本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及石金錢龜多肽的制備方法以及石金錢龜多肽面膜。

背景技術(shù)：

石金錢龜又名黃喉擬水龜，主要分布在我國廣東，海南，廣西，福建，湖南等省區(qū)。石金錢龜為龜科擬水龜屬的爬行動物。根據(jù)現(xiàn)在的科學(xué)研究表明，石金錢龜?shù)捏w內(nèi)除了含有豐富的蛋白質(zhì)，同時還含有多種易于人體吸收的維生素、骨膠原、肽類、不飽和脂類、多種酶類、角質(zhì)、脂肪酸、血糖和一些人體必須的鈣、鉀、磷等營養(yǎng)元素，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值，

石金錢龜多肽在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、日用化工和生物工程等許多方面有廣泛的應(yīng)用，最新研究表明石金錢龜多肽屬于一種生物活性多肽，具有低毒性和抗氧化等特點，非常有利于作為面膜主要功能性原料的產(chǎn)品開發(fā)。

生物活性多肽是指對生物機(jī)體的生命活動具有一定的生理功能的氨基酸類聚合物，同時又可以稱為生物肽，其分布的分子量范圍很大，既可能是二肽，又可以是由幾百個氨基酸通過肽鍵相連而成的大分子多肽。生物活性多肽具有良好的水溶及理化性質(zhì)，以及低粘度，低發(fā)泡率和低凝膠性的特點，故具有較高的應(yīng)用價值。

由于大規(guī)模的提取分離技術(shù)工業(yè)已經(jīng)成熟，此后，市場上護(hù)膚品成分中慢慢能夠找到的天然成份從陸地到海洋，從植物到動物，各種天然成份應(yīng)有盡有。有些人甚至到人跡罕至的地方，試圖尋找到特殊的原料，創(chuàng)造護(hù)膚的奇跡，包括熱帶雨林。當(dāng)然此時的天然有很多是噱頭，可能大部分底料還是沿用礦物油時代的成分，只是偶爾添加些天然成分，因為這里面的成分混合，防腐等仍然有很多難題不易攻克，因此，護(hù)膚效果差、毒性較高，傷害消費者的健康。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出石金錢龜多肽的制備方法以及石金錢龜多肽面膜。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是，石金錢龜多肽的制備方法，包括如下步驟：取石金錢龜肉糜，按固液比為1：5～1：10的向所述石金錢龜肉糜中加入超純水，得到肉糜水；在所述肉糜水中加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過程中調(diào)節(jié)體系pH，酶解8h～12h后得到酶解液；對所述酶解液進(jìn)行滅酶操作，得到石金錢龜多肽溶液；對所述石金錢龜多肽溶液進(jìn)行離心后去除沉淀，保留濾液并進(jìn)行冷凍干燥，得到石金錢龜多肽。

進(jìn)一步地，超純水的溫度為40℃～50℃，超純水的pH為7～8。

進(jìn)一步地，酶解過程中使用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值。

進(jìn)一步地，滅酶操作為：把酶解液放入85℃的環(huán)境下滅酶10min。

進(jìn)一步地，滅酶操作為把酶解液放入85℃的環(huán)境下滅酶10min。

進(jìn)一步地，對石金錢龜多肽溶液進(jìn)行離心的操作中，離心的轉(zhuǎn)速為8000r/min。

本發(fā)明還提供了石金錢龜多肽面膜，配方包括：石金錢龜多肽、去離子水、1,3-丁二醇、透明質(zhì)酸鈉、甘油聚醚-26、淡黑巨海藻提取物、羥乙基纖維素、甘油、聚山梨醇酯-80、甘草酸二鉀、黃原膠、丙烯酸羥乙酯、羥苯甲酯。

進(jìn)一步地，石金錢龜多肽是如上任一方式制備所得。

進(jìn)一步地，配方按照質(zhì)量比例，包括：0.05～0.2份的石金錢龜多肽、60-90份的去離子水、1-4份的1,3-丁二醇、0.1-0.3份的透明質(zhì)酸鈉、1-5份的甘油聚醚-26、0.5-2份的淡黑巨海藻提取物、0.05～0.2份的羥乙基纖維素、5～20份的甘油、0.05～0.2份的聚山梨醇酯-80、0.1～1份的甘草酸二鉀、0.1～0.3份的黃原膠、0.05～0.2份的羥苯甲酯和2～5份的復(fù)合氨基酸。

