本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著生物科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因治療將在人類攻克癌癥及遺傳疾病等頑癥的過程中占據(jù)重要地位，并將逐步成為一種常見的有效手段(參見JeongJH,KimSW,ParkTG.Park.Moleculardesignoffunctionalpolymersforgenetherapy.Prog.Polym.Sci.2007；32(11):1239-1274.)?；蛑委熓侵笇⑷说恼；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。成功的基因治療依賴于有效的基因載體，常見的載體分為病毒類載體和非病毒載體。病毒類載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等，但是病毒類載體在臨床應(yīng)用中存在著很大的安全隱患，在基因治療歷史上首例患者死亡事件以及著名的法國“氣泡嬰兒”事件，在很大程度上都是由病毒類基因載體的不安全性造成的。非病毒載體多為高分子陽離子聚合物，因其安全、有效、無免疫原性等優(yōu)點，已成為病毒類載體最有希望的替代者(參見GodbeyWT,WuKK,MikosAG.Poly(ethylenimine)anditsroleingenedelivery.J.ControlRelease.1999Aug5；60(2-3):149-160.RemyJS,AbdallahB,ZantaMA,BoussifO,BehrJP,DemeneixB.Genetransferwithliposperminesandpolyethylenimines.Adv.DrugDeliver.Rev1998Mar2；30(1-3):85-95.)。其中，陽離子聚合物如聚乙烯亞胺(PEI)是常用的一個非病毒類載體，它已經(jīng)在體外和體內(nèi)的轉(zhuǎn)染實驗中得到應(yīng)用，但由于其毒性高、轉(zhuǎn)染效率低、在體內(nèi)運輸過程的非特異性吸附以及沒有靶向性的缺點，阻礙了它的進(jìn)一步發(fā)展(參見LungwitzU,BreunigM,BlunkT,GopferichA.Polyethylenimine-basednon-viralgenedeliverysystems.Eur.J.Pharm.Biopharm2005；60(2):247-266.)。理想的基因治療過程是，載有質(zhì)粒DNA的基因載體在血液中循環(huán)，到達(dá)腫瘤組織后被腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞并完成轉(zhuǎn)染治療。但實際過程中有很多因素阻礙了載體體系到達(dá)腫瘤組織。首先血液中含有很多帶負(fù)電的蛋白類物質(zhì)，可與帶正電的載體體系吸附凝聚成大顆粒沉淀或被清除掉(參見Liu,Y.,andReineke,T.M.Poly(glycoamidoamine)sforgenedelivery.Structuraleffectsoncellularinternalization,bufferingcapacity,andgeneexpression.BioconjugateChem.2007；18,19-30.)；其次，由于正常體液環(huán)境中，細(xì)胞表面帶負(fù)電荷，帶正電的載體體系也容易接近正常細(xì)胞，被正常細(xì)胞內(nèi)吞，細(xì)胞內(nèi)吞陽離子復(fù)合物顆粒的重要機理就是首先通過靜電作用吸附復(fù)合物顆粒，然后復(fù)合物顆粒進(jìn)入細(xì)胞。這些都最終影響了轉(zhuǎn)染效率，因此開發(fā)體內(nèi)應(yīng)用的基因載體，就要增加基因載體體系進(jìn)入目標(biāo)組織細(xì)胞的效率，降低其被非目標(biāo)組織吸附的幾率。為了提高基因載體體系進(jìn)入目標(biāo)組織細(xì)胞的效率，常用的方法是引入生物相容性的聚乙二醇(PEG)來降低在血液運輸過程中的非特異性吸附。然而單純的遮蔽體系會影響載體體系與細(xì)胞的結(jié)合效率，從而降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料、其制備方法及應(yīng)用，該改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料可作為遮蔽體系降低血液運輸過程中的非特異性吸附。本發(fā)明提供了一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料，包括改性聚乙二醇與生長在改性聚乙二醇上的納米碳酸鈣；所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚合物得到；所述聚合物為聚氨基酸和/或聚丙烯酸。優(yōu)選的，所述聚乙二醇的分子量為5000～30000。優(yōu)選的，所述聚乙二醇與聚合物的摩爾比為(3～10)：1。優(yōu)選的，所述聚氨基酸為聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。本發(fā)明還提供了一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料的制備方法，包括以下步驟：將改性聚乙二醇與可溶性鈣鹽在水中混合，然后加入可溶性碳酸鹽混合攪拌，離心后將上層溶液透析，冷凍干燥后得到改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料；所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚合物得到；所述聚合物為聚氨基酸和/或聚丙烯酸。優(yōu)選的，所述可溶性鈣鹽為氯化鈣；所述可溶性碳酸鹽為堿金屬碳酸鹽。優(yōu)選的，所述改性聚乙二醇與可溶性鈣鹽的摩爾比為1：(20～100)。優(yōu)選的，所述混合攪拌的時間為8～20h。本發(fā)明還提供了上述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料作為基因載體遮蔽材料的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述基因載體為聚乙烯亞胺。