本發(fā)明涉及疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種豬圓環(huán)病毒2型重組植物乳桿菌口服疫苗的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circovridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），血清型為PCV1和PCV2，臨床上導(dǎo)致疾病的主要是PCV2。圓環(huán)病毒感染主要導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合癥（PMWS），該病還與其他多種綜合癥密切相關(guān)，如豬先天性震顫（CT）、皮炎腎病綜合癥（PNDS）、豬呼吸系統(tǒng)疾病癥候群、母豬繁殖障礙和腸炎等疾病。PCV2經(jīng)常與豬繁殖與呼吸系統(tǒng)疾病綜合征病毒（PRRSV）或豬細(xì)小病毒（PPV）病發(fā)或繼發(fā)感染細(xì)菌，使患病豬病情加重，給全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2基因組全長(zhǎng)1766bp～1768bp不等，主要編碼ORF1、ORF2和ORF3 3個(gè)閱讀框，其中ORF2編碼病毒的衣殼蛋白，是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是PCV2主要抗原蛋白，可作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，明顯降低豬的發(fā)病率。

自1991年，首次在加拿大報(bào)道該病，隨后在亞洲、南北美洲和歐洲相繼爆發(fā)。我國(guó)在2000年，首次報(bào)道后存在PCV2的感染，該病感染就一直呈上升趨勢(shì)已經(jīng)給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前該病的防控主要是依靠注射疫苗，市場(chǎng)上的疫苗主要是全病毒滅活苗和基因工程苗。滅活苗主要毒株分為：SH株、LG株、WH株、ZJ/c株；滅活苗在使用過程中需多次接種，產(chǎn)生免疫保護(hù)所需要的時(shí)間長(zhǎng)，且不能用于緊急預(yù)防接種。商品化的基因工程苗主要是進(jìn)口的勃林格的疫苗，保護(hù)效果顯著，但價(jià)格昂貴。

乳酸菌是一種非致病的革蘭式陽(yáng)性菌，是公認(rèn)的益生菌，在維持胃腸道內(nèi)的穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)腸道的正常菌群，抑制腐敗菌的繁殖，抑制膽固醇吸收，降血脂、降壓，免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤、癌癥預(yù)防等方面起著重要作用。在過去的20多年里，乳酸菌作為一種傳遞預(yù)防和治療的分子的載體已經(jīng)引起研究人員的關(guān)注。作為載體：乳酸菌安全，沒有內(nèi)毒素，表達(dá)外源蛋白無需經(jīng)過純化，可以連同菌體一起服用。另外外源基因的容量大，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，是理想的基因工程疫苗載體，特別針對(duì)口服疫苗。再者，乳酸菌能在腸道中存活定植，口服基因工程乳酸菌后，表達(dá)的蛋白可以不斷地在腸道中產(chǎn)生并起到相應(yīng)的作用，因此，乳酸菌可以作為理想的食品級(jí)的抗原遞呈載體。

與注射疫苗相比，口服疫苗有著不可替代的優(yōu)勢(shì)：黏膜免疫節(jié)約勞動(dòng)、節(jié)約時(shí)間，減少動(dòng)物應(yīng)激，在治療慢性病時(shí)能增強(qiáng)效果和特異性。作為口服疫苗，乳酸菌能在胃腸道中存活，通過黏膜免疫發(fā)揮作用，產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。因此，口服疫苗在藥物的研發(fā)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題是克服注射疫苗存在的缺陷，提供一種豬圓環(huán)病毒2型重組植物乳桿菌口服疫苗的制備方法。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供豬圓環(huán)病毒重組乳桿菌的構(gòu)建。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供豬圓環(huán)病毒重組乳桿菌的口服疫苗。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供豬圓環(huán)病毒重組乳桿菌的口服疫苗的制備方法。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供豬圓環(huán)病毒重組乳桿菌的口服疫苗的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過以下的技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種豬圓環(huán)病毒2型重組植物乳桿菌的制備方法，包括以下的步驟：