本發(fā)明提取的石金錢龜多肽的平均分子質(zhì)量范圍為2000～3000，屬于小分子生物活性多肽，具有抗氧化作用，可以抵抗活性氧(ROS)，可以保護(hù)細(xì)胞免受過多的活性氧的氧化損傷，將石金錢龜多肽應(yīng)用于面膜中，可使面部皮膚吸收石金錢龜多肽的抗氧化成分，減少自由基的產(chǎn)生，護(hù)膚效果顯著，產(chǎn)生的毒性低。

附圖說明

圖1是石金錢龜多肽體外抗氧化過氧化氫自由基清除能力PSC實驗結(jié)果數(shù)據(jù)圖；

圖2是石金錢龜多肽體外抗氧化氧自由基吸收能力ORAC實驗結(jié)果數(shù)據(jù)圖；

圖3是石金錢龜多肽對H2pG2細(xì)胞的毒性實驗結(jié)果數(shù)據(jù)圖；

圖4是石金錢龜多肽采取用PBS清洗的體內(nèi)抗CAA結(jié)果數(shù)據(jù)圖；

圖5是石金錢龜多肽不使用PBS清洗的體內(nèi)抗CAA結(jié)果數(shù)據(jù)圖。

具體實施方式

以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所做的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是，一種石金錢龜多肽的制備方法，包括如下步驟：取石金錢龜肉糜，按固液比為1：5～1：10的向石金錢龜肉糜中加入超純水，得到肉糜水；在肉糜水中加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過程中調(diào)節(jié)體系pH，酶解8h～12h后得到酶解液；對酶解液進(jìn)行滅酶操作，得到石金錢龜多肽溶液；對石金錢龜多肽溶液進(jìn)行離心后去除沉淀，保留濾液并進(jìn)行冷凍干燥，得到石金錢龜多肽。

超純水的溫度為40℃～50℃，超純水的pH為7～8。

酶解過程中使用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值。

滅酶操作為：把酶解液放入85℃的環(huán)境下滅酶10min。

對石金錢龜多肽溶液進(jìn)行離心的操作中，離心的轉(zhuǎn)速為8000r/min。

用此方式所提取的石金錢龜多肽，平均分子質(zhì)量范圍為2000～3000，具有抗氧化功能，可以抵抗活性氧(ROS)，活性氧(ROS)是生物有氧代謝過程中的一種副產(chǎn)品，包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等。這些粒子相當(dāng)微小，由于存在未配對的自由電子，而十分活躍。過高的活性氧水平會對細(xì)胞和基因結(jié)構(gòu)造成損壞?；钚匝?，為含氧的，具有化學(xué)活性的分子。包括氧離子(oxygen ion)及過氧化氫(peroxide)。因為核外的未配對電子的存在，具有很強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性。ROS是正常氧代謝的副產(chǎn)物，并且在細(xì)胞信號傳導(dǎo)以及保持機(jī)體恒常性起很大作用。然而，在時間以及外界環(huán)境影響下(例暴露于紫外線(UV exposure)或熱源(heat exposure)下等)，ROS的量會急劇增多，引起這種改變的原因有可能是由于明顯的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損壞。這種現(xiàn)象被稱為氧化應(yīng)激。ROS也可能由外界的因素生成，如致電離輻射?？寡趸饔檬堑挚辜w氧化作用的過程。人體的抗氧化物質(zhì)有自身合成的，也有由食物供給的。酶和非酶抗氧化物質(zhì)在保護(hù)由于運動引起的過氧化損傷中起至關(guān)重要的作用。補(bǔ)充抗氧化物質(zhì)有利于運動機(jī)體減少自由基的產(chǎn)生或加速其清除，以對抗自由基的副作用，因而對一般人的健康都有益，可能延緩運動性疲勞發(fā)生和衰老。氧化是肌膚衰老的最大威脅，日曬、壓力、環(huán)境污染等都能讓肌膚自由基泛濫，從而產(chǎn)生面色黯淡、缺水等氧化現(xiàn)象?？寡趸饔玫淖o(hù)膚品可以防止皮膚松馳及皺紋產(chǎn)生，改善紫外線引起的皮膚色素沉淀，淡化老年斑及其它色素斑。我們每天都生活在氧氣中，離不開氧氣。但是吸入過多的氧氣，接觸過多的氧氣，會使皮膚加速衰老，損壞身內(nèi)的細(xì)胞組織。所以現(xiàn)在都在使用一些抗氧化的護(hù)膚品，蘊(yùn)含豐富的保濕精華，重塑肌膚天然修復(fù)機(jī)能，解救日間受壓的肌膚。

