本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及基于乳糖的智能聚合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)糖基化是一種非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，真核細(xì)胞中約有一半的蛋白質(zhì)發(fā)生過糖基化。蛋白質(zhì)糖基化不僅賦予蛋白質(zhì)特定的理化性質(zhì)，更重要的是參與凝血、免疫、細(xì)胞生長(zhǎng)、分泌和信號(hào)傳導(dǎo)等關(guān)鍵的生理活動(dòng)。因此，對(duì)糖蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確分析和解析非常重要。然而糖鏈非常復(fù)雜且具有微觀不均一性，其分析和結(jié)構(gòu)解析一直是糖生物學(xué)研究的瓶頸。而且糖肽豐度很低，極易受到高豐度非糖肽的干擾。[Ongay,S.；Boichenko,A.；Govorukhina,N.；Bischoff,R.J.Sep.Sci.2012,35,2341-2372.]

目前主流的分析方法是將大的糖蛋白結(jié)構(gòu)酶解成若干小的糖肽片段進(jìn)行分析，在操作中，首先需要將糖肽與非糖肽進(jìn)行分離，之后需要對(duì)具有不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖肽進(jìn)行分離。目前已有多種材料能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)糖肽的選擇性富集，即滿足前一個(gè)操作要求。然而對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)精確區(qū)分和色譜分離仍然是一個(gè)巨大的難題。解決這一問題，可以極大地降低糖肽樣品的復(fù)雜性，提高對(duì)目標(biāo)糖肽鏈的富集能力，這對(duì)于內(nèi)分泌疾病和癌癥生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)、鑒定、分析和應(yīng)用至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于乳糖的智能聚合物及其應(yīng)用。該智能聚合物修飾到不同的基質(zhì)材料表面后對(duì)唾液酸具有顯著的響應(yīng)性，并且能夠通過不同的溶劑梯度，分離含有不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖肽，特別是唾液酸糖肽。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的方案為：

基于乳糖的智能聚合物，其是由乳糖功能單體上的醛基通過席夫堿縮合反應(yīng)接枝到多氨基類聚合物的主鏈上所得，所述乳糖功能單體的結(jié)構(gòu)式如下：

所述多氨基類聚合物包括聚丙烯酰胺、聚乙烯亞胺、聚天冬酰胺、聚酰胺、聚甲基丙烯酸氨基乙酯、聚酰胺-胺或者聚甲基丙烯酸氨基丙酯中的一種或兩種以上的混合。

上述方案中，所述乳糖功能單體按如下過程進(jìn)行制備：

1)在反應(yīng)容器內(nèi)加入50-250mL的乙酸酐溶液中加入0.5-3ml的高氯酸，緩慢加入所需乳糖10-80g，攪拌后置于冰浴中，依次加入5-20g紅磷，10-30mL溴，10-20mL水，之后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2-6h，所得混合物過濾、干燥及洗滌，萃取液合并旋干后得到乳糖一號(hào)位羥基溴取代產(chǎn)物；

2)在反應(yīng)容器中加入上述產(chǎn)物10-40g，用三氯甲烷溶解，之后加入50-200mL飽和的碳酸鈉溶液，加入0.5-10g四丁基碘化銨，1-10g對(duì)羥基苯甲醛，30-70攝氏度反應(yīng)4-24h，之后去除水層，干燥后過濾得到的有機(jī)混合物用柱色譜層析法分離提純之后得到一號(hào)位接有對(duì)羥基苯甲醛其它羥基被乙酰基保護(hù)的產(chǎn)物；

3)于反應(yīng)容器中加入1-10g上述產(chǎn)物，加入10-50mL甲醇，加入0.1-1g的甲醇鈉，反應(yīng)1-24h后，產(chǎn)物用柱色譜層析法分離純化，最后得到所述乳糖功能單體。

上述方案中，所述多氨基類聚合物為聚丙烯酰胺，該聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物的合成方法如下：

其中x:0.01～0.7。

上述方案中，將上述基于乳糖的智能聚合物修飾到無機(jī)基質(zhì)材料表面即得到所述基于乳糖的智能聚合物薄膜材料，所述無機(jī)基質(zhì)材料包括半導(dǎo)體Si、金屬或氧化物；所述金屬為Au、Ag、Cu、Al或Pt；所述氧化物為CuO、Al₂O₃、Fe₃O₄、TiO₂或SiO₂。