S1. 分離擴(kuò)增，獲得PCV2毒株的衣殼蛋白Cap序列，所述Cap序列如SEQ ID NO：8所示；

S2. 將Cap序列與表達(dá)載體pPSCPSP連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPSCPSP-Cap；

S3. 將表達(dá)質(zhì)粒pPSCPSP-Cap轉(zhuǎn)入植物乳桿菌LP-1中，即獲得豬圓環(huán)病毒重組植物乳桿菌pPSCPSP-Cap-LP-1。

優(yōu)選地，所述PCV2毒株可以直接從豬場(chǎng)采集的病料的淋巴結(jié)中獲得。

本研究中從病料分離到的PCV毒株屬于PCV2型毒株，是臨床上導(dǎo)致豬圓環(huán)病毒疾病的毒株，本研究還對(duì)該毒株進(jìn)行測(cè)序鑒定，與NCBI基因庫(kù)中進(jìn)行基因BLAST比對(duì)，與絕大多數(shù)PCV2型毒株的同源性高達(dá)99%。以該毒株來擴(kuò)增表達(dá)Cap蛋白具有臨床意義。

本研究中PCV2毒株的序列如SEQ ID NO：7。用于擴(kuò)增衣殼蛋白Cap序列（ORF2，序列如SEQ ID NO：8）的引物P5和P6是根據(jù)PCV2基因中的ORF2基因序列的進(jìn)行設(shè)計(jì)的。

優(yōu)選地，所述質(zhì)粒pPSCPSP-Cap是用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入植物乳桿菌LP-1中。

在本發(fā)明中選用的pPSCPSP載體不需要誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)的PCV2的Cap蛋白能發(fā)揮正常的免疫保護(hù)的功能。

另外，本發(fā)明還通過設(shè)計(jì)特異性引物，最終擴(kuò)增中衣殼蛋白Cap序列，因此，本發(fā)明還保護(hù)用于擴(kuò)增S1所述Cap序列的引物為P5和P6，序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

優(yōu)選地，S2所述載體pPSCPSP是以pIAβ為骨架，包含超強(qiáng)啟動(dòng)子SCP和M6前體蛋白信號(hào)肽的序列構(gòu)建而得。

本發(fā)明還提供所述方法獲得的豬圓環(huán)病毒2型重組植物乳桿菌pPSCPSP-Cap-LP-1；pPSCPSP-Cap-LP-1可以在豬體內(nèi)定植，且生物活性高。

本發(fā)明還提供含有所述pPSCPSP-Cap-LP-1的制劑。

本發(fā)明還提供所述pPSCPSP-Cap-LP-1在制備預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒感染的生物制品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述pPSCPSP-Cap-LP-1在制備預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒感染的疫苗中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種預(yù)防和治療圓環(huán)病毒感染的口服疫苗的制備方法，是將pPSCPSP-Cap-LP-1接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得全培養(yǎng)物，將所述全培養(yǎng)物直接作為口服疫苗。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供一種豬圓環(huán)病毒2型重組植物乳桿菌的制備方法，通過將分離得到的Cap序列與表達(dá)載體pPSCPSP連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPSCPSP-Cap；并將表達(dá)質(zhì)粒pPSCPSP-Cap轉(zhuǎn)入植物乳桿菌LP-1中，獲得豬圓環(huán)病毒重組植物乳桿菌pPSCPSP-Cap-LP-1，使Cap序列在植物乳菌中成功表達(dá)，在體內(nèi)外都有活性，pPSCPSP-Cap-LP-1可以在豬體內(nèi)定植，且生物活性高；pPSCPSP-Cap-LP-1的培養(yǎng)物可直接作為口服疫苗使用，使得生產(chǎn)上節(jié)約勞動(dòng)、節(jié)約時(shí)間，減少動(dòng)物應(yīng)激，作為口服疫苗，乳酸菌能在胃腸道中存活，通過黏膜免疫發(fā)揮作用，產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫；口服疫苗能夠有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，可顯著地降低豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的發(fā)病率，有助于解決畜牧養(yǎng)殖中豬圓環(huán)病毒嚴(yán)重感染的所導(dǎo)致的生長(zhǎng)發(fā)育不良、消瘦、母豬繁殖障礙、呼吸困難、偶伴黃疸、腹瀉、內(nèi)臟器官及皮膚呈現(xiàn)廣泛的病理變化等情況，提高豬群的免疫水平，從而改善豬群的健康水平，增加養(yǎng)殖所帶來的經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明