本發(fā)明提供了一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料、其制備方法及應(yīng)用，該改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料包括改性聚乙二醇與生長在改性聚乙二醇上的納米碳酸鈣；所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚氨基酸和/或聚丙烯酸得到。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料作為基因載體遮蔽材料，其不僅可降低血液運輸過程中的非特異性吸附還可有效提高基因載體對基因物質(zhì)的傳輸能力，進(jìn)而提高了基因載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，同時該復(fù)合材料還具有較好的生物相容性。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1中得到的改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料的掃描電鏡照片；圖2為本發(fā)明實施例1中得到的改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料的細(xì)胞毒性實驗結(jié)果曲線圖。具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供了一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料，包括改性聚乙二醇與生長在改性聚乙二醇上的納米碳酸鈣；所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚氨基酸和/或聚丙烯酸得到。按照本發(fā)明，所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚氨基酸和/或聚丙烯酸得到；所述聚乙二醇為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的聚乙二醇即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中所述聚乙二醇的分子量優(yōu)選為5000～30000；所述聚氨基酸為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的聚氨基酸即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸；所述聚氨基酸的分子量優(yōu)選為5000～50000；所述聚丙烯酸的分子量優(yōu)選為5000～50000；所述聚乙二醇與接枝物的摩爾比優(yōu)選為(3～10)：1，更優(yōu)選為(3～9)：1；所述接枝物為聚氨基酸和/或聚丙烯酸。本發(fā)明提供的復(fù)合材料在所述改性聚乙二醇上生長有納米碳酸鈣；所述納米碳酸鈣與改性聚乙二醇的摩爾比優(yōu)選為(20～100)：1，更優(yōu)選為(40～100)：1，再優(yōu)選為(60～80)：1，最優(yōu)選為80:1。本發(fā)明以改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料作為基因載體遮蔽材料，其不僅可降低血液運輸過程中的非特異性吸附還可有效提高基因載體對基因物質(zhì)的傳輸能力，進(jìn)而提高了基因載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，同時該復(fù)合材料還具有較好的生物相容性。本發(fā)明還提供了一種上述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料的制備方法，包括以下步驟：將改性聚乙二醇與可溶性鈣鹽在水中混合，然后加入可溶性碳酸鹽混合攪拌，離心后將上層溶液透析，冷凍干燥后得到改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料；所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚合物得到；所述聚合物為聚氨基酸和/或聚丙烯酸。其中，所述聚乙二醇與聚合物均同上所述，在此不再贅述。按照本發(fā)明，優(yōu)選將改性聚乙二醇溶于水中，并調(diào)節(jié)pH值至弱堿性，更優(yōu)選調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.5，再優(yōu)選調(diào)節(jié)pH值為8；所述改性聚乙二醇與水的質(zhì)量體積比優(yōu)選為5～30毫克/毫升，更優(yōu)選為10～20毫克/毫升，再優(yōu)選為10毫克/毫升。調(diào)節(jié)pH值后優(yōu)選攪拌10～40min，更優(yōu)選攪拌20～30min，再優(yōu)選攪拌20min，再加入可溶性鈣鹽；所述可溶性鈣鹽為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的可溶于水的鈣鹽即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為氯化鈣；所述改性聚乙二醇與可溶性鈣鹽的摩爾比優(yōu)選為1：(20～100)，更優(yōu)選為1：(40～100)，再優(yōu)選為1：(60～80)，最優(yōu)選為1：80。加入可溶性鈣鹽后，優(yōu)選混合攪拌20～50min，更優(yōu)選混合攪拌25～40min，再優(yōu)選混合攪拌30～35min，最優(yōu)選混合攪拌30min，然后加入可溶性碳酸鹽；所述可溶性碳酸鹽為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的水溶性碳酸鹽即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為堿金屬碳酸鹽，更優(yōu)選為碳酸鈉；所述可溶性碳酸鈉與可溶性鈣鹽的摩爾比優(yōu)選為1:1；所述可溶性碳酸鹽優(yōu)選以溶液的形式緩慢滴加，邊滴加邊攪拌；所述滴加的速度優(yōu)選為2毫升/分鐘。