的外觀可以清楚地看到，本發(fā)明化合物1作用后的菌液濁度很低，而空白對(duì)照組濁度明顯大。圖5為本發(fā)明化合物1和NOTA在體外與美羅培南、Zn²⁺聯(lián)用后的結(jié)果柱狀圖，由圖可知，本發(fā)明化合物1與美羅培南聯(lián)用16-18h之后幾乎可以達(dá)到100％的抑制率，但是與鋅離子聯(lián)合使用后藥物失效，說(shuō)明本發(fā)明化合物1和金屬β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)合是可逆性結(jié)合。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

合成化合物表征使用的儀器：NMR譜使用瑞典Bruker DPX-400型超導(dǎo)核磁共振儀測(cè)定，TMS為內(nèi)標(biāo)；高分辨質(zhì)譜使用Waters-Micromass公司Q-Tof質(zhì)譜儀測(cè)定。

實(shí)施例1化合物b的制備：

取2,6-吡啶二甲酸二甲酯(1.03g,5.26mmol)于圓底燒瓶中，冰浴下加入甲醇(50mL)，攪拌數(shù)分鐘，分批次加入NaBH₄(743.80mg,19.66mmol)，接三通空氣球，TLC觀測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑減壓蒸干，加入飽和NaHCO₃溶液，除去過(guò)量的NaBH₄，再用二氯甲烷萃取(3×30mL)，水反萃3次，飽和食鹽水洗2次，最后加無(wú)水MgSO₄干燥，后抽濾旋干，得白色固體(661mg)，產(chǎn)率75％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.21(d,J＝7.8Hz,1H),7.90(d,J＝7.7Hz,1H),7.74(t,J＝7.8Hz,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,1H),7.25(s,1H),4.36(s,1H),3.93(s,1H),3.88(s,3H),1.17(s,2H),0.91–0.63(m,1H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.53(s),160.28(s),146.95(s),137.66(s),123.89(d,J＝24.7Hz),64.59(s),52.83(s).

實(shí)施例2化合物c的制備:

冰浴條件下，將化合物b(500mg)加入氯仿(10mL)中，攪拌溶解，隨后緩慢滴加PBr₃(341μL，3.59mmol)，室溫反應(yīng)4-5h，TLC觀測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，加飽和K₂CO₃溶液淬滅，減壓蒸餾除去溶劑，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，水洗一次，飽和食鹽水洗2-3次，加無(wú)水MgSO₄干燥，過(guò)濾，合并有機(jī)相，減壓蒸餾除去溶劑，得到淡黃色固體680mg，產(chǎn)率98.8％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.08(t,J＝9.2Hz,1H),7.88(t,J＝7.8Hz,1H),7.70(d,J＝7.7Hz,1H),4.65(s,2H),4.02(s,3H).

實(shí)施例3化合物e的制備:

將化合物d(2mL，16.45mmol)加入盛有二氯甲烷(45mL)的圓底燒瓶中，攪拌均勻。另取一小燒杯，加入二氯甲烷(5mL)和乙二胺(659μl，9.87mmol)，攪拌混勻。然后將其逐漸滴入圓底燒瓶中，90℃回流，過(guò)夜反應(yīng)。后旋蒸得黃色油狀液體，用乙酸乙酯熱溶冷析，抽濾得2.21g黃白色固體e。

實(shí)施例4化合物f的制備:

將化合物e(1.25g，4.22mmol)溶解于甲醇(50mL)中，攪拌溶解，體系微溶，冰浴下，加入NaBH₄(207mg,5.48mmol),此時(shí)，體系逐漸由渾濁變澄清，TLC觀測(cè)。待反應(yīng)完成后，減壓蒸餾除去溶劑，加入飽和碳酸氫鈉，攪拌5min，二氯甲烷萃取(4×40mL)，水洗一次，飽和食鹽水反洗一次，無(wú)水硫酸鎂干燥，合并有機(jī)相，減壓蒸餾，得到粗品油狀物1.38g，柱層析(乙酸乙酯：甲醇＝10:1)得到亮黃色油狀物777mg，產(chǎn)率61％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.17(t,J＝8.3Hz,2H),6.81(t,J＝5.7Hz,2H),3.70(s,3H),3.65(s,2H),2.68(s,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ158.60(s),132.39(s),129.30(s),113.75(s),77.32(s),77.00(s),76.68(s),55.24(s),53.21(s),48.51(s).

