本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物化學(xué)有效成分分離純化及衍生化技術(shù)領(lǐng)域，涉及的是一種從油橄欖果渣中分離制備羥基酪醇及其快速硝基化的方法。

背景技術(shù)：

油橄欖因其果實(shí)能榨取營養(yǎng)豐富，鮮美可口的橄欖油而聞名，據(jù)統(tǒng)計，2007年，全世界油橄欖果產(chǎn)量就已高達(dá)1736萬噸，產(chǎn)量如按每年5％遞增，2016年產(chǎn)量接近3000萬噸，而全球大概有12000家油橄欖加工廠，大多數(shù)工廠將其榨油后的果渣直接丟棄或肥土等低值化處理，使成千上萬噸的果渣沒有得到高值化的利用。實(shí)際上，榨取橄欖油剩余后果渣主要包括初榨油橄欖果渣和第三階段離心的果渣，是由油橄欖果皮、果肉、果籽和果核的部分組成，如未及時有效處理，因其富含不同的酚類化合物，容易對環(huán)境產(chǎn)生污染。然而研究表明，油橄欖果渣中富含羥基酪醇(3,4-二羥基苯乙醇)，它是一種廣泛分布在油橄欖中的小分子多酚化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、保護(hù)心血管疾病和降血糖等生物活性，具有增強(qiáng)人體免疫功能，并開始應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品、化妝品等領(lǐng)域，且應(yīng)用前景廣闊。因此，對油橄欖果渣的開發(fā)具有提高其經(jīng)濟(jì)附加值及保護(hù)環(huán)境等雙重意義。此外，羥基酪醇的硝基化反應(yīng)是林產(chǎn)化學(xué)的一個重要過程，廣泛用于生產(chǎn)染料、藥物、農(nóng)用化學(xué)品、爆炸品等。傳統(tǒng)的酚類硝基化反應(yīng)往往使用高強(qiáng)氧化性的混酸(硝酸與硫酸混合)或四氟硼酸硝酰陽離子等。但這些方法均有一些缺陷，如副產(chǎn)物二硝基化合物的形成，由于反應(yīng)底物的過氧化而生成氧化產(chǎn)物。目前，國內(nèi)外對羥基酪醇的研究主要集中在提取分離、檢測及其簡單酯化和?；男?，而對羥基酪醇的硝基化反應(yīng)鮮有報道。

目前，針對從油橄欖果渣中提取分離羥基酪醇的鮮有報道，目前對羥基酪醇的制備往往是通過價格較高的油橄欖葉提取物(富含橄欖苦苷)通過酶解、酸或堿水解得到羥基酪醇。如中國專利CN201510067619.9，先大孔樹脂再硅膠柱富集，并使用了強(qiáng)酸性的SO^3-離子交換樹脂將含有橄欖苦苷的提取液轉(zhuǎn)化成羥基酪醇，步驟繁瑣且增加了生產(chǎn)成本，不利于將其工業(yè)化。中國CN201510371820.6，通過酶將油橄欖葉提取物中的橄欖苦甘轉(zhuǎn)化為羥基酪醇，反應(yīng)時間長達(dá)6h，降低了生產(chǎn)效率。中國專利CN201310712259.4使用濃鹽酸將橄欖苦苷水解轉(zhuǎn)化，在95℃下水解40min，再室溫下水解時間近150min，經(jīng)過2次酸水解，共所需的時間近5h。中國專利CN201510162731.0，利用有機(jī)溶劑與堿溶液，超聲4-6h，溫度80～100℃，易形成乳化效應(yīng)，增加了后續(xù)的加工分離工作。抑或是通過其他化合物合成轉(zhuǎn)化而來，如中國專利CN201310199087.5使用濃鹽酸和硝酸對吡啶類化合進(jìn)行硝基化反應(yīng)，以水為溶劑，加入還原劑硼氫化鈉，3,4-二羥基苯乙酸甲酯，反應(yīng)制備得到羥基酪醇粗品，然后采用分子蒸餾的方法制備高純度羥基酪醇。雖然可獲得高純度羥基酪醇，但增加了分子蒸餾儀器的使用，顯著提高了生產(chǎn)成本，且分子蒸餾所需真空度很大，比較耗能，與現(xiàn)在推行的綠色低碳化學(xué)相違背。