圖1 為重組植物乳桿菌表達(dá)載體pPSCPSP-Cap的雙酶切鑒定，其中，M：DNA maker 2000；1：pPSCPSP-Cap質(zhì)粒；2：pPSCPSP-Cap單酶切；3：pPSCPSP-Cap雙酶切。

圖2 為重組植物乳桿菌pPSCPSP-Cap-LP-1的PCR鑒定；其中，M：DNA maker 2000；1：陰性對(duì)照；2：pPSCPSP-Cap-DH5α陽(yáng)性對(duì)照；3～10：PCR鑒定組。

圖3 為重組植物乳桿菌表達(dá)上清處理后 SDS-PAGE；其中，M為蛋白Marker；1為空白對(duì)照；2為pPSCPSP-Cap-LP-1。

圖4 為重組植物乳桿菌表達(dá)上清的Westernblot，其中，M為蛋白Marker；1為陽(yáng)性對(duì)照；2為pPSCPSP-Cap-LP-1的樣品上清。

圖5 為重組植物乳桿菌口服疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其中分別設(shè)為空白組（PBS組），A組（對(duì)照組），B組（疫苗組），C組（10倍菌液濃度灌胃），D組（100倍菌液濃度灌胃），E（原菌液濃度飲水），F(xiàn)（10倍菌液濃度飲水）。

圖6 為小鼠口服重組植物乳桿菌口服疫苗一段時(shí)間后，植物乳桿菌在胃腸道內(nèi)定植情況；其中，陰：陰性對(duì)照，陽(yáng)：口服的重組植物乳桿菌pPSCPSP-Cap-LP-1，M：DNA maker 2000，1～10：從糞便中分離的植物乳桿菌單菌落。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

本專利中所構(gòu)建的植物乳桿菌表達(dá)載體pPSCPSP，是以載體pIAβ8為骨架，以來源于L.casei CETC5276超強(qiáng)啟動(dòng)子SCP、M6前體蛋白序列構(gòu)建獲得的。

實(shí)施例1 圓環(huán)病毒的克隆

從豬場(chǎng)采集的病料中用DNA病毒提取試劑盒，抽提基因組，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，通過PCR的方法，用引物P1、P2從所采集的病料中檢測(cè)出陽(yáng)性樣，再通過P3、P4擴(kuò)增出PCV2的全病毒的序列：

引物P1：AATGGCATCTTCAACACCC

引物 P2：TTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC

引物 P3：CCCAAGCTTCCGCGGGCTGGCTGATTTGAAAGT

引物 P4：GGGGTACCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTAC

具體過程如下：

S1. 以病料中抽提的基因組為模板，用引物P1、P2進(jìn)行病毒特異性的檢測(cè)，PCR的程序?yàn)椋侯A(yù)變性，94℃ 5min；變性，94℃ 45s；退火，55℃ 30s；延伸，72℃ 30s；30個(gè)循環(huán)后72℃ 終延伸10min，電泳后，將能擴(kuò)增出460bp左右的條帶的樣品確定為陽(yáng)性樣品。