本發(fā)明還提供了一種石金錢龜多肽面膜，配方包括：石金錢龜多肽、去離子水、1,3-丁二醇、透明質(zhì)酸鈉、甘油聚醚-26、淡黑巨海藻提取物、羥乙基纖維素、甘油、聚山梨醇酯-80、甘草酸二鉀、黃原膠、羥苯甲酯和復(fù)合氨基酸。本石金錢龜多肽面膜將石金錢龜多肽作為主要功能性原料，并將各成分按常規(guī)方法制成面膜。

具體配方按照其質(zhì)量比例，為：0.05～0.2份的石金錢龜多肽、60-90份的去離子水、1-4份的1,3-丁二醇、0.1-0.3份的透明質(zhì)酸鈉、1-5份的甘油聚醚-26、0.5-2份的淡黑巨海藻提取物、0.05～0.2份的羥乙基纖維素、5～20份的甘油、0.05～0.2份的聚山梨醇酯-80、0.1～1份的甘草酸二鉀、0.1～0.3份的黃原膠、0.05～0.2份的羥苯甲酯、2～5份的復(fù)合氨基酸。

1,3-丁二醇是多元醇的一種，在化妝品中常做保濕劑和溶劑使用，在保濕方面，由于丁二醇是小分子保濕成份，所以抓水比例很小，同時也有一定的抑菌作用。

透明質(zhì)酸鈉(SODIUM HYALURONATE)為從雞冠中提取的物質(zhì)，也可通過乳酸球菌發(fā)酵制得，為白色或類白色顆粒或粉末，無臭味，干燥時，氮含量為2.8％-4.0％，葡糖醛酸含量為37.0％-51.0％。在化妝品領(lǐng)域中使用較多，有保濕作用。

甘油聚醚-26是由甘油和環(huán)氧乙烷聚合而得，屬于非離子表面活性劑-多元醇聚氧乙烯醚，作為化妝品的保濕劑、散播劑，屬于國際上化妝品原料的一種。

淡黑巨海藻提取物，淡黑巨海藻是褐藻綱、海帶目的藻類，淡黑巨海藻中含有美白、淡化黑頭的成分。是國家食品藥品監(jiān)督管理總局11號文件發(fā)布的已使用化妝品原料。

羥乙基纖維素，羥乙基纖維素(HEC)是一種白色或淡黃色，無味、無毒的纖維狀或粉末狀固體，由堿性纖維素和環(huán)氧乙烷(或氯乙醇)經(jīng)醚化反應(yīng)制備，屬非離子型可溶纖維素醚類。由于HEC具有良好的增稠、懸浮、分散、乳化、粘合、成膜、保護(hù)水分和提供保護(hù)膠體等特性，被廣泛用于化妝品中。

聚山梨醇酯-80，為非離子型表面活性劑，藥用輔料，增溶劑和乳化劑等。

甘草酸二鉀，為白色或類白色細(xì)粉末，純度達(dá)98％，有特殊甜味，水溶好、口感純。甘草酸二鉀具有抑菌、消炎、解毒、抗敏、除臭等多種功效。在醫(yī)藥、化妝品日化、食品等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用。

黃原膠，是由糖類經(jīng)黃單胞桿菌發(fā)醉，產(chǎn)生的胞外微生物多塘。由于它的大分子特殊結(jié)構(gòu)和膠體特性，而具有多種功能，可作為乳化劑、穩(wěn)定劑、凝膠增稠劑、浸潤劑、膜成型劑等。

羥苯甲酯，又稱對羥基苯甲酸甲酯。Methylparaben。羥苯甲酯，白色結(jié)晶粉末或無色結(jié)晶，易溶于醇，醚和丙酮，極微溶于水，沸點270-280℃。主要用作有機(jī)合成、食品、化妝品、醫(yī)藥的殺菌防腐劑。

復(fù)合氨基酸為：含甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸、天門冬氨酸等多種氨基酸混合，可根據(jù)需求調(diào)節(jié)各成分的比例或者刪除其中的一種或者多種。

為了增加面膜的粘稠度，可適度增加丙烯酸羥乙酯，質(zhì)量比例范圍為0.01～6份；為了增加面膜的香氣，可適量添加香精，質(zhì)量比例范圍為0.01～0.2份。

實施例1：

取10g石金錢龜肉糜，加入溫度為40℃、pH為7的超純水50ml，加入中性蛋白酶，在酶解過程中用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，水解8h后，置于85℃的環(huán)境下滅酶10min，再使用8000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，再除去沉淀，冷凍干燥得到石金錢龜多肽。

實施例2

取10g石金錢龜肉糜，加入溫度為50℃、pH為8的超純水100ml，加入中性蛋白酶，在酶解過程中用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，水解10h后，置于85℃環(huán)境下滅酶10min，使用8000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，除去沉淀，冷凍干燥得到石金錢龜多肽。