此外，傳統(tǒng)的酚類硝基化反應(yīng)往往使用強(qiáng)氧化和腐蝕性的混酸(硝酸與硫酸混合)如中國專利CN201110038279.9，使用了混強(qiáng)酸硝化劑(由75％～85％硫酸、2～7％硝酸和5～15％的水)，且反應(yīng)溫度高達(dá)95℃；中國專利CN201410368294.3使用了易爆炸的硝酸銨與強(qiáng)腐蝕性的三氟甲磺酸酐，反應(yīng)時間長達(dá)12h，為此也有中國專利CN201410437285.5使用不同比例的二甲基二巰基乙酸異辛酯錫、環(huán)氧硬脂酸丁酯、硬脂酸鋇和亞磷酸三辛基苯酯混合物作為穩(wěn)定硝化反應(yīng)的用途，或四氟硼酸硝酰陽離子等(Olah&Kuhn,Wiley-Interscience:New York,1964)。但這些方法均有一些缺陷，如副產(chǎn)物二硝基化合物的形成，由于反應(yīng)底物的過氧化而生成氧化產(chǎn)物(Firouzabadi et al.,Synth.Commun.1998)。

從以上一些國內(nèi)外的發(fā)明專利及文獻(xiàn)可知，在制備羥基酪醇過程中，且提取時間大多為4～6h，不僅時間長，而且效率低，有的所需反應(yīng)溫度高達(dá)80～95℃。此外，因分離濃縮過程使用了分子蒸餾等儀器，增加了能耗和生產(chǎn)成本，降低了工業(yè)化的可行性，此外傳統(tǒng)的硝基化過程往往使用高強(qiáng)易氧化的混酸(濃硫酸與濃硝酸或濃鹽酸與濃硫酸)，或者易燃易爆的硝酸銨，且反應(yīng)時間最高長達(dá)12h，均大大增加了生產(chǎn)的不安全因素，這不僅增加了投資成本，而且操作條件較為苛刻且操作復(fù)雜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種羥基酪醇的制備及其快速硝基化的方法，解決了油橄欖果渣中羥基酪醇分離富集成本偏高，效率低下，及其快速硝基化中所使用的易腐蝕和氧化強(qiáng)混酸(濃硫酸或濃鹽酸與濃硝酸)或易燃易爆的硝酸銨，反應(yīng)時間長，效率低等問題，利于縮短生產(chǎn)周期，易于工業(yè)化。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：一種羥基酪醇提取及硝基化的方法，步驟為：

第一步，提取-萃取并行：稱取曬干粉碎的油橄欖果渣采用超聲提取，提取溶劑為乙醇-水-乙酸乙酯雙相混合溶液；

第二步，柱分離：經(jīng)過濾獲得琥珀色的澄清液，旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇溶解，通過硅膠吸附色譜柱，并利用氯仿-甲醇混合溶劑進(jìn)行洗脫，得到羥基酪醇的收集液；

第三步，旋蒸：將羥基酪醇的收集液旋蒸獲得高純度的羥基酪醇油狀物；

第四步，硝基化：將羥基酪醇溶于水中與溶于弱酸性緩沖溶液的NaNO₂混合均勻，在室溫攪拌下，通過微波作用進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)乙酸乙酯萃取分離，即為4-硝基羥基酪醇溶液；

第五步，干燥：將4-硝基羥基酪醇溶液先旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再將濃縮液進(jìn)行真空干燥，得到淺棕色的油狀物4-硝基羥基酪醇，產(chǎn)率達(dá)90％以上，純度達(dá)95％以上。

超聲提取的功率為100～1100W。

所述的雙相混合溶液中乙醇、水與乙酸乙酯的體積比為1:1:1～2:3:5。

油橄欖果渣與提取溶劑比例為質(zhì)量體積比1:10～50g/ml，提取時間為為1～60min，提取溫度為20-25℃。

所述的氯仿-甲醇混合溶劑中氯仿與甲醇的體積比例為9:1～1:1，洗脫流速為1～8mL/min，硅膠的目數(shù)為100～200目.