基于乳糖的智能聚合物薄膜材料在唾液酸識(shí)別中的應(yīng)用。

基于乳糖的智能聚合物色譜分離材料，將上述基于乳糖的智能聚合物修飾到多孔基質(zhì)材料上即得到所述基于乳糖的智能聚合物色譜分離材料，所述多孔基質(zhì)材料包括多孔半導(dǎo)體Si、多孔金屬或多孔氧化物；所述多孔金屬為Au、Ag、Cu、Al或Pt；所述多孔氧化物為CuO、Al₂O₃、Fe₃O₄、或SiO₂，所述多孔基質(zhì)材料的粒徑是50nm-50μm，孔徑分布范圍為

基于乳糖的智能聚合物色譜分離材料在色譜分離中的應(yīng)用，其特征在于，在固相萃取模式下，將糖蛋白酶解物負(fù)載到由所述基于乳糖的智能聚合物色譜分離材料填充的固相萃取柱上，采用梯度淋洗液洗脫的方法，從高體積濃度的乙腈/水溶液逐漸轉(zhuǎn)換到低體積濃度的乙腈/水溶液，可以分離得到含有不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖肽。

上述方案中，糖蛋白酶解物與基于乳糖的智能聚合物色譜分離材料的質(zhì)量比為1:5-1:200。

上述方案中，分離溫度為10-60℃。

上述方案中，所述高體積濃度的乙腈/水溶液中乙腈與水的體積比為90/10，所述低體積濃度的乙腈/水溶液中乙腈與水的體積比為10/90。

上述方案中，基于乳糖的智能聚合物薄膜材料或智能聚合物色譜分離材料的制備方法如下：

1)在反應(yīng)容器中依次加入0.1-10g多氨基類聚合物，0.1g-10g的乳糖單體，同時(shí)加1-10mL H₂O以及1-15mL甲醇作溶劑，20-60℃攪拌反應(yīng)1-48小時(shí)。反應(yīng)所得產(chǎn)物裝于透析袋中用體積含量1-99％甲醇和水的混合溶液中透析1-7天，之后將透析袋中的溶液冷凍干燥后得白色固體為基于乳糖的智能聚合物；

2)3-(三乙氧基硅烷)丙基異硫氰酸酯與基質(zhì)材料中的一種或二種以上于甲苯中反應(yīng)得到帶有異硫氰酸基團(tuán)的基質(zhì)材料；3-(三乙氧基硅烷)丙基異硫氰酸酯與基質(zhì)材料的用量的質(zhì)量比例為1:5-1：300，于甲苯溶液中回流反應(yīng)1-6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，依次用甲醇、水洗滌3-(三乙氧基硅烷)丙基異硫氰酸酯修飾的基質(zhì)材料，干燥后將得到的材料置于真空干燥器中備用。

其中3-(三乙氧基硅烷)丙基異硫氰酸酯的合成步驟：在反應(yīng)容器中加入5-30mL四氫呋喃，1-10mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，滴入1-5mL的二硫化碳攪拌1-3小時(shí)，隨后加入1-6g雙氰胺和0.1-1mL的三乙胺，攪拌反應(yīng)時(shí)間1-8小時(shí)，減壓蒸餾得到3-異硫氰酸丙基-三甲氧基硅氧烷。

3)將接有3-異硫氰酸基團(tuán)的基質(zhì)材料0.1-5g浸入含有上述基于乳糖的智能聚合物(0.1-10g)的水溶液10-50mL中；將反應(yīng)溫度控制在20-60℃靜止反應(yīng)2-24小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后用甲醇、水依次洗滌聚合物接枝的基質(zhì)材料，干燥后得到乳糖的智能聚合物材料，包括基于乳糖的智能聚合物薄膜材料或智能聚合物色譜分離材料，置于真空干燥器中備用。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明開發(fā)了基于乳糖的智能聚合物薄膜材料，能夠?qū)ν僖核徇M(jìn)行高選擇性識(shí)別和檢測(cè)，并更進(jìn)一步發(fā)明了乳糖的智能聚合物色譜分離材料能夠分離具有不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖肽，特別是唾液酸糖肽，分離效率高。