S2. 以檢測(cè)出來的陽(yáng)性樣為模板，用引物P3、P4進(jìn)行病毒特異性的檢測(cè)，PCR的程序?yàn)椋侯A(yù)變性，94℃ 5min；變性，94℃ 45s；退火，54℃ 30s；延伸，72℃ 2min；30個(gè)循環(huán)后72℃ 終延伸10min電泳鑒定后擴(kuò)增出1700bp左右的條帶。

S3. S2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收純化后克隆至pMD19-T vector。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α感受態(tài)，用T載體自帶的M13引物，進(jìn)行菌液PCR的鑒定，陽(yáng)性菌液，用細(xì)菌試劑盒抽提質(zhì)粒，送去上海生工生物股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序的結(jié)果與Gene bank中序列比對(duì)，將正確的質(zhì)粒命名：pMD19-PCV2。

實(shí)施例2 植物乳桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)一對(duì)引物（P6和P5），用于擴(kuò)增ORF2閱讀框（Cap蛋白）的序列

P5：CCCTCGAGATGATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTC

P6：CCGAGCTCTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAAG

重組乳桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建：（1）以質(zhì)粒pMD19-PCV2為模板，P5和P6為引物，用高保真酶擴(kuò)增出PCV2的Cap蛋白的序列，PCR的程序?yàn)椋侯A(yù)變性，94℃ 5min；變性，94℃ 45s；退火，54℃ 30s；延伸，72℃ 2min；30個(gè)循環(huán)后72℃ 終延伸10min電泳鑒定后擴(kuò)增出700bp左右的條帶。

（2）將700bp左右的條帶，純化回收后，與pPSCPSP載體相連接：PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳回收后和植物乳桿菌的表達(dá)載體一起用XhoI和SacI雙酶切反應(yīng)。膠回收PCV2 Cap蛋白序列和pSCPSP目的片段，用連接酶，在16℃中過夜反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，根據(jù)pPSCPSP載體上的抗性基因，用氯霉素和氨芐青霉素的抗性LB平板進(jìn)行抗性篩選，用菌液進(jìn)行PCR鑒定，搖菌提質(zhì)粒，用XhoI和SacI進(jìn)行酶切鑒定（圖1），單酶切的條帶明顯不同于環(huán)狀的質(zhì)粒，雙酶切組可見700bp左右的目的片段。表明重組表達(dá)載體已經(jīng)成功構(gòu)建，鑒定為陽(yáng)性的菌命名為pPSCPSP-Cap-DH5α。

將鑒定好的質(zhì)粒pPSCPSP-Cap的質(zhì)粒用去上海生工生物股份有限公司測(cè)序，排出基因突變。將成功構(gòu)建的表達(dá)載體pPSCPSP-Cap用電轉(zhuǎn)化至植物乳桿菌LP-1，點(diǎn)擊參數(shù)為：1.7kv，2000Ω，25μF，4.0ms，2nm。電轉(zhuǎn)后的菌液用預(yù)冷的MRS液體培養(yǎng)基重懸，37℃孵育2h。離心后取菌液均勻涂布在氯霉素（25μg/ml）的抗性平板上37℃培養(yǎng)。單菌落，進(jìn)行PCR鑒定（圖2），引物為P5，P6。鑒定正確的菌命名為pPSCPSP-Cap- LP-1。

實(shí)施例3 蛋白的表達(dá)與鑒定

一、目的基因在植物乳桿菌中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定：將轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性重組菌pPSCPSP-Cap-LP-1和空載體pPSCPSP-LP-1接于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)后的菌液按2%的比例接種于適量的MRS液中，37℃培養(yǎng)28h左右取上清，用80%的硫酸銨沉淀，蛋白用PBS復(fù)性，濃縮處理后用12%的分離蛋白膠電泳，用SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)相應(yīng)的蛋白條帶（圖3），圖3結(jié)果顯示空質(zhì)粒組沒有目的條帶，重組植物乳桿菌組有28kDa左右的目的條帶。