實(shí)施例5化合物g的制備:

將化合物f(312mg，1.04mmol)溶解于乙腈(10mL)溶液中，依次加入化合物c(558mg，2.42mmol)，無(wú)水碳酸鈉(2.45g，23.08mmol)。保溫70℃反應(yīng)過(guò)夜，TLC觀測(cè)。待反應(yīng)完成后，將體系過(guò)濾，濾液減壓蒸餾得到粗品743mg黃色油狀物，柱層析(二氯甲烷：甲醇＝20:1)后得到亮黃色油狀物510mg，產(chǎn)率82％。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.17–7.88(m,4H),7.71–7.58(m,2H),7.49(d,J＝8.8Hz,4H),6.96–6.74(m,4H),4.50–4.37(m,4H),4.36–4.22(m,4H),3.77–3.71(m,8H),3.63(d,J＝1.3Hz,9H).實(shí)施例6化合物1的制備:

將化合物g(480mg，728.65μmol)溶解于四氫呋喃和水(26mL，體積比3:1)溶劑中，隨后加入氫氧化鋰(70mg，2.91mmol)室溫?cái)嚢鑳尚r(shí)，TLC觀測(cè)。待體系反應(yīng)完全后，減壓蒸餾除去溶劑，緩慢滴加12M鹽酸溶液，瓶壁上有類(lèi)白色固體出現(xiàn)，過(guò)濾，得到黃白色固體400mg，產(chǎn)率87.5％。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ8.15–7.93(m,1H),7.53(dd,J＝6.5,2.3Hz,1H),7.19(d,J＝8.6Hz,1H),6.69(d,J＝8.6Hz,1H),4.45(s,1H),4.18(s,1H),3.65(s,1H),3.49(s,1H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ173.98(s),152.33(s),147.62(s),139.55(s),127.17(s),124.62(s),50.51(s),43.39(s).

HR-MS(ESI)Calcd for C₃₂H₃₄N₄O₆[M+H]⁺:571.2557,found:571.2554.。

應(yīng)用例1本發(fā)明化合物體外抗菌聯(lián)合用藥活性測(cè)試：

實(shí)驗(yàn)方法微量肉湯稀釋法：

(1)抗菌藥物貯存液制備：制備抗菌藥物貯備液的濃度為5120μg/mL，溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進(jìn)行計(jì)算。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-20℃以下環(huán)境，保存期不超過(guò)6個(gè)月。

(2)待測(cè)菌的制備：用接種環(huán)挑取過(guò)夜培養(yǎng)的MH(A)培養(yǎng)皿上的單菌落于MH(B)培養(yǎng)基中，校準(zhǔn)為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含菌數(shù)1×10⁸CFU/mL，然后稀釋100倍，即得到約含菌數(shù)1.0×10⁶CFU/mL的菌液。

(3)分別將抗菌藥物(美羅培南MEM)貯備液母液(5120μg/mL)稀釋160倍，得到濃度為32μg/mL的抗菌藥物溶液。取無(wú)菌的96孔板，第一孔加入200μL的抗菌藥物，第二至十孔分別加入100μL的MH肉湯培養(yǎng)基，從第一孔吸取100μL加入第二孔，混勻，再吸取100μL至第三孔，依次類(lèi)推，第十孔吸取100μL棄去。此時(shí)各孔藥物濃度依次為：16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL，第十二孔加入200μL MH(B)培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)。

(4)然后將稀釋好的菌液分裝于EP管中，計(jì)算需要固定待測(cè)化合物的濃度(64μg/mL或32μg/mL)，將其加入菌液中，使待測(cè)化合物的終濃度為64或32μg/mL。自稀釋好美羅培南的96孔板的第1孔至第10孔分別加入菌液和待測(cè)化合物的混合溶液。將加完藥的96孔板放置37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，16-18h觀察菌液生長(zhǎng)情況，根據(jù)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)的判定標(biāo)準(zhǔn)，肉眼觀測(cè)完全不長(zhǎng)菌的那一孔為抗菌藥物的MIC。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)株做質(zhì)控。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，表2。