附圖說明

圖1為乳糖功能單體對(duì)多種不同單糖的結(jié)合力示意圖。

圖2為基于乳糖的智能聚合物薄膜材料的初始的表面形貌圖(插圖顯示的是表面接觸角)。

圖3為基于乳糖的智能聚合物薄膜材料浸泡過濃度為0.02mol·L^-1的唾液酸溶液后的表面形貌圖。

圖4為基于乳糖的智能聚合物薄膜材料的初始的楊氏模量圖(其中插圖顯示的是模量分布的直方圖)。

圖5為基于乳糖的智能聚合物薄膜材料浸泡過濃度為0.02mol·L^-1的唾液酸溶液后的楊式模量圖。

圖6為基于乳糖的智能聚合物色譜分離材料在固相萃取模式下，對(duì)胎球蛋白和牛血清蛋白(質(zhì)量比為1:100)混合物的酶解產(chǎn)物進(jìn)行富集后的MALDI-TOF質(zhì)譜圖。

圖7為基于乳糖的智能聚合物色譜分離材料在固相萃取模式下，對(duì)胎球蛋白和牛血清蛋白(質(zhì)量比為1:300)混合物的酶解產(chǎn)物進(jìn)行富集后的MALDI-TOF質(zhì)譜圖。

圖8為通過改變乙腈/水混合溶液的極性，分步將含有不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖肽進(jìn)行分離的示意圖。

其中(A,B)O-型唾液酸糖肽，(C)N-型唾液酸糖肽的分離。(A,B)中肽段的序列Pep.1:VTCTLFQPVIPQPQPDGAEAEAPS(271)AVPDAAGPTPSAAGPPVASV VVGPSVVAVPLPL HR；(C)中肽段的序列Pep.2:VVHAVEVALATFNAESN(176)GSYLQLVEISR.糖結(jié)構(gòu):實(shí)心方格:GlcNAc；實(shí)心圓圈:mannose；空心圓圈:galactose；實(shí)心菱形:Neu5Ac。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的內(nèi)容、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例和附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而本發(fā)明不僅限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例中所用原料及設(shè)備:

硅片由Silicon Materials Corporation(Germany)購得，HPLC柱色譜填料硅膠由上海月旭公司購得。以聚丙烯酰胺溶液(重均分子量：10000)為例，由Sigma-Aldrich公司購得。乳糖,甲醇，對(duì)羥基苯甲醛，溴化氫等由Alfa公司購得。其他試劑均使用市售分析純。¹H spectra在Bruker ARX300spectrometer檢測(cè)獲得。

實(shí)施例1

乳糖功能單體的合成

1)在反應(yīng)容器內(nèi)加入200mL的乙酸酐溶液加入1mL的高氯酸，緩慢加入所需乳糖20g，攪拌30min后，置于冰浴中，依次加入6g紅磷，20mL溴，14mL水，之后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h。所得混合物經(jīng)過過濾，干燥之后，用50％石油醚/乙醚混合溶劑洗滌三次，減壓蒸餾旋干后得到一號(hào)位溴基取代，其它羥基被乙?；Ｗo(hù)的乳糖的衍生物；

2)在干凈的反應(yīng)容器中加入上述產(chǎn)物20g，用150mL三氯甲烷溶解，之后加入150mL飽和的碳酸鈉溶液，加入5g四丁基碘化銨，8g對(duì)羥基苯甲醛，60攝氏度反應(yīng)12h，之后除水層，干燥后的混合物使用柱色譜層析法分離提純的一號(hào)位接有對(duì)羥基苯甲醛其它羥基被乙?；Ｗo(hù)乳糖衍生物；

3)在反應(yīng)容器中加入5g上述產(chǎn)物，加入50mL甲醇，加入1g的甲醇鈉，反應(yīng)4h后，產(chǎn)物使用柱層析法提純，最后得乳糖單體。