二、目的基因在植物乳桿菌中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot鑒定：蛋白上清的用步驟一的方法處理后，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，200mA，30min，用5%的脫脂奶粉室溫封閉2h處理后，用PCV2的單克隆抗體（1：200用3%BSA稀釋）4℃過夜孵育，洗膜后用HRP標(biāo)記的二抗（1：2000用3%BSA稀釋）室溫孵育1h，用蛋白顯影儀留圖（圖4），圖4結(jié)果顯示在28kDa左右可見目的條帶。

實(shí)施例4 重組植物乳桿菌pPSCPSP-Cap-LP-1口服免疫小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將6～7周齡雌性小鼠隨機(jī)分成8組，每組8只；分別設(shè)為空白組（PBS組），A組（對(duì)照組），B組（疫苗組），C組（10倍菌液濃度灌胃），D組（100倍菌液濃度灌胃），E（原菌液濃度飲水），F(xiàn)（10倍菌液濃度飲水）。

口服組，每天持續(xù)飲水，水中加入乳酸菌，以10⁸CFU/mL，10⁹CFU/mL的菌濃度飲水（原菌液濃度計(jì)數(shù)：10⁸CFU/mL）。疫苗組腿部肌肉注射100ul滅活苗，首免14天后加強(qiáng)免疫一次。在首免后的14天，28天，隨機(jī)取4只，摘除眼球采血收集血清，做ELISA的抗體檢測(cè)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，乳酸菌處理：將37℃過夜培養(yǎng)的菌，用無菌PBS洗三次后，重懸至濃度為10¹⁰CFU/mL（參考乳酸菌口服疫苗的中文文獻(xiàn)），整個(gè)實(shí)驗(yàn)的分組如表1所示。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第14天，28天，42天采血清，血清采集后，先放置在37℃靜置2h，3000r，離心10min，析出血清。用小鼠PCV2抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中抗體含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，抗體檢測(cè)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)多組間采用的是單因素分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

小鼠PCV2抗體含量檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果分析：

利用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中一免后14天，28天，二免后14天，28天各組的抗體含量進(jìn)行單因素方法分析，組間比較采用的是t檢驗(yàn)，免疫后，空白組，A組與其他組間差異性極顯著（P<0.01），空白組與A組間差異性顯著（P>0.05），一免14天B組和F組差異性不顯著（P>0.05），C組，D組，E組間差異性顯著（P<0.05）；一免28天，E組和F組間差異性不顯著（P>0.05），C組，D組，E組間差異性顯著（P<0.05）；二免14天，B組和D組，B組和F組，D組和E組間差異性不顯著（P>0.05）；二免28天，E組和F組間差異性不顯著（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，口服疫苗通過口服和灌胃都能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的重組植物乳桿菌pPSCPSP-Cap-LP-1能刺激機(jī)體產(chǎn)生PCV2的抗體，且活性良好（圖5）。

重組植物乳桿菌口服免疫小鼠20天左右，采集新鮮的糞便，用特異性引物P5，P6進(jìn)行菌液PCR鑒定，檢測(cè)植物乳桿菌能否在胃腸道內(nèi)定植，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州沃德生物技術(shù)有限公司

<120> 一種豬圓環(huán)病毒2型重組植物乳桿菌口服疫苗的制備方法及應(yīng)用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> P5