加入可溶性碳酸鹽后，混合攪拌；所述混合攪拌的時間優(yōu)選為8～20h，更優(yōu)選為10～16h，再優(yōu)選為12～14h，最優(yōu)選為12h?；旌蠑嚢韬箅x心；所述離心的速率優(yōu)選為6000～8000轉(zhuǎn)/分；所述離心的時間優(yōu)選為2～10min，更優(yōu)選為3～8min，再優(yōu)選為4～6min，最優(yōu)選為5min。離心后，取上層溶液透析；所述透析的時間優(yōu)選為40～120h，更優(yōu)選為50～100h，再優(yōu)選為60～90h，再優(yōu)選為70～80h，最優(yōu)選為72h；透析期間，優(yōu)選換水4～6次。透析結(jié)束后，冷凍干燥，得到改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料。本發(fā)明還提供了一種上述的改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料作為基因載體遮蔽材料的應(yīng)用；其中所述基因載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基因載體即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為聚乙烯亞胺；所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料與基因載體的質(zhì)量比優(yōu)選為1：(0.5～5)，更優(yōu)選為1：(0.5～3)，再優(yōu)選為1：(1～2)，最優(yōu)選為1：1。按照本發(fā)明，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料作為基因載體遮蔽材料，可用于遮蔽基因載體與質(zhì)粒DNA體系，作為質(zhì)粒DNA的載體體系；此時，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～1)：1，更優(yōu)選為(5～1)：1，再優(yōu)選為(3～2)：1，最優(yōu)選為2.5:1；所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料作為質(zhì)粒DNA的載體體系可適用于目前各種細(xì)胞系，如HeLa，293T，293F，293S，BE(2)C，CHO，CHO-S，COS7，COS-7L，CV-1，HEK-293，HT-1080，MDCK，NIH-3T3，SKBR3，Vero等細(xì)胞系；其作為質(zhì)粒DNA的載體體系時的用法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用法即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選按照以下步驟進(jìn)行：1)細(xì)胞培養(yǎng)；所述細(xì)胞培養(yǎng)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選將細(xì)胞置于胎牛血清的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)液中胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為10％；所述培養(yǎng)條件優(yōu)選為37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。2)體外轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔1×104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％～90％；轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料、基因載體與質(zhì)粒DNA以及含有體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料、基因載體與質(zhì)粒DNA混合物的體積應(yīng)不超過培養(yǎng)液體積的1/10)混合至終體積200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定：a)綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)：用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號。陽性細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光，而陰性細(xì)胞則無。用流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞的百分率。b)熒光素酶活性檢測：取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉(zhuǎn)染效率。c)β-半乳糖苷酶染色：細(xì)胞用0.01mol/L的PBS洗滌，用0.4％多聚甲醛固定5min，PBS沖洗后加入5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方為0.04％X-gal,5mmol/L亞鐵氰化鉀，5mmol/L高鐵氰化鉀和2mmol/LMgCl2),放置37℃，5％CO2孵育3h。陽性細(xì)胞呈深藍(lán)色，計算陽性細(xì)胞的百分率。4)細(xì)胞毒性測試：采用噻唑藍(lán)比色法比較評價基因載體材料的細(xì)胞毒性。實驗前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔1×104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％～90％。將不同濃度的材料與細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時后，每孔分別加入20μl含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％噻唑藍(lán)的磷酸鹽緩沖液?