本發(fā)明涉及一株海洋細(xì)菌BA-3及其在防治蘭花病害中的應(yīng)用，屬于微生物防治領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

當(dāng)前對植物病害的防治主要以化學(xué)防治為主，然而化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用往往會導(dǎo)致環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留及致病菌產(chǎn)生抗藥性等諸多問題，而生防菌以其低毒、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性和原料易得等特性被人們公認(rèn)為為理想的微生物。用于防治植物病害的微生物主要是真菌和細(xì)菌兩大類。其中生防細(xì)菌作用機(jī)理主要包括三個方面。一是拮抗作用，通過產(chǎn)生的抗生物質(zhì)抑制病原菌生長；二是競爭作用，即生防菌株與致病性菌株間存在競爭作用，表現(xiàn)為土壤環(huán)境或作物根系中的營養(yǎng)競爭，以及根表或根內(nèi)的侵染位點競爭，通過優(yōu)先進(jìn)入植株體內(nèi)且穩(wěn)定定殖，阻止或延遲致病性菌株的侵入，起到防病效果；三是誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性，通過生物或非生物處理誘導(dǎo)植物的一種自然防御機(jī)能，在此過程中抗病相關(guān)酶發(fā)揮了重要作用。目前，我國登記防治土傳病害的生防菌均篩選自陸地寄主，因其耐鹽性差在福建省沿海城市鹽漬化地中難以發(fā)揮正常藥效。海洋環(huán)境具有高鹽、高壓、低溫、無光照等特點，造就了微生物種類更豐富的多樣性和特殊性。海洋細(xì)菌作為海洋微生物中一個重要的類群，廣泛分布在海洋各種環(huán)境中，如近岸、海灘、海洋動植物體內(nèi)、海水和深海沉積物等。在這些所謂生命的極限環(huán)境中，海洋細(xì)菌通常具有獨(dú)特的代謝途徑和遺傳背景，不僅確保其在極端環(huán)境中生存，也使其具備了產(chǎn)生特殊結(jié)構(gòu)和功能的活性物質(zhì)的能力。因此，海洋環(huán)境將成為細(xì)菌和細(xì)菌代謝產(chǎn)物的重要新來源，從海洋環(huán)境中分離篩選對植物病原物具有拮抗活性的細(xì)菌對于植物病害的生物防治具有重要的意義。

由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的蘭花莖腐病是蘭花種植過程中的毀滅性病害，它是一種世界性土傳病害。在福建漳州、龍巖、三明等蘭花產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，一般造成15%-30%產(chǎn)量損失。該病病原菌從假鱗莖傷口入侵，前期，葉片表現(xiàn)失水、扭曲；后期，假鱗莖及根部腐爛，水漬狀，最后造成蘭花整株死亡。在適宜溫度和高濕條件下，極易發(fā)生該病害，嚴(yán)重影響植株生長。據(jù)報道，因莖腐病造成蘭花死亡率可達(dá)20-30%，該病害被稱之為蘭花的“不治之癥”。因此，及時有效防控成為蘭花安全生產(chǎn)的重大需求。目前，防治莖腐病的主要策略為化學(xué)防治和培育抗病品種，化學(xué)防治污染環(huán)境且危害人類健康，抗病品種培育困難且存在抗性減弱的風(fēng)險，因此，生物防治因其安全、高效、無殘留成為人們最青睞的方法。特別是利用海洋微生物防治植物病害已有不少成功的例子，而有關(guān)運(yùn)用海洋微生物防治蘭花莖腐病在國內(nèi)外未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一株海洋細(xì)菌BA-3及其在防治蘭花病害中的應(yīng)用，可用于防治由蘭花莖腐病菌或根腐病菌引起的植物病害。

本發(fā)明提供的海洋細(xì)菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3，保藏號為：CGMCC No.12745。

本發(fā)明提供了所述的海洋細(xì)菌BA-3在蘭花莖腐病害中的應(yīng)用。所述植物病害為蘭

花莖腐病菌引起的植物病害。

本發(fā)明所述的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3，已于2016年7月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC），保藏號為：CGMCC No.12745，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

以上所述解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3為活性成分的生物菌劑也

屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，在需要的時候，該菌劑中還可包含菌劑制備中常用的載體和輔料。

所述解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3 為革蘭氏陽性桿菌，菌株在營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基（每1000 mL含有蛋白胨 5 g，酵母浸膏1 g，牛肉膏 3 g，瓊脂粉20 g ，葡萄糖10 g，pH值7.0 ）平板上生長良好，菌落淺白色，邊緣突起，細(xì)胞桿狀（0.7-0.9×1.8-3.0μm）、鏈狀生長、依靠周生鞭毛運(yùn)動。產(chǎn)芽孢、芽孢圓形（0.6-0.8×1.0-1.4μm）、中生或端生、孢子囊不膨大。適宜生長溫度為25-40℃，低于15℃或高于50℃時菌株不生長。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點：