表1：本發(fā)明化合物1和NOTA對(duì)含有NDM的菌株的MIC(μg/mL)及其與美羅培南(MEM)聯(lián)合用藥的MIC結(jié)果

^aNOTA為1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid(1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-N,N',N”-三乙酸)，NDM為New Delhi-Metallo(新德里金屬酶)。

由表1可見(jiàn)，本發(fā)明化合物1能使所有攜帶NDM-1和NDM-4酶的菌株恢復(fù)對(duì)碳青霉烯類(lèi)美羅培南的敏感性。針對(duì)產(chǎn)NDM-4酶的大腸埃希菌14-55，化合物NOTA與美羅培南(MEM)聯(lián)用能使MEM對(duì)產(chǎn)NDM酶耐藥菌的活性提高5120倍，而本發(fā)明化合物1可以將MEM活性提高40960倍。

表2：本發(fā)明化合物1和NOTA對(duì)產(chǎn)IMP酶菌株的MIC(μg/mL)及其與美羅培南(MEM)聯(lián)合用藥的結(jié)果

IMP為IMP型金屬beta內(nèi)酰胺酶。

由表2可見(jiàn)，對(duì)臨床分離的產(chǎn)IMP酶的10株腸桿菌科細(xì)菌，本發(fā)明化合物1均可以提高產(chǎn)IMP酶耐藥株對(duì)美羅培南的敏感性。其中針對(duì)產(chǎn)IMP酶大腸埃希菌Ec-15-101，化合物NOTA可以將MEM的活性提高32倍，而化合物1可以將美羅培南的活性提高64倍。

應(yīng)用例2本發(fā)明化合物體外NDM-1酶的抑制率和IC₅₀測(cè)試：

反應(yīng)在96孔板中進(jìn)行，終體積為200μL。每個(gè)底物濃度平行設(shè)置3個(gè)副孔，分別設(shè)置不含美羅培南和不含NDM-1酶的實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。

(1)反應(yīng)體系中各物質(zhì)的終濃度分別為：NDM-1 3.5U，美羅培南125mM,10mM HEPES(PH＝7.5),待測(cè)藥物濃度為10mg/mL。

其中酶NDM-1每孔98μL與抑制劑用DMSO梯度稀釋?zhuān)節(jié)舛葟?0mg/mL二倍稀釋到0.15625mg/mL每孔2μL加入相應(yīng)孔中，使化合物終濃度為100μg/mL到1.5625μg/mL，用DMSO作為陰性對(duì)照組，每組四個(gè)平行。在30℃條件下孵育15min，再加入美羅培南100μL捶打均勻啟動(dòng)反應(yīng)。

(2)將96孔板置入酶標(biāo)儀中于，測(cè)定其相應(yīng)孔中于300nm處的吸光值；每隔60s測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定60個(gè)循環(huán)。分別計(jì)算各抑制濃度下的酶抑制率，用Graphpad Prism5分析各抑制劑的IC₅₀。

運(yùn)用上述模型監(jiān)測(cè)待測(cè)樣品酶活性的抑制率，其中陰性對(duì)照組為不含抑制劑，可以反應(yīng)體系中酶的最大活力。空白對(duì)照組為不含抑制劑也不含酶，所測(cè)得的結(jié)果為體系本底值。因此待測(cè)樣品抑制率的計(jì)算公式如下：

IR(％)＝(1-V_S/V_N)×100％

V_S代表待測(cè)樣品孔的酶反應(yīng)速率

V_N代表陰性對(duì)照孔的平均每反應(yīng)速率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3本發(fā)明化合物1對(duì)于NDM-1酶的IC₅₀和抑制率。

^a化合物濃度為10μg/mL

由表3可知，化合物1對(duì)于NDM-1的抑制活性都明顯優(yōu)于EDTA，尤其是本發(fā)明化合物1的IC₅₀可以達(dá)到0.11μM。在濃度為10μg/mL時(shí)其抑制率達(dá)到95％。

應(yīng)用例3本發(fā)明化合物體外紅細(xì)胞溶血性實(shí)驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)材料：10mLEP管，96孔板，新鮮脫脂羊血。

(2)PBS緩沖液：500mL規(guī)格，氯化鈉4g，氯化鉀100mg，二水合磷酸二氫鈉1.49g，無(wú)水磷酸二氫鉀100mg，去離子水定容至490mL，調(diào)節(jié)PH7.2-7.4之間，滅菌，用10mL滅過(guò)菌的超純水溶解900mg葡萄糖后加入PBS溶液中。