；旌衔镌?7℃繼續(xù)作用4小時，加入200μl二甲基亞砜溶解噻唑藍(lán)甲臢結(jié)晶10分鐘。然后用酶標(biāo)儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm。細(xì)胞存活率按下公式計算：細(xì)胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100Asample是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞樣品孔的吸收，Acontrol是不與改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料、基因載體與質(zhì)粒DNA混合物作用的細(xì)胞樣品孔的吸收，每組實驗重復(fù)三次。按照本發(fā)明，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料作為基因載體遮蔽材料可用于遮蔽基因載體與質(zhì)粒siRNA體系，作為質(zhì)粒siRNA的載體體系；此時，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料與質(zhì)粒siRNA的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～1)：1，更優(yōu)選為(5～1)：1，再優(yōu)選為(3～2)：1，最優(yōu)選為2.5:1；所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料作為質(zhì)粒siRNA載體可適用于目前各種細(xì)胞系，如HeLa，293T，293F，293S，BE(2)C，CHO，CHO-S，COS7，COS-7L，CV-1，HEK-293，HT-1080，MDCK，NIH-3T3，SKBR3，Vero等細(xì)胞系；所述作為載體時轉(zhuǎn)染的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，本發(fā)明中優(yōu)選按照以下步驟進(jìn)行：1)用常規(guī)方法合成siRNA：所述的siRNA為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的siRNA即可，并無特殊的限制，在本發(fā)明實施例中優(yōu)選以沉默熒光素酶的LucsiRNA為例，其序列為5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′。2)細(xì)胞的培養(yǎng)：細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的培養(yǎng)液中，在37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中連續(xù)培養(yǎng)。3)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔1×104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80％～90％。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，加入改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料、基因載體與質(zhì)粒siRNA混合物以及含有體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(改性聚乙烯亞胺與質(zhì)粒siRNA混合物的體積應(yīng)不超過培養(yǎng)液體積的1/10)至終體積200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。4)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉(zhuǎn)染效率。按照本發(fā)明，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料作為基因載體遮蔽材料，可用于pDNA轉(zhuǎn)染。其中，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料與基因的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～1)：1，更優(yōu)選為(5～1)：1，再優(yōu)選為(3～2)：1，最優(yōu)選為2.5:1；所述體內(nèi)pDNA轉(zhuǎn)染的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選按照以下步驟進(jìn)行：1)CT26細(xì)胞的培養(yǎng)取小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，在含有10％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的牛血清的培養(yǎng)液中，在含5％(體積百分?jǐn)?shù))CO2、溫度為37℃的孵箱中培養(yǎng)。2)腫瘤接種購買重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對數(shù)生長期的CT26細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103轉(zhuǎn)/min離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細(xì)胞，按每只小鼠2×106細(xì)胞的密度接種于腋下，10天后，瘤徑長大至10mm時進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。