<400> 1

ccctcgagat gatgacgtat ccaaggaggc gtttc 35

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> P6

<400> 2

ccgagctctt acttagggtt aagtgggggg tctttaag 38

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> P1

<400> 3

aatggcatct tcaacaccc 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> P2

<400> 4

ttaagggtta agtggggggt c 21

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> P3

<400> 5

cccaagcttc cgcgggctgg ctgatttgaa agt 33

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> P4

<400> 6

ggggtacccc gcggaaattt ctgacaaacg ttac 34

<210> 7

<211> 1710

<212> DNA

<213> PCV2序列

<400> 7

gctctctgca cggtcaccag actcccgctc tccaacaagg tactcacagc agtagagagg 60

tcactccgtt gtccttgaga tctaggagct ccacattcta tcagtaagtt gccttcttta 120

ctgcaatatt ctttattctg ctgatctgtt cctttcgctt tctcgatgtg gcagcgggca 180

ccaaaatacc acttcacttt attaaaagtt tgcttcttca caaaattagc gaacccctgt 240

aggtggggtg ttcggccctc ctcattacct tcctcgccaa caataaaata atcaaatagg 300

gagattggga gctcccgtat tttcttgcgc tcgtcttcgg aaggattatt cagcgtgaac 360

acccaccttt tatgtggttg gggtccgctt cttccactct tcttgctggg catgttgctg 420

ctgaggtgct gccgaggtgc tgccgctgcc gaagtgcgct ggtaatactt acagcgcact 480

tctttcgttt tcagcgatga cgtatccaag gaggcgtttc cgcagacgaa gacaccgccc 540

ccgcagccat cttggccaga tcctccgccg ccgcccctgg ctagtccacc cccgccaccg 600

ttaccgctgg agaaggaaaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca ccatcggtta 660

tactgtcaag aaaaccacag tcagaacgcc ctcctggaat gtggacatga tgagatttaa 720

tattaatgat tttcttcccc caggaggggg ctcaaacccc ctcactgtgc cctttgaata 780

ctacagaata aggaaggtta aggttgaatt ctggccctgc tccccaatca cccagggtga 840

caggggagtg ggctccactg ctgttattct agatgataac tttgtaacaa aggccaatgc 900

cctaacctat gacccctatg taaactactc ctcccgccat accataaccc agcccttctc 960

ctaccactcc cggtacttta ccccgaaacc tgtccttgat acgacaatcg attacttcca 1020

acccaataac aaaagaaatc aactctggct gagactacaa actactggaa atgtagacca 1080

tgtaggcctc ggcactgcgt tcgaaaacag tatatacgac caggactaca atatccgtat 1140

aaccatgtat gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac cccccactta accctaagtg 1200

aataataaaa accattacga agtgataaaa aagactcagt aatttatttc atatggaaat 1260

tcagggcatg ggggggaaag ggtgacgaac tggccccctt cctccgtgga ttgttctgta 1320

gcattcttcc aaaataccaa ggaagtaatc ctccgataga gagcttctac agctgggaca 1380

gcagttgagg agtaccattc caacggggtc tgattgctgg taatcagaat actgcgggcc 1440

aaaaaaggta cagttccacc tttagtctca acagtcaaag gatatcgatc acagagtctc 1500

agtagatcat cccacggcag ccagccataa aagtcatcaa taacaaccac ttcttcacca 1560

tggtaaccat cccaccactt gtttctaggt ggtttccagt atgtggtttc cgggtctgca 1620

aaattagcag cccatttgct tttgccacac ccaggtggcc ccacaatgac gtgtacattc 1680

gtctccaatc acgctctgca tccgtgctat 1710

<210> 8

<211> 702

<212> DNA

<213> PCV2的ORF2序列

<400> 8

atgacgtatc caaggaggcg tttccgcaga cgaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60

cagatcctcc gccgccgccc ctggctagtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120

aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccatcg gttatactgt caagaaaacc 180

acagtcagaa cgccctcctg gaatgtggac atgatgagat ttaatattaa tgattttctt 240

cccccaggag ggggctcaaa ccccctcact gtgccctttg aatactacag aataaggaag 300

gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360

actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca atgccctaac ctatgacccc 420

tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccggtac 480

tttaccccga aacctgtcct tgatacgaca atcgattact tccaacccaa taacaaaaga 540

aatcaactct ggctgagact acaaactact ggaaatgtag accatgtagg cctcggcact 600

gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtataaccat gtatgtacaa 660

ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaacccta ag 702