本發(fā)明的海洋細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3對蘭花莖腐病有很強(qiáng)的抑制作用，具有對其引起的真菌病害起到防治作用的潛力。

本發(fā)明的海洋細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3分離自海南省海口市海邊采集的海洋魚類魚體，實驗證明接種蘭花植株后能夠有效防治蘭花莖腐病，為蘭花莖腐病的防治提供了一條環(huán)保、簡單、有效的途徑。

附圖說明

圖1為菌株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3在NA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。

圖2為不同溫度處理對解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3培養(yǎng)濾液抑制作用的影響。

圖3為不同pH值處理對解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3培養(yǎng)濾液抑制作用的影響。

圖4為菌株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3孢子懸浮液對蘭花莖腐病的防效結(jié)果。其中處理I為同時接種解淀粉芽孢桿菌BA-3培養(yǎng)溶液和莖腐病菌孢子懸浮液的實驗結(jié)果；處理Ⅱ先接種解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)液，2 d后接種莖腐病菌孢子懸浮液的實驗結(jié)果；處理Ⅲ先接種莖腐病菌孢子懸浮液，2 d后接種解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)液的實驗結(jié)果；以只接莖腐病菌孢子懸浮液為對照（CK）的實驗結(jié)果。

具體實施方式

下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中的百分比（%），如無特別說明，均表示質(zhì)量百分比。

其中蘭花莖腐病菌菌株F-02分離自發(fā)病癥狀典型的根莖部，按常規(guī)方法進(jìn)行組織分離培養(yǎng)獲得，單孢純化后按柯赫氏法則驗證其致病性后移入PDA培養(yǎng)基試管斜面保存。菌株保藏于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生態(tài)調(diào)控室。

實施例1：海洋細(xì)菌的篩選與鑒定

1、海洋細(xì)菌的篩選

本發(fā)明的菌株是從海南?？谑泻Ｑ篝~類上分離獲得的，具體方法為：取海魚的內(nèi)臟、腸道、鰓和鰭等不同部位進(jìn)行海洋細(xì)菌的分離篩選。采用平板稀釋法分離海洋魚類共附生細(xì)菌，取適量樣品，分別用無菌海水反復(fù)沖洗，盡可能除去樣品表面的非共附生微生物，再用無菌吸水紙將樣品表面水分吸干，用 75%乙醇擦拭，接著將樣品稱重，勻漿，取上清液，用無菌海水分別按照 10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12稀釋，吸取 200 μL 液體，均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)基（NA）培養(yǎng)基平板上，于培養(yǎng)箱中 28 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)情況，根據(jù)菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征，去除重復(fù)的菌株。純化的細(xì)菌菌株接種斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。在倒好的PDA平板中央接入新鮮的蘭花莖腐病菌塊，將純化后的細(xì)菌菌株用滅菌牙簽點接于距離莖腐病菌瓊脂塊2 cm處。篩選抑菌活性最強(qiáng)的的菌株（抑菌圈直徑為35 mm），結(jié)果獲得一株對蘭花莖腐病具有很強(qiáng)拮抗作用的菌株（見圖1），將該菌株命名為BA-3。

2、菌株BA-3的種屬鑒定

采用常規(guī)生理生化特性對BA-3菌株進(jìn)行鑒定，該菌株為革蘭氏陽性桿菌，在營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基（每1000 mL含有蛋白胨 5 g，酵母浸膏1 g，牛肉膏 3 g，瓊脂粉20 g ，葡萄糖10 g，pH值7.0 ）平板上生長良好，菌落淺白色，邊緣突起，細(xì)胞桿狀（0.7-0.9×1.8-3.0 μm）、鏈狀生長、依靠周生鞭毛運(yùn)動。產(chǎn)芽孢、芽孢圓形（0.6-0.8×1.0-1.4 μm）、中生或端生、孢子囊不膨大。適宜生長溫度為25–40℃，低于15℃或高于50℃時菌株不生長。生化實驗結(jié)果表明，能水解明膠、淀粉；不水解纖維素；硝酸鈉被還原成亞硝酸鈉；能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源；在1-7%NaCl鹽濃度能生長；使用Gordon等人研究所用的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，菌株能利用下列碳源產(chǎn)酸：阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、乳糖、棉子糖、木糖、甘露醇和蔗糖；具有運(yùn)動性，V.P反應(yīng)陽性，接觸酶反應(yīng)呈陽性；依據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊》，BA-3菌株的以上生理生化特征均與解淀粉芽孢桿菌項目，因此，將其命名為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3。其基本生物學(xué)特性詳見表1。其16S rRNA 序列如SEQ ID NO.1所示。