實(shí)施例2

聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物的合成

乳糖聚合物中，x:0.01～0.7；

以x＝0.2為例，

在反應(yīng)容器中依次加入1g聚丙烯酰胺，0.2g的乳糖單體，同時(shí)加入10mL H₂O以及15mL甲醇作溶劑，40℃攪拌12小時(shí)，得到的產(chǎn)物裝于透析袋中用體積含量50％甲醇和水的混合溶液中透析3天后冷凍干燥后得聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物白色固體。

聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物的表征數(shù)據(jù)¹H NMR(500MHz,D2O):δ(ppm):1.62(m,80H,C-CH₂),2.19(d,40H,C-CH),3.36-3.96(m,11H,CH-OH and CH₂-OH),4.41(t,J＝3.0Hz,1H,CH-OH),5.11(d,J＝7.9Hz,1H,O-CH-O),5.24(d,J＝7.8Hz,1H,O-CH-O),7.21(d,J＝8.9Hz,2H,Ph-H),7.89(d,J＝8.8Hz,2H,Ph-H),9.76(s,1H,CH＝N).IR(cm-1):3335,3186,2931,2885,1654,1606,1562,1449,1403,1346,1320,1184,1118,1076,1043.

實(shí)施例3

聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物柱色譜分離材料的制備，包括如下步驟：

1)在50mL的圓底燒瓶中加入10g多孔硅膠與30mL的5wt％HCl混合，常溫?cái)嚢?8h。抽濾得到大量白色固體粉末，分多次用30mL超純水洗滌；真空干燥后得到羥基化修飾的硅膠產(chǎn)品；

2)將3-氨基丙基三乙氧基硅烷30mmol溶解在20mL的四氫呋喃中，再緩慢滴入二硫化碳，在冰浴中攪拌反應(yīng)3h。隨后恢復(fù)常溫，加入3.8g雙氰胺，緊接著加入3滴三乙胺，20mL四氫呋喃，該混合物加熱到40℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)3h。該溶液減壓蒸餾得到3-(三乙氧基硅烷)丙基異硫氰酸酯；

3)將步驟2)得到的3-(三乙氧基硅烷)丙基異硫氰酸酯與步驟1)得到的羥基化修飾的硅膠加入到甲苯中，隨后加入2mL三乙胺常溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，可得到由3-(三乙氧基硅烷)丙基異硫氰酸酯修飾的硅膠；

4)將該硅膠加入上述實(shí)施例2中得到的基于乳糖的智能聚合物水溶液中隨后加入2mL三乙胺常溫?cái)嚢?4h就可得基于乳糖的智能聚合物修飾的硅膠色譜材料。使用相同的方法可以制備不同顆粒尺寸(包括硅膠粒徑，孔徑)、基于乳糖的智能聚合物接枝的硅膠樣品，用作色譜分離材料。硅膠粒徑是50nm-50μm，孔徑分布范圍為

實(shí)施例4

聚丙烯酰胺接枝乳糖的智能聚合物薄膜材料的制備

將接有異硫氰酸基團(tuán)的Si、SiO₂、Au、Ag、Pt、CuO、Al₂O₃、TiO₂、ZrO₂或Fe₃O₄等基質(zhì)材料浸入含有上述實(shí)施例2中得到的基于乳糖的智能聚合物的水溶液中；將燒瓶的溫度控制在60℃靜置反應(yīng)4-6小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后用甲醇，H₂O依次洗滌聚合物接枝表面，此聚合物表面的厚度為10-50nm，氮?dú)獯蹈杀砻婧笾糜谡婵崭稍锲髦袀溆?。使用相同的方法聚合得到不同比例的基于乳糖的智能聚合物薄膜材料?/p>

實(shí)施例5

采用熒光滴定的方法測(cè)定了乳糖功能單體對(duì)多種不同單糖的結(jié)合力。圖1展示了在pH＝7.4與3.8溶液條件下，測(cè)得乳糖功能單體與其它糖之間的結(jié)合常數(shù)。從圖1中可以看到乳糖功能單體對(duì)不同類型的單糖體現(xiàn)出優(yōu)異的區(qū)分能力，對(duì)唾液酸的結(jié)合能力顯著高于其他種類的單糖。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在微酸性(pH＝3.8)溶液中對(duì)唾液酸的結(jié)合力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在中性溶液(pH＝7.4)中的結(jié)合力，為唾液酸糖肽的選擇性富集和分離奠定了基礎(chǔ)。