實施例3

取10g石金錢龜肉糜，加入溫度為45℃、pH為7.5的超純水80ml，加入中性蛋白酶，在酶解過程中用NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，水解9h后，置于85℃環(huán)境下滅酶10min，使用8000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，除去沉淀，冷凍干燥得到石金錢龜多肽。

實施例4

石金錢龜多肽的抗氧化效果研究。

將所得石金錢龜多肽用純水配置為1mg/mL的水溶液，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將石金錢龜多肽稀釋成不同濃度(起始濃度為1g/ml)。

將中石金錢龜多肽稀釋成不同濃度(起始濃度為4.8mg/ml)，采用過氧化氫自由基清除能力PSC的方法測體外抗氧化能力。

石金錢龜多肽的過氧化氫自由基清除能力的測定方法是在Adom等提出的方案(Wang,H.；Cao,G.H.；Prior,R.L.,Oxygen radical absorbing 395 capacity of anthocyanins.Journal of Agricultural and Food Chemistry 1997,45,304-309.)的基礎(chǔ)上做出了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。實驗反應(yīng)體系除說明外，均采用75mmol/L的KH₂PO₄-K₂HPO₄(pH＝7.4)的緩沖液。實驗中所用的DCFH-DA、抗壞血酸、ABAP溶液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。石金錢龜多肽樣品用上述的磷酸緩沖液進(jìn)行稀釋后使用96孔板進(jìn)行測定，每孔加入100μL石金錢龜多肽稀釋液和100μL DCFH-DA后加入50μL 200mmol/L ABAP。DCFH-DA工作液在測定前配制，具體方法是1340μL 2.48mM DCFH-DA加入160μL 1mM KOH充分混合，并在暗處反應(yīng)5min，然后用75mM的磷酸鹽緩沖液定容到12mL。反應(yīng)過程在預(yù)熱至37℃的熒光酶標(biāo)儀內(nèi)進(jìn)行，設(shè)定酶標(biāo)儀激發(fā)波長在485nm處，吸收波長在538nm處，反應(yīng)在40min內(nèi)完成。

抗氧化能力計算方程如下：

PSC unit＝1-(SA/CA)

方程式中CA為空白對照的熒光積累量，SA是樣品或是標(biāo)準(zhǔn)品的熒光積累量。以PSC值表示樣品的抗氧化值，單位用每克樣品干重等同于抗壞血酸當(dāng)量的微摩爾數(shù)來表示(μmol vit.C equi./g,DW).

過氧化氫自由基清除能力PSC的方法測體外抗氧化能力的結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，石金錢龜多肽對于過氧化氫自由基清除能力有顯著的作用。

實施例5

將石金錢龜多肽稀釋成不同濃度(起始濃度為1000μg/mL)，采用氧自由基吸收能力ORAC測體外抗氧化能力。樣品用修改后的ORAC法(Adom,K.K.；Liu,R.H.,Rapid peroxyl radical scavenging capacity(PSC)assay for assessing both hydrophilic and lipophilic antioxidants.Journal of agricultural and food chemistry 2005,53,6572-80)進(jìn)行測定。反應(yīng)體系采用75mmol/L的KH2PO4-K2HPO4(pH＝7.4)的緩沖液，實驗所用到的標(biāo)準(zhǔn)品Trolox，ABAP以及fluorescein(熒光素底物)均為現(xiàn)配現(xiàn)用。樣品提前用緩沖液配制到適當(dāng)?shù)臐舛?，相?yīng)的每個孔中加入20μL樣品或是Trolox標(biāo)準(zhǔn)品(濃度梯度在6.25-50μM之間)，在熒光酶標(biāo)儀中37℃孵育10min后，各孔使用多軌道移液器加入200μL、0.96μM的熒光素，在相同條件下孵育20min后，除熒光對照孔外，各孔迅速加入119mM的ABAP 20μL,并在熒光酶標(biāo)儀中監(jiān)測反應(yīng)。酶標(biāo)儀設(shè)定參數(shù)為：37℃；激發(fā)波長485nm，測定波長520nm；每5min記錄一次，共計35次。所用樣品共進(jìn)行三次平行試驗。ORAC值以每克樣品(干重)所含的Trolox當(dāng)量的微摩爾數(shù)表示(μmol Trolox equiv./g,DW)，石金錢龜多肽體外抗氧化氧自由基吸收ORAC的結(jié)果測試如圖2所示。

由圖2可以看出，Control是石金錢龜多肽體外抗氧化氧自由基吸收能力ORAC的結(jié)果，圖中表明，石金錢龜多肽對于體外抗氧化氧自由基吸收能力好，持續(xù)時間長。