旋蒸時的溫度為40～90℃，真空度0.06～0.09Mpa，轉(zhuǎn)速100～300rpm。

所述的弱酸性緩沖溶液為HAC–NaAC、PBS、檸檬酸–氫氧化鈉–鹽酸緩沖液或Tris–鹽酸緩沖液中的任意一種，弱酸性緩沖溶液的pH值為2～6。

羥基酪醇與NaNO₂的摩爾比為1:2～2:1.

微波功率為200～1000W，微波反應(yīng)時間為1～8min，攪拌轉(zhuǎn)速為100～500rpm。

乙酸乙酯萃取的次數(shù)3～5次，每次所需乙酸乙酯萃取的體積60～80mL，真空干燥條件為溫度25～50℃，真空度0.06～0.1Mpa。

有益效果：

1、本發(fā)明采用在超聲波輔助作用下，利用乙醇-水-乙酸乙酯雙相混合溶劑，對油橄欖果渣中的羥基酪醇進(jìn)行快速的提取及萃取一體化分離，不僅提高了提取-萃取效率而且顯著縮短了制備時間，僅需10～20min，此外，較單一均相的乙醇-水和乙酸乙酯提取溶劑，不僅時間上最高縮短了1/6，且羥基酪醇得率提高了近14％(見提取溶劑對比實(shí)驗(yàn))，明顯提高了羥基酪醇的生產(chǎn)效率。

2、減少了其他如離子交換樹脂和分子蒸餾儀器的使用，從而減少了生產(chǎn)成本，僅使用硅膠色譜柱即可實(shí)現(xiàn)高純度羥基酪醇的制備，旋蒸得到的羥基酪醇純度可達(dá)90～95％。

3、在溫和的室溫及弱酸條件下，對羥基酪醇進(jìn)行快速硝基化。

4、在微波作用下，僅5～8min，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率95％以上的硝基化，較上述專利，顯著縮短了硝基化所需的時間，提高了生產(chǎn)效率。

5、硝基化過程無需使用易腐蝕和易氧化的濃硝酸、濃硫酸和易燃易爆的硝酸銨等試劑，也無需添加硝基化反應(yīng)的穩(wěn)定劑(環(huán)氧硬脂酸丁酯、硬脂酸鋇等混合物)，工藝方法重現(xiàn)性好，產(chǎn)品品質(zhì)好，硝基羥基酪醇的產(chǎn)率達(dá)90％以上，純度達(dá)95％以上，本發(fā)明工藝穩(wěn)定，收率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的提供的工藝流程圖。

圖2羥基酪醇和4-硝基羥基酪醇的Uv-Vis

圖3羥基酪醇和4-硝基羥基酪醇的FT-IR。

圖4羥基酪醇和4-硝基羥基酪醇的MS。

圖5 4-硝基羥基酪醇的¹HNMR。

圖6 4-硝基羥基酪醇的¹³CNMR。

具體實(shí)施方式

一種羥基酪醇的制備及其快速硝基化的方法：

(1)提取-萃取并行：稱取一定量經(jīng)太陽曬干的油橄欖果渣粉，用集提取-萃取一體化的混合雙相溶劑，油橄欖果渣與溶劑的比例為1:10～50(w/v)，提取溫度為室溫約20-25℃，提取時間為1～60min，超聲功率為100～1100W的條件下，進(jìn)行超聲波提取-萃取，再用分液漏斗收集溶液的上層即乙酸乙酯層。上述的雙相的極性溶劑為乙醇-水-乙酸乙酯的混合液。

(2)柱分離：將(1)的收集液在25～50℃，150rpm下旋蒸濃縮，得到一定量的濃縮液，經(jīng)硅膠樹脂分離，首先吸附5～10min，用適宜比例的極性混合溶劑洗脫，收集6～8柱體積的目標(biāo)收集液。

(3)旋蒸：將目標(biāo)收集液于25～50℃旋蒸干，其中羥基酪醇的含量可達(dá)90％以上。

(4)硝基化：將收集濃縮的羥基酪醇，與經(jīng)弱酸溶解的NaNO₂混合，在室溫下，通過微波輔助作用，反應(yīng)1～8min進(jìn)行快速硝基化，合成4-硝基羥基酪醇。

本發(fā)明中羥基酪醇快速硝基化合成4-硝基羥基酪醇的反應(yīng)式如下：

(5)干燥：將(4)中最后獲得的反應(yīng)液經(jīng)乙酸乙酯萃取，加入無水Na₂SO₄除水，并在25～50℃下進(jìn)行旋蒸濃縮，進(jìn)行真空干燥，得到的4-硝基羥基酪醇產(chǎn)率可達(dá)90％以上，而含量可達(dá)95％以上。