表1解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3的鑒定及其生理生化特性

注：“＋”表示測定結(jié)果為陽性；“－”表示測定結(jié)果為陰性。

實施例2：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3培養(yǎng)濾液對蘭花莖腐病菌的生物活性

1、BA-3培養(yǎng)濾液對蘭花莖腐病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

采用載玻片孢子萌發(fā)法，將蘭花莖腐病菌孢子懸浮液培養(yǎng)12 h后，在放大160倍的光學(xué)

顯微鏡下觀察，不接BA-3培養(yǎng)液的對照中，約有98%的孢子萌發(fā)，形成細(xì)長而均勻的芽管，但在接海洋功能細(xì)菌BA-3的培養(yǎng)濾液10倍、40倍、100倍中的孢子只有1-40%的萌發(fā)率，且芽管短，有些芽管變形，不均勻。具體萌發(fā)率及抑制率詳見表2。

表2 海洋細(xì)菌BA-3培養(yǎng)濾液對蘭花莖腐病孢子萌發(fā)的影響

2、不同濃度BA-3培養(yǎng)液對蘭花莖腐病菌菌絲生長的影響

采用菌絲生長速率法。將BA-3菌株在NA上培養(yǎng)48～72 h，取各菌一接種環(huán)的菌苔分別接入100 mL 1號培養(yǎng)液（配方為：每1000 mL含有200 g馬鈴薯煮水濾汁、葡萄糖10 g，蛋白胨：10 g，MnSO₄·7H₂O 0.1 g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.1 g，KH₂PO₄ 0.1 g）中培養(yǎng)24 h作種子液，再分別吸取20 μl種子液注入新培養(yǎng)液中，各培養(yǎng)液定量20 mL，瓶定量為150 mL，置于搖床28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)120 h。取培養(yǎng)液于12000 r/min離心5 min，再取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾獲得上清濾液，置4℃保存?zhèn)溆?。吸取各上清濾液與PDA培養(yǎng)基（溫度45℃）混合制成含8%上清濾液的平板，于平板中央接種5 mm蘭花莖腐病菌菌餅，倒置于培養(yǎng)箱中28℃下進(jìn)行12 h黑暗交替培養(yǎng)，重復(fù)3次，以無菌水為對照， 11d觀察蘭花莖腐病菌菌絲生長情況，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算生長速度抑制率。測定結(jié)果表明（表3），蘭花莖腐病菌菌絲在含有不同濃度BA-3培養(yǎng)液的平板上生長受到不同程度的抑制作用。BA-3培養(yǎng)濾液的濃度對抗菌活性的影響較大，BA-3培養(yǎng)濾液被稀釋500倍后幾乎失去活性，在10倍時，生長6d后對蘭花莖腐病菌菌絲生長的抑制效果最好，高達(dá)69.4%，且具有持續(xù)抑制率，11 d時仍有65.1%的抑制率。同時，在濾液稀釋100倍時，在11d時對蘭花莖腐病菌菌絲生長的抑制作用仍比咪鮮胺500倍液的強(qiáng)。

抑制率（%）=[（空白對照菌落直徑－菌餅直徑）]－（處理菌落直徑－菌餅直徑）/（空白對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

表3 不同處理濃度BA-3培養(yǎng)濾液對蘭花莖腐病菌菌絲生長的影響

3、不同溫度處理對海洋細(xì)菌BA-3培養(yǎng)濾液抗菌活性的影響

PDA培養(yǎng)基溶化冷卻到45℃左右時加入10 mL經(jīng)不同溫度處理的BA-3培養(yǎng)濾液（

培養(yǎng)濾液制作方法同上）和原始BA-3培養(yǎng)濾液，倒平板，以不加BA-3培養(yǎng)液的平板為對照；用無菌打孔器從長滿蘭花莖腐病菌的平板邊緣打取直徑為5 mm的菌苔，把菌苔移置平板中央，每皿一片，平板倒置于28℃培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)。11 d觀察蘭花莖腐病菌菌絲生長情況并記載菌落大小。結(jié)果表明，溫度對BA-3培養(yǎng)濾液的活性有一定的影響，經(jīng)100 ℃處理30 min后活性有所下降，120 ℃處理30 min后失去活性，90 ℃以下的溫度處理對BA-3培養(yǎng)濾液的活性沒有影響，對蘭花莖腐病菌的菌絲生長的抑制率也沒有影響，和原液相差不大（圖2）。