將實(shí)施例4制備好的于平整基質(zhì)上接枝的基于乳糖的智能聚合物得到的薄膜材料，浸泡于唾液酸溶液中。之后通過接觸角儀和原子力顯微鏡及其力學(xué)模式觀察浸泡唾液酸溶液前后的基于乳糖的智能聚合物薄膜材料表面的變化?？梢悦黠@的觀察到基于乳糖的智能聚合物薄膜材料原接觸角為78°，泡完唾液酸之后變?yōu)榱?4°，并且聚合物薄膜表面形貌發(fā)生了明顯變化，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)薄膜的軟硬也變化明顯，從楊氏模量270±66MPa變化到110±23MPa。然而乳糖智能薄膜泡過其它糖溶液之后表面都沒有發(fā)生大的變化。如圖2-5所示，說明基于乳糖的智能聚合物薄膜對(duì)唾液酸具有響應(yīng)性，能夠應(yīng)用于識(shí)別和檢測(cè)唾液酸。

實(shí)施例6

按實(shí)施例3所述方法將聚丙烯酰胺接枝乳糖的功能聚合物接枝到多孔硅膠表面得到基于乳糖的智能聚合物色譜分離材料，然后以其為柱填料制成固相萃取柱SPE柱備用。

將實(shí)施例3制備的1mg色譜分離材料裝入微型柱中，1μL(40pmol)蛋白酶解液上樣后，分別用30μL的體積濃度85％乙腈/0.1％甲酸(pH 3)洗脫兩次；然后用30μL含有體積濃度80％乙腈/0.1％甲酸(pH 3)溶液洗脫兩次；最后用20μL體積濃度50％乙腈/2％甲酸溶液洗脫。洗脫液直接在質(zhì)譜上進(jìn)行分析。

糖肽可以從聚合物修飾材料上洗脫下來，當(dāng)胎球蛋白和牛血清蛋白質(zhì)量比為1:100時(shí)采用該色譜分離材料可以富集出28個(gè)唾液酸糖肽(圖6)；當(dāng)胎球蛋白和牛血清蛋白質(zhì)量比為1:300時(shí)采用該色譜分離材料仍然可以富集出10個(gè)唾液酸糖肽(圖7)，說明基于乳糖的智能聚合物色譜分離材料能特異性的富集唾液酸類糖肽。

實(shí)施例7

將實(shí)施例3制備的1mg色譜分離材料裝入微型柱中，加入20μL體積濃度50％CH₃CN/0.1％TFA溶液。使用20μL體積濃度80％CH₃CN/20mM NH₄FA(pH＝3.8)溶液平衡，1μL(40pmol)蛋白酶解液上樣到微型柱中。之后微型柱按照順序依次用20mM NH₄FA含有體積濃度75％CH₃CN,70％CH₃CN,65％CH₃CN,60％CH₃CN和55％CH₃CN分別清洗。之后通過微型柱洗滌出來的溶液經(jīng)過冷凍干燥濃縮之后采用質(zhì)譜分析，得到的結(jié)果如圖8所示。該材料能夠?qū)⒑胁煌擎溄Y(jié)構(gòu)但是相同肽段的糖肽都通過改變淋洗液中乙腈的含量從而達(dá)到分離的效果。如圖8所示，糖鏈的末端都是唾液酸，說明對(duì)唾液酸糖肽的分離效果最好。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)乳糖對(duì)唾液酸具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，將乳糖單體和多氨基類聚合物制備成智能聚合物。該聚合物接枝在無孔基質(zhì)表面的得到的基于乳糖的智能聚合物薄膜，對(duì)唾液酸具有很高的選擇性，能夠識(shí)別和檢測(cè)唾液酸。同時(shí)，在對(duì)應(yīng)的無機(jī)多孔基質(zhì)材料上接枝可得到基于乳糖的智能聚合物制備得到的色譜分離材料，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)唾液酸糖肽的高選擇性富集，以及對(duì)含有不同糖鏈結(jié)構(gòu)的唾液酸糖肽的分離。該材料在唾液酸糖肽的分離研究和與唾液酸糖肽相關(guān)的癌癥，內(nèi)分泌等疾病檢測(cè)相關(guān)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。