實施例6

采用亞甲基藍(lán)染色的方法(Yang,J.；Liu,R.H.,Synergistic Effect of Apple Extracts and Quercetin 3-beta-D-Glucoside Combination on Antiproliferative Activity in MCF-7 Human Breast Cancer Cells in Vitro.Journal of Agricultural and Food Chemistry 2009,57,8581-8586.)進(jìn)行檢測石金錢龜多肽的毒性。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以4×104的密度鋪96孔板，每孔10 0μL，待貼壁24h后，取稀釋好的一系列濃度的石金錢龜多肽對應(yīng)加到每個孔中，待藥物處理24h后，按照文獻(xiàn)的方法，每孔加入亞甲基藍(lán)50μL孵育1h后，用水洗凈后，加入Elution solution溶解后，使用酶標(biāo)儀檢測570nm波長下的吸收值，檢測石金錢龜多肽的毒性。石金錢龜多肽對HepG2細(xì)胞的毒性結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，1mg/ml濃度以下的石金錢龜多肽對HepG2細(xì)胞并無毒性，超過1mg/ml以上的高濃度則對HepG2細(xì)胞有毒性作用。

實施例7

石金錢龜多肽體內(nèi)抗氧化CAA研究

采用Wolfe等的方法(Wolfe,K.L.；Liu,R.H.,Cellular antioxidant activity(CAA)assay for assessing antioxidants,foods,and dietary supplements.Journal of agricultural and food chemistry 2007,55,8896-907.)進(jìn)行吸收水平抗氧化效果的檢測。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以4×104的密度鋪96孔板，每孔100μL，待貼壁24h后，取含DCFH-DA染料的稀釋好的一系列濃度的石金錢龜多肽對應(yīng)加到每個孔中，放置在37℃培養(yǎng)箱中孵育1h后，去除培養(yǎng)基，根據(jù)實驗方法采取用PBS清洗和不用PBS清洗后，每孔并迅速加入100μL 600mM ABAP，除空白孔，并在熒光酶標(biāo)儀中監(jiān)測反應(yīng)。酶標(biāo)儀設(shè)定參數(shù)為：37℃；激發(fā)波長485nm，測定波長520nm；每5min記錄一次，共計1h。按照以下公式進(jìn)行計算細(xì)胞水平抗氧化效果。

CAA unit＝100-(∫SA/∫CA)×100

∫SA代表樣品對應(yīng)的熒光值，∫CA代表空白組對應(yīng)的熒光值。

實驗結(jié)果如圖4和圖5所示，圖4為使用了PBS清洗的結(jié)果，圖5為不使用PBS清洗的結(jié)果。

由圖4和圖5可以看出，石金錢龜多肽體內(nèi)抗氧化CAA具有一定的效果，且經(jīng)過PBS清洗的效果比不經(jīng)過PBS清洗的效果好。

實施例8

石金錢龜多肽面膜，按其質(zhì)量比例，其配方為：0.05份的石金錢龜多肽、1份的1,3-丁二醇、0.1份的透明質(zhì)酸鈉、1份的甘油聚醚-26、0.5的淡黑巨海藻提取物、0.05的羥乙基纖維素、5份的甘油、0.05份的聚山梨醇酯-80、0.1份的甘草酸二鉀、0.1份的黃原膠、0.05份的羥苯甲酯、2份的復(fù)合氨基酸、1份丙烯酸羥乙酯的和90份的去離子水。

實施例9

石金錢龜多肽面膜，按其質(zhì)量比例，其配方為：0.2份的石金錢龜多肽、4份的1,3-丁二醇、0.3份的透明質(zhì)酸鈉、5份的甘油聚醚-26、2份的淡黑巨海藻提取物、0.2份的羥乙基纖維素、20份的甘油、0.2份的聚山梨醇酯-80、1份的甘草酸二鉀、0.3份的黃原膠、0.2份的羥苯甲酯、5份的復(fù)合氨基酸、0.1份的香精、1.5份丙烯酸羥乙酯的60份的去離子水。

實施例10

石金錢龜多肽面膜，按其質(zhì)量比例，其配方為：0.1份的石金錢龜多肽、60-90份的去離子水、3份的1,3-丁二醇、0.2份的透明質(zhì)酸鈉、3份的甘油聚醚-26、1份的淡黑巨海藻提取物、0.1份的羥乙基纖維素、10份的甘油、0.1份的聚山梨醇酯-80、0.5份的甘草酸二鉀、0.2份的黃原膠、0.1份的羥苯甲酯、4份的復(fù)合氨基酸、0.2份的香精和77.5份的去離子水。