(3)5％紅細(xì)胞懸浮液的制備：新鮮的脫纖維羊血冷凍于冰箱里，配置好的PBS緩沖液放置與37℃水浴鍋中，即用即取。

取兩支10mL EP管置于試管架，將37℃1×PBS取出水浴鍋和冷藏的新鮮羊血一起噴酒精，放入超凈臺(tái)。用移液槍分別吸取5700μL的1×PBS加入兩支EP管中，再分別吸取300微升羊血，緩慢加入到PBS溶液中，蓋蓋子，上下緩慢顛倒混勻，放入離心機(jī)1500轉(zhuǎn)離心10min，取出EP管，小心吸取上清，移除上清。再重新分別加入5～7mL PBS溶液，上下緩慢顛倒混勻，放入離心1500轉(zhuǎn)離10min。如此反復(fù)操作，直至離心后上清液不再渾濁。最后一次離心過(guò)后，撇去上清液，紅細(xì)胞沉積物留置待用。

取幾支10mL EP管，放置試管架上，于每支EP管中加入5700μL的1×PBS(37℃)，然后依次加入300μL的紅細(xì)胞沉積物。上下緩慢顛倒混勻，如此，便配置好5％的紅細(xì)胞懸液。

(4)樣品溶液的配置：用少量的DMSO溶解(DMSO終濃度不能大于0.5％)，并且用相同體積的DMSO做陰性對(duì)照。溶解后的DMSO用PBS稀釋(例如，第一孔濃度為1000μg/mL，那么第一孔加入的50μL中藥物的含量就是2mg，配置成2mg/50μL的溶液)，此時(shí)這支EP管內(nèi)的藥物為初始藥物。然后平行取九支1.5mL EP管置于試管架中，分別加入200μL的PBS(編號(hào)2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)……10號(hào))。所有藥物都如此平行操作。最后，由初始藥物EP管中吸取200μL的藥品溶液加入2號(hào)EP管中，反復(fù)吹洗后吸取200μL到3號(hào)EP管中，反復(fù)吹洗……重復(fù)操作，直到10號(hào)EP管。如此，稀釋好藥物。

(5)鋪板：取96孔板，寫(xiě)好實(shí)驗(yàn)編號(hào)，藥品代碼，日期。將移液槍調(diào)至150μL，將配置好的5％紅細(xì)胞懸液上下輕緩顛倒混勻，依次吸取鋪入96孔板中(6×10)。然后將配置好的藥物對(duì)應(yīng)加入96孔板中，一個(gè)藥物三個(gè)復(fù)孔。加完后放置37℃恒溫箱內(nèi)孵育1h。

(6)后處理：將96孔板從恒溫箱內(nèi)取出，置于-4℃離心機(jī)內(nèi)離心(3500rpm，5min)。離心完畢，每塊板對(duì)應(yīng)都取一塊新的96孔板。標(biāo)注和離心后的板子對(duì)照。然后對(duì)應(yīng)地吸取100μL上清液(孔孔對(duì)應(yīng))。吸取完畢后，與酶標(biāo)儀中測(cè)取OD值，分析數(shù)據(jù)，得到HC₅₀。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖1。

應(yīng)用例4本發(fā)明化合物體外細(xì)胞毒性測(cè)試

實(shí)驗(yàn)材料：DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，96孔板，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑CCK-8，酶標(biāo)儀。

(1)培養(yǎng)基的配置：取無(wú)菌分裝瓶，F(xiàn)BS和DMEM培養(yǎng)基1:10的比例配置，于4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存待用。

(2)鋪板：將培養(yǎng)中狀態(tài)良好的Hela細(xì)胞自培養(yǎng)箱中取出，于生物安全柜中操作。倒掉上清培養(yǎng)基，用2mL PBS洗細(xì)胞一次，除去殘留的培養(yǎng)基。取1mL胰蛋白酶沿壁打入培養(yǎng)皿中，于37℃培養(yǎng)箱，體積百分比0.5％CO₂中孵育1-2min。取出消化后的培養(yǎng)皿，加入1mL培養(yǎng)基終止消化。將終止消化后的細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至10mL EP管中，800rpm 3min離心。取出EP管，緩緩倒掉上清，加入2—4mL培養(yǎng)基，反復(fù)吹打50次。從中取10μL細(xì)胞混懸液打入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，于20×顯微鏡下計(jì)數(shù)。計(jì)算好需要細(xì)胞的數(shù)目，配置為5000個(gè)/孔的細(xì)胞混懸液。每孔100μL依次加入96孔板中，于恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h。