3)體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒(改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料、基因載體與轉(zhuǎn)染基因混合物)在含有5％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的葡萄糖溶液(復(fù)合物顆粒的體積所占總體積的比例應(yīng)低于10％)中至終體積0.5mL，尾靜脈注射。4)體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的測定體內(nèi)轉(zhuǎn)染48h后，處死小鼠，取出腫瘤，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，勻漿，然后加入熒光素底物，測定轉(zhuǎn)染效率。按照本發(fā)明，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料作為基因載體遮蔽材料，還可用于體內(nèi)siRNA轉(zhuǎn)染。其中，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料與基因的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～1)：1，更優(yōu)選為(5～1)：1，再優(yōu)選為(3～2)：1，最優(yōu)選為2.5:1；所述體內(nèi)siRNA轉(zhuǎn)染的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選按照以下步驟進(jìn)行：1)CT26細(xì)胞的培養(yǎng)取小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，在含有10％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的牛血清的培養(yǎng)液中，在含5％(體積百分?jǐn)?shù))CO2、溫度為37℃的孵箱中培養(yǎng)。2)腫瘤接種購買重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對數(shù)生長期的CT26細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103轉(zhuǎn)/min離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細(xì)胞，按每只小鼠2×106細(xì)胞的密度接種于腋下，8天后，瘤徑長大至7mm時進(jìn)行體內(nèi)siRNA的轉(zhuǎn)染。3)體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因物質(zhì)選用沉默血管內(nèi)皮生長因子的VEGFsiRNA，通過抑制VEGF的表達(dá)實現(xiàn)抑制腫瘤生長的目的，基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒(改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料、基因載體與轉(zhuǎn)染基因混合物)在含有5％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的葡萄糖溶液中至終體積50μL，尾靜脈注射給藥。4)體內(nèi)腫瘤生長的測定從第一次給藥開始測量瘤徑大小，實驗共14天。本發(fā)明提供的改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料用于提高聚乙烯亞胺的基因轉(zhuǎn)染效率并做為陽離子載體的遮蔽材料，一方面增加生物相容性，另一方面提高陽離子載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，其是新型載體遮蔽材料。以商業(yè)化分子量為25000Da的聚乙烯亞胺(PEI25K)為例，PEI25K在細(xì)胞水平有較高的轉(zhuǎn)染效率，但用于體內(nèi)動物實驗，容易與血液中負(fù)電物質(zhì)結(jié)合，降低其轉(zhuǎn)染效率。引入遮蔽體系PGlu-g-PEG(聚谷氨酸接枝改性的聚乙二醇，PEG可以有效防止PEI與血液中負(fù)電物質(zhì)作用)可以降低體PEI體內(nèi)應(yīng)用時的負(fù)面作用，然而PEG會嚴(yán)重影響載體的轉(zhuǎn)染效率。采用PGlu-g-PEG&CaCO3(聚谷氨酸接枝改性的聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料)作為遮蔽，可以有效克服PEG對轉(zhuǎn)染帶來的負(fù)面影響，并提高原有載體的轉(zhuǎn)染效率。如在同等條件下對HeLa和MCF7細(xì)胞介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染時，PGlu-g-PEG&CaCO3遮蔽PEI(pDNA/PEI/PGlu-g-PEG&CaCO3)的轉(zhuǎn)染效率是pDNA/PEI的5～7倍，是pDNA/PEI/PGlu-g-PEG的1000～2000倍。在最佳轉(zhuǎn)染比例范圍內(nèi)，pDNA/PEI/PGlu-g-PEG&CaCO3可以有效降低細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率在90％以上；其基因沉默效率高，對恒定表達(dá)熒光素酶的Huh7以及CT26細(xì)胞的最高基因沉默效率均可達(dá)到80％以上，該復(fù)合體系相對于商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑PEI25K有較高基因沉默效率和較小的細(xì)胞毒性，并適合于體內(nèi)應(yīng)用，有廣泛的應(yīng)用前景。為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料、其制備方法及應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實施例中所用的試劑均為市售。