步驟(1)中所述的提取-萃取并行所用的雙相混合溶劑為乙醇-水-乙酸乙酯混合物，其體積比為1:1:1～2:3:5。

步驟(2)中極性混合溶劑為氯仿-甲醇，比例為9:1～1:1。

步驟(3)中旋蒸條件為：溫度為40～90℃，真空度為0.06～0.09Mpa，轉(zhuǎn)速100～300rmp。

步驟(4)中硝基化過程所使用的羥基酪醇與NaNO₂摩爾比為1:2～2:1，微波功率為100～1000W，攪拌速度100～500rpm。

步驟(5)中乙酸乙酯萃次數(shù)為3～5次，每次60～80mL，真空干燥的條件為：溫度25～50℃，真空度0.06～0.1Mpa，時間12～18h。

實(shí)施例1

(1)提取-萃取并行：稱量經(jīng)太陽曬干和粉碎的油橄欖果渣50g，置于5L圓底燒瓶中，加入2.0L的乙醇-水-乙酸乙酯(2:1:2，v/v)，室溫約25℃，超聲功率為500W，時間為10min的條件下進(jìn)行超聲提取-萃取。

(2)柱分離：從分液漏斗收集的上層液，在45℃下旋蒸干，用適量的甲醇溶解，經(jīng)硅膠樹脂分離，用氯仿-甲醇(7:1，v/v)洗脫，收集6個柱體積的目標(biāo)收集液，每個柱體積約為50mL。

(3)旋蒸：將收集的純化后的羥基酪醇溶液，在60℃，200rpm條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，所獲得的油狀棕褐色羥基酪醇含量為91.5％。

(4)硝基化：配置1mmol/L的羥基酪醇甲醇溶液100mL，與經(jīng)0.1mol/L HAC-NaAC緩沖液(pH3.8)溶解的2mmol/L NaNO₂100mL，在室溫和100rpm攪拌下，通過600W微波作用6min進(jìn)行快速硝基化。

(5)干燥：將目標(biāo)化合物收集液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次，每次60mL，并將乙酸乙酯萃取液匯集后，加入無水Na₂SO₄ 60g，抽濾后的濾液于55℃下旋蒸濃縮，再在50℃，0.09Mpa下真空干燥12h，其中干燥后的油狀淺棕色4-硝基羥基酪醇產(chǎn)率可達(dá)91.5％，其含量為95.6％。

所得羥基酪醇和4-硝基羥基酪醇產(chǎn)品用RP-HPLC分析檢測，色譜條件：C18ODS2色譜柱(Φ4.6mm×200mm，5μm)，柱溫：30℃，流動相：甲醇-水體積比為0.1:0.9，進(jìn)樣量20μL，測定波長：280nm，流速：1.0mL·min^-1。

實(shí)施例2

(1)提取-萃取并行：稱量經(jīng)太陽曬干和粉碎的油橄欖果渣80g，置于5L圓底燒瓶中，加入2.5L的乙醇-水-乙酸乙酯(1.5:1:3，v/v)，室溫約25℃，超聲功率為800W，時間為15min的條件下進(jìn)行超聲提取-萃取。

(2)柱分離：從分液漏斗收集的上層液，在50℃下旋蒸干，用適量的甲醇溶解，經(jīng)硅膠樹脂分離，用氯仿-甲醇(8:1，v/v)洗脫，收集7個柱體積的目標(biāo)收集液，每個柱體積約為50mL。

(3)旋蒸：將收集的純化后的羥基酪醇溶液，在45℃，250rpm條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，所獲得的油狀棕褐色羥基酪醇含量為92.8％。

(4)硝基化：配置2mmol/L的羥基酪醇甲醇溶液120mL，與經(jīng)0.1mol/L PBS緩沖液(pH3.5)溶解的4mmol/L NaNO₂120mL，在室溫和300rpm攪拌下，通過800W微波作用7min進(jìn)行快速硝基化。