(3)加藥：將待測(cè)藥物在4ml EP管中梯度稀釋好后，取出已貼壁生長(zhǎng)的96孔板，棄掉上清，將稀釋好的待測(cè)藥物每個(gè)濃度三個(gè)副孔，每孔200μL加入板中，操作完成后將96孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中。24h后，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑cck-8每孔7μL依次加入板中，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后于酶標(biāo)儀中，450nm波長(zhǎng)處讀取OD值，計(jì)算抑制率，回歸其IC₅₀。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖2。

應(yīng)用例5本發(fā)明化合物體外活死細(xì)胞雙染測(cè)試

(1)實(shí)驗(yàn)材料：DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，96孔板，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑CCK-8，鈣黃綠素-AM，碘化丙啶(PI),PBS緩沖液，熒光顯微鏡。

(2)培養(yǎng)基的配置：取無(wú)菌分裝瓶，F(xiàn)BS和DMEM培養(yǎng)基1:10的比例配置，于4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存待用。

(3)熒光染料的配置：將分裝好的鈣黃綠素-AM和碘化丙啶(PI)用PBS稀釋?zhuān)从眉聪♂尅?/p>

(4)鋪板：將培養(yǎng)中狀態(tài)良好的Hela細(xì)胞自培養(yǎng)箱中取出，于生物安全柜中操作。倒掉上清培養(yǎng)基，用2mL PBS洗細(xì)胞一次，除去殘留的培養(yǎng)基。取1mL胰蛋白酶沿壁打入培養(yǎng)皿中，于37℃培養(yǎng)箱，體積百分比0.5％CO₂中孵育1-2min。取出消化后的培養(yǎng)皿，加入1mL培養(yǎng)基終止消化。將終止消化后的細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至10mL EP管中，800rpm 3min離心。取出EP管，緩緩倒掉上清，加入2—4mL培養(yǎng)基，反復(fù)吹打50次。從中取10μL細(xì)胞混懸液打入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，于20×顯微鏡下計(jì)數(shù)。計(jì)算好需要細(xì)胞的數(shù)目，配置為30000個(gè)/孔的細(xì)胞混懸液。每孔1mL依次加入12孔板中，于恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h。

(5)加藥與染色：將待測(cè)藥物在4mL EP管中梯度稀釋好后，取出已貼壁生長(zhǎng)的12孔板，棄掉上清，將稀釋好的待測(cè)藥物每孔700μL加入板中，操作完成后將12孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中。24h后，取出，分別收集每個(gè)孔的上清，做好標(biāo)記，3500rpm 5min離心上清，棄掉上清收集死細(xì)胞，接著用PBS洗一次，棄掉PBS。將12孔板用PBS每孔各洗一次。用配置好的染料每孔700μL先吹打收集該孔的死細(xì)胞，然后將其混合液加入到12孔板的孔中。操作完成后，于恒溫培養(yǎng)箱孵育15min。接著，尼康熒光顯微鏡下拍照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖3。

應(yīng)用例6本發(fā)明化合物體外殺菌動(dòng)力學(xué)測(cè)試

(1)實(shí)驗(yàn)材料：MHB培養(yǎng)基，MHA培養(yǎng)基，1.5mL無(wú)菌EP管，96孔板，PBS緩沖液。

(2)培養(yǎng)基的配置：用超純水溶解一定量的MHA和MHB粉末，121℃高溫滅菌20min后，取出備用。MHA培養(yǎng)基待其冷卻至40℃左右將其倒入一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿，待至室溫凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。