實施例1改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料(PGlu-g-PEG&CaCO3)的制備室溫，一定量聚谷氨酸接枝聚乙二醇(PGlu-PEG)溶解于去離子水中，并調(diào)節(jié)pH值至8.0，攪拌20分鐘；向PGlu-PEG溶液中加入一定量溶解好的氯化鈣，攪拌30分鐘；然后將一定量碳酸鈉溶液緩慢滴加到上述溶液中，邊加邊攪，加完再攪拌12小時。把反應(yīng)完的溶液轉(zhuǎn)入離心管6000～8000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，取上層溶液轉(zhuǎn)入透析帶透析72小時，期間換水4～6次，冷凍干燥，得到PGlu-g-PEG&CaCO3。PGlu-g-PEG的組成及其與碳酸鈣(CaCO3)的摩爾比對應(yīng)關(guān)系列于表1。作為對比相應(yīng)的PGlu-g-PEG的組成對應(yīng)關(guān)系列于表2。利用掃描電子顯微鏡對實施例1中得到的改性聚乙二醇/碳酸鈣復(fù)合材料PGlu-g-PEG&CaCO3進(jìn)行分析，得到其掃描電鏡照片，如圖1所示。表1原料的摩爾比對應(yīng)關(guān)系產(chǎn)品編號PGlu-PEG、氯化鈣與碳酸鈉的摩爾比例PGlu、PEG及CaCO3的摩爾比例PPCa11:80:801:3:80PPCa21:80:801:6:80PPCa31:80:801:9:80表2PGlu-g-PEG的組成產(chǎn)品編號PGlu、PEG的摩爾比例PP11:3:PP21:6:PP31:9:實施例2以HeLa細(xì)胞為例，利用PGlu-g-PEG&CaCO3、PEI載體體系介導(dǎo)pGL3(熒光素酶質(zhì)粒)、pEGFPN1(綠色熒光蛋白質(zhì)粒)、pCMV-lacZ(β-半乳糖苷酶質(zhì)粒)對HeLa細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)(1)取人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)，在含有10％小牛血清的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)(5％CO2、37℃孵箱)。(2)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔1×104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80～90％。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒(PGlu-g-PEG&CaCO3、PEI載體體系與質(zhì)粒混合物)以及含有體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基至終體積200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。(3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，然后加入熒光素底物，用光度計測定轉(zhuǎn)染效率。表3給出了熒光素酶質(zhì)粒的復(fù)合物的組成及其轉(zhuǎn)染效率。綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號。陽性細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光，而陰性細(xì)胞則無。用流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞的百分率。表4給出了綠色熒光蛋白質(zhì)粒的復(fù)合物的組成及其轉(zhuǎn)染效率。β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞用0.01mol/L的PBS洗滌，用0.4％多聚甲醛固定5min，PBS沖洗后加入5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方為0.04％X-gal，5mmol/L亞鐵氰化鉀，5mmol/L高鐵氰化鉀和2mmol/LMgCl2),放置于37℃，5％CO2孵育3h。陽性細(xì)胞呈深藍(lán)色，計算陽性細(xì)胞的百分率。表5給出了β-半乳糖苷酶質(zhì)粒的復(fù)合物的組成及其轉(zhuǎn)染效率。表3熒光素酶質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染效率其中P25K為商業(yè)化分子量為25000Da的聚乙烯亞胺；載體為聚乙烯亞胺。表4綠色熒光蛋白質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染效率表5β-半乳糖苷酶質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染效率4)細(xì)胞毒性測試：采用噻唑藍(lán)比色法比較評價基因載體材料的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性測試結(jié)果如圖2所示，其中，PEI25K為商業(yè)化分子量為25000Da的聚乙烯亞胺；PGlu-g-PEG&CaCO3中PGlu-g-PEG與CaCO3的摩爾比為1：80；PGlu-g-PEG&CaCO3/PEI中PGlu-g-PEG&CaCO3與PEI的質(zhì)量比為1:1。實施例3以Huh7細(xì)胞為例，利用PGlu-g-PEG&CaCO3、PEI載體體系介導(dǎo)沉默熒光素酶的LucsiRNA在Huh7細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染(1)Huh7細(xì)胞的培養(yǎng)：取Huh7細(xì)胞，在含有10％小牛血清的培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)(5％CO2、37℃孵箱)。