(5)干燥：將目標(biāo)化合物收集液經(jīng)乙酸乙酯萃取4次，每次70mL，并將乙酸乙酯萃取液匯集后，加入無水Na₂SO₄ 70g，抽濾后的濾液于55℃下旋蒸濃縮，再在60℃，0.1Mpa下真空干燥15h，其中干燥后的油狀淺棕色4-硝基羥基酪醇的產(chǎn)率為92.3％，其含量為96.9％。

所得羥基酪醇和4-硝基羥基酪醇產(chǎn)品用RP-HPLC分析檢測，色譜條件：C18ODS2色譜柱(Φ4.6mm×200mm，5μm)，柱溫：30℃，流動相：甲醇-水體積比為0.1:0.9，進(jìn)樣量20μL，測定波長：280nm，流速：1.0mL·min^-1。

實(shí)施例3

(1)提取-萃取并行：稱量經(jīng)太陽曬干和粉碎的油橄欖果渣100g，置于5L圓底燒瓶中，加入3.0L的乙醇-水-乙酸乙酯(2:1:3，v/v)，室溫約25℃，超聲功率為1000W，時間為20min的條件下進(jìn)行超聲提取-萃取。

(2)柱分離：從分液漏斗收集的上層液，在60℃下旋蒸干，用適量的甲醇溶解，經(jīng)硅膠樹脂分離，用氯仿-甲醇(9:1，v/v)洗脫，收集8個柱體積的目標(biāo)收集液，每個柱體積約為50mL。

(3)旋蒸：將收集的純化后的羥基酪醇溶液，在60℃，200rpm條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，所獲得的油狀棕褐色羥基酪醇含量為94.6％。

(4)硝基化：配置3mmol/L的羥基酪醇甲醇溶液150mL，與經(jīng)0.1mol/L HAC-NaAC緩沖液(pH3.0)溶解的6mmol/L NaNO₂150mL，在室溫和500rpm攪拌下，通過1100W微波作用8min進(jìn)行快速硝基化。

(5)干燥：將目標(biāo)化合物收集液經(jīng)乙酸乙酯萃取5次，每次80mL，并將乙酸乙酯萃取液匯集后，加入無水Na₂SO₄ 80g，抽濾后的濾液于50℃下旋蒸濃縮，再在45℃，0.1Mpa下真空干燥18h，其中干燥后的油狀淺棕色4-硝基羥基酪醇的產(chǎn)率為93.2％，其含量為97.3％。

所得羥基酪醇和4-硝基羥基酪醇產(chǎn)品用RP-HPLC分析檢測，色譜條件：C18ODS2色譜柱(Φ4.6mm×200mm，5μm)，柱溫：30℃，流動相：甲醇-水體積比為0.1:0.9，進(jìn)樣量20μL，測定波長：280nm，流速：1.0mL·min^-1。

實(shí)施例4(單獨(dú)用乙醇-水或乙酸乙酯作為提取溶劑的對比試驗(yàn))

(1)提取(a)：稱量經(jīng)太陽曬干和粉碎的油橄欖果渣90g，置于5L圓底燒瓶中，加入3.2L的乙醇-水(3:1，v/v)，室溫約26℃，超聲功率為1000W，時間為1h的條件下進(jìn)行超聲提取。

提取(b)：稱量經(jīng)太陽曬干和粉碎的油橄欖果渣90g，置于5L圓底燒瓶中，加入3.2L的乙酸乙酯(3:1，v/v)，室溫約26℃，超聲功率為1000W，時間為1.5h的條件下進(jìn)行超聲提取

(2)柱分離：從分液漏斗收集的上層液，在55℃下旋蒸干，用適量的甲醇溶解，經(jīng)硅膠樹脂分離，用氯仿-甲醇(9:1，v/v)洗脫，收集8個柱體積的目標(biāo)收集液，每個柱體積約為50mL。

(3)旋蒸：將收集的純化后的羥基酪醇溶液，在60℃，200rpm條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，提取步驟(a)與步驟(b)所獲得的油狀棕褐色羥基酪醇含量分別為85.6％和79.8％。

所得羥基酪醇用RP-HPLC分析檢測，色譜條件：C18ODS2色譜柱(Φ4.6mm×200mm，5μm)，柱溫：30℃，流動相：甲醇-水體積比為0.1:0.9，進(jìn)樣量20μL，測定波長：280nm，流速：1.0mL·min^-1。