4、pH值對海洋細(xì)菌BA-3培養(yǎng)濾液穩(wěn)定性的影響

用NaOH調(diào)節(jié)海洋細(xì)菌BA-3培養(yǎng)濾液pH值，60000 r/min離心20 min后，取上清液

備用。PDA培養(yǎng)基溶化冷卻到45℃左右時加入10 mL經(jīng)不同pH處理的BA-3培養(yǎng)濾液（

培養(yǎng)濾液制作方法同上）和相應(yīng)pH值的無菌水。倒平板，以加相應(yīng)pH值的無菌水的平板作為對照；用無菌打孔器從長滿蘭花莖腐病菌的平板邊緣打取直徑為5 mm的菌苔，把菌苔移置平板中央，每皿一片，平板倒置于28℃培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)。11 d觀察蘭花莖腐病菌菌絲生長情況并記載菌落大小。結(jié)果表明（圖3），pH為6.5時，BA-3培養(yǎng)濾液的抗菌活性最強(qiáng)，堿性條件下比酸性條件下的抑菌活性強(qiáng)；在酸性條件下，培養(yǎng)濾液的抗菌活性較弱。由此可見BA-3培養(yǎng)濾液在堿性條件下會比較穩(wěn)定，但在略偏酸性條件下活性最強(qiáng)。

實施例3、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-3培養(yǎng)濾液對蘭花莖腐病菌的防效測定

1、菌株BA-3培養(yǎng)濾液對莖腐病菌的防效測定：將所得培養(yǎng)濾液以無菌水稀釋配制成濃度為200 mg/L、400 mg/L和800 mg/L的溶液。蘭花莖腐病菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后配成10⁸ cfu/mL的孢子懸浮液備用。設(shè)3個接種處理：處理I為同時接種解淀粉芽孢桿菌BA-3培養(yǎng)溶液和莖腐病菌孢子懸浮液；處理Ⅱ先接種解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)液，2 d后接種莖腐病菌孢子懸浮液；處理Ⅲ先接種莖腐病菌孢子懸浮液，2 d后接種解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)液；以只接莖腐病菌孢子懸浮液為對照，三次重復(fù)。將接種后的蘭花植株置于28℃下保濕培養(yǎng)14d后測量發(fā)病面積，計算抑制率。結(jié)果如圖4所示，表明處理Ⅱ先接種解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)液，2 d后接種莖腐病菌孢子懸浮液病斑很小，幾乎沒有，防治效果最好；處理I同時接種解淀粉芽孢桿菌BA-3培養(yǎng)溶液和莖腐病菌孢子懸浮液的有少許病斑，但是均也很小；處理Ⅲ先接種莖腐病菌孢子懸浮液，2 d后接種解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)液病斑較大，但是比對照??；表明該解淀粉芽孢桿菌BA-3對蘭花莖腐病有防治效果。

蘭花植株發(fā)病情況分級標(biāo)準(zhǔn)：

0級———無??；

1級———病斑占根莖面積的5%以下；

3級———病斑占根莖面積的6%~10%；

5級———病斑占根莖面積的11%~25%；

7級———病斑占根莖面積的26%~50%；

9級———病斑占根莖面積的51%以上。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 一株海洋細(xì)菌BA-3及其在防治蘭花病害中的應(yīng)用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1428

<212> DNA

<213> 芽孢桿菌菌屬（Bacillus sp.）

<400> 1

tcaccccaat catctgtccc accttcggcg gctggctcct aaaaggttac ctcaccgact 60

tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt 120

caccgcggca tgctgatccg cgattactag cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag 180

actgcgatcc gaactgagaa cagatttgtg ggattggctt aacctcgcgg tttcgctgcc 240

ctttgttctg tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga 300

cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat 360

gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca 420

cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc actctgcccc cgaaggggac gtcctatctc 480

taggattgtc agaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc 540

acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattccttt gagtttcagt cttgcgaccg 600

tactccccag gcggagtgct taatgcgtta gctgcagcac taaggggcgg aaacccccta 660

acacttagca ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc 720

cacgctttcg ctcctcagcg tcagttacag accagagagt cgccttcgcc actggtgttc 780

ctccacatct ctacgcattt caccgctaca cgtggaattc cactctcctc ttctgcactc 840

aagttcccca gtttccaatg accctccccg gttgagccgg gggctttcac atcagactta 900

agaaaccgcc tgcgagccct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc cacctacgta 960

ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg tggctttctg gttaggtacc gtcaaggtgc 1020

cgccctattt gaacggcact tgttcttccc taacaacaga gctttacgat ccgaaaacct 1080

tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg 1140

ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggccgatc accctctcag 1200

gtcggctacg catcgtcgcc ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atgcgccgcg 1260

ggtccatctg taagtggtag ccgaagccac cttttatgtc tgaaccatgc ggttcagaca 1320

accatccggt attagccccg gtttcccgga gttatcccag tcttacaggc aggttaccca 1380

cgtgttactc acccgtccgc cgctaacatc agggagcaag ctcccatc 1428