(3)步驟：取兩支10mLEP管分別加入3mL的MHB培養(yǎng)基，用接種環(huán)分別挑取培養(yǎng)皿中的單克隆菌株(NDM-4菌株14-55和IMP菌株Ec-101)，于恒溫?fù)u床中，37℃250rpm過(guò)夜生長(zhǎng)。第二天，將兩支管中的菌液分別都按1:10000倍進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e稀釋14管，每管3mL的菌液，分為兩批，分別于37℃250rpm生長(zhǎng)2h和5h。待到達(dá)生長(zhǎng)時(shí)間，取出菌液，加入不同濃度MIC的抗菌藥物，此時(shí)，分別從每個(gè)樣品管里面取出100μL的樣品液，于低溫離心機(jī)內(nèi)10000g離心，棄掉上清，用1×PBS稀釋。取無(wú)菌96孔板，每孔180μL加入1×PBS。從上述用1×PBS稀釋好的菌液中取出20μL加入第一孔，然后向后倍比稀釋。從稀釋好的孔中取出10μL的樣品液滴到MHA固體培養(yǎng)基上，做好標(biāo)記，此為0h時(shí)的菌落計(jì)數(shù)。往后依照上述方法，依次對(duì)1h、2h、3h……24h等進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，繪制曲線。結(jié)果見(jiàn)附圖4。

應(yīng)用例7本發(fā)明化合物體外鋅離子聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)

(1)抗菌藥物貯存液制備：制備抗菌藥物貯備液的濃度為5120μg/mL，溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進(jìn)行計(jì)算。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-20℃以下環(huán)境，保存期不超過(guò)6個(gè)月。

(2)待測(cè)菌的制備：用接種環(huán)挑取過(guò)夜培養(yǎng)的MH(A)培養(yǎng)皿上的單菌落于MH(B)培養(yǎng)基中，校準(zhǔn)為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含菌數(shù)1×10⁸CFU/mL，然后稀釋100倍，即得到約含菌數(shù)1.0×10⁶CFU/mL的菌液。

(3)分別將抗菌藥物(美羅培南)貯備液母液(5120μg/mL)稀釋160倍，得到濃度為32μg/mL的抗菌藥物溶液。取無(wú)菌的96孔板，第一孔加入200μL的抗菌藥物，第二至十孔分別加入100μL的MH肉湯培養(yǎng)基，從第一孔吸取100μL加入第二孔，混勻，再吸取100μL至第三孔，依次類(lèi)推，第十孔吸取100μL棄去。此時(shí)各孔藥物濃度依次為：16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg/mL，第十二孔加入200mL MH(B)培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)。

(4)然后將稀釋好的菌液分裝于EP管中，計(jì)算需要固定待測(cè)化合物的濃度(64μg/mL或32μg/mL)，將其加入菌液中，使待測(cè)化合物的終濃度為64或32μg/mL，然后加入等摩爾量的ZnCl₂。自稀釋好美羅培南的96孔板的第1孔至第10孔分別加入菌液和待測(cè)化合物的混合溶液。將加完藥的96孔板放置37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，16-18h觀察菌液生長(zhǎng)情況，根據(jù)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)的判定標(biāo)準(zhǔn)，肉眼觀測(cè)完全不長(zhǎng)菌的孔為抗菌藥物的MIC。同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922做質(zhì)控。結(jié)果見(jiàn)附圖5。

由上述體外生物活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)可知，本發(fā)明化合物1具有可以使耐藥的美羅培南恢復(fù)其敏感的生物活性，最高可以把美羅培南的活性提高40960倍。體外毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紅細(xì)胞毒性顯示化合物1即使在濃度為1000μg/mL時(shí)對(duì)于紅細(xì)胞依舊沒(méi)有什么毒性。而對(duì)于體外Hela細(xì)胞的毒性顯示，化合物1對(duì)于體外細(xì)胞毒性也在其治療量MIC范圍之內(nèi)。殺菌動(dòng)力學(xué)的結(jié)果表明本發(fā)明化合物1對(duì)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的細(xì)菌具有很好的殺菌活性。NDM-1酶的抑制實(shí)驗(yàn)也證明了本發(fā)明化合物1的確可以抑制NDM-1的活性，并且對(duì)NDM-1的IC₅₀小于EDTA。鋅離子聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本發(fā)明化合物1與金屬β-內(nèi)酰胺酶的鋅離子結(jié)合導(dǎo)致酶失活。一系列的生物活性評(píng)價(jià)可以初步認(rèn)定，本發(fā)明化合物1具有潛在聯(lián)合成藥價(jià)值。