(2)體外轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后用達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋，按每孔1×104細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5％二氧化碳的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80～90％。轉(zhuǎn)染時，吸棄前一天加注的細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒以及含有體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基至終體積200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。(3)體外轉(zhuǎn)染效率的測定取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，然后加入熒光素底物，用光度計測定轉(zhuǎn)染效率。表6給出了熒光素酶沉默效率。表6LucsiRNA體外轉(zhuǎn)染效率實施例4以MCF7細(xì)胞為例，PGlu-g-PEG&CaCO3、PEI載體體系在體內(nèi)pDNA轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用(1)MCF7細(xì)胞的培養(yǎng)取MCF7細(xì)胞，在含有10％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的牛血清的培養(yǎng)液中，在含5％(體積百分?jǐn)?shù))CO2、溫度為37℃的孵箱中培養(yǎng)；(2)腫瘤接種購買重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對數(shù)生長期的MCF7細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103轉(zhuǎn)/min離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細(xì)胞，按每只小鼠2×106細(xì)胞的密度接種于腋下，10天后，瘤徑長大至直徑10mm時進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。(3)體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒在含有5％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的葡萄糖溶液中至終體積0.5mL，尾靜脈注射。(4)體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的測定體內(nèi)轉(zhuǎn)染48h后，處死小鼠，取出腫瘤，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，勻漿，然后加入熒光素底物，測定轉(zhuǎn)染效率。表7給出了體內(nèi)實驗熒光素酶質(zhì)粒的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。表7熒光素酶質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率實施例5以CT26細(xì)胞為例，PGlu-g-PEG&CaCO3、PEI載體體系在體內(nèi)siRNA轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用(1)CT26細(xì)胞的培養(yǎng)取小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，在含有10％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的牛血清的培養(yǎng)液中，在含5％(體積百分?jǐn)?shù))CO2、溫度為37℃的孵箱中培養(yǎng)。(2)腫瘤接種購買重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對數(shù)生長期的CT26細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103轉(zhuǎn)/min離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細(xì)胞，按每只小鼠2×106細(xì)胞的密度接種于腋下，8天后，瘤徑長大至7mm時進(jìn)行體內(nèi)siRNA的轉(zhuǎn)染。(3)體內(nèi)轉(zhuǎn)染基因物質(zhì)選用沉默血管內(nèi)皮生長因子的VEGFsiRNA，通過抑制VEGF的表達(dá)實現(xiàn)抑制腫瘤生長的目的，基因組轉(zhuǎn)染的復(fù)合物顆粒在含有5％(質(zhì)量/體積百分?jǐn)?shù))的葡萄糖溶液中至終體積50μL，尾靜脈注射給藥。(4)體內(nèi)腫瘤生長的測定從第一次給藥開始測量瘤徑大小，實驗共14天。表8給出了體內(nèi)實驗VEGFsiRNA的復(fù)合物對腫瘤抑制14天后的瘤徑。表8VEGFsiRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染后瘤徑大小本發(fā)明提供的PGlu-g-PEG&CaCO3作為遮蔽體系遮蔽PEI，轉(zhuǎn)染效率高，其在同等條件下對HeLa細(xì)胞介導(dǎo)熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率最高為商業(yè)化PEI25K的5～7倍，在最佳轉(zhuǎn)染比例范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率在90％以上；其基因沉默效率高，對恒定表達(dá)熒光素酶的Huh7細(xì)胞的最高基因沉默效率為82.5％，該聚合物相對于商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑PEI25K有較高基因沉默效率和較小的細(xì)胞毒性。當(dāng)前第1頁1 2 3