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      構(gòu)建多西環(huán)素調(diào)控表達(dá)c?met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法與流程

      文檔序號:12097568閱讀:538來源:國知局
      構(gòu)建多西環(huán)素調(diào)控表達(dá)c?met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法與流程
      本發(fā)明涉及細(xì)胞生物
      技術(shù)領(lǐng)域
      ,尤其涉及一種構(gòu)建多西環(huán)素調(diào)控表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法。
      背景技術(shù)
      :基因治療是將具有防治潛能的外源基因通過合適載體轉(zhuǎn)移到患者的有關(guān)組織細(xì)胞內(nèi),并獲得適當(dāng)表達(dá),以達(dá)到防治或減輕疾病的目的。有關(guān)基因治療肝衰竭的研究我們已做了大量工作,并對其研究現(xiàn)狀和前景進(jìn)行了詳細(xì)綜述。目前基因治療有兩條主要途徑,即invivo和exvivo。invivo途徑是指將外源基因裝配于特定的真核細(xì)胞表達(dá)載體(病毒型或非病毒型)上,直接導(dǎo)入人體內(nèi),因轉(zhuǎn)染效率和安全性等問題而限制了其臨床應(yīng)用范圍;exvivo途徑是指將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體細(xì)胞,經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后回輸體內(nèi),該種方法與干細(xì)胞移植相結(jié)合即為基因修飾后干細(xì)胞移植。介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的載體一般分為病毒載體和非病毒載體,目前病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率,在干細(xì)胞移植研究中應(yīng)用最多。但由于普通病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞后目的基因表達(dá)量和表達(dá)時間難以控制。Gossen等最早利用原核基因調(diào)控元件構(gòu)建了真核細(xì)胞基因可控性表達(dá)系統(tǒng),即Tet系統(tǒng)。該系統(tǒng)由兩部分組成:1)Tet反應(yīng)性元件(tetracyclineresponsiveelement,TRE),由7個拷貝的細(xì)菌四環(huán)素操縱子DNA序列(TetoperatorDNAsequence,TetO)和啟動子組成;2)融合的轉(zhuǎn)錄活化因子,tTA(tet-controlledtranscriptionalactivator)或rtTA(reversetet-controlledtranscriptionalactivator)。tTA和rtTA中TetR成分與TetO序列結(jié)合,通過VP16發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。tTA在其誘導(dǎo)因子不存在時與上述反應(yīng)性元件結(jié)合,啟動目的基因轉(zhuǎn)錄;加入誘導(dǎo)因子后,誘導(dǎo)因子與tTA結(jié)合使其從TRE上脫落,終止目的基因轉(zhuǎn)錄。而rtTA的作用方式與tTA的相反,當(dāng)加入誘導(dǎo)因子時啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄,當(dāng)誘導(dǎo)因子從系統(tǒng)中去除后,目的基因的轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。這兩種系統(tǒng)能在外源誘導(dǎo)因子的作用下可人為控制目的基因的表達(dá)或關(guān)閉,故被分別稱為Tet-off/Tet-on系統(tǒng)。目前應(yīng)用最多的Tet-on系統(tǒng)為Clontech公司提供的Tet-onadvanced多西環(huán)素調(diào)控系統(tǒng),該系統(tǒng)和其它基因調(diào)控系統(tǒng)相比,其可控性和目的基因表達(dá)效率都有極大的提高。然而Tet-onadvanced系統(tǒng)的可控性主要體現(xiàn)在目的基因表達(dá)時間的控制,對于表達(dá)的部位或細(xì)胞種類缺少控制,因此在基因修飾干細(xì)胞治療靶向控制研究領(lǐng)域還存在缺陷。目前尚未見到關(guān)于構(gòu)建多西環(huán)素調(diào)控c-met蛋白表達(dá)、ALB啟動子控制GFP表達(dá)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株的研究和報道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:針對上述問題,本發(fā)明提供一種可以通過多西環(huán)素調(diào)控表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法,用于研究該細(xì)胞株治療肝衰竭時順HGF濃度定向歸巢和分化能力,以及該能力與HGF/c-met軸表達(dá)水平之間的量效關(guān)系的研究,本發(fā)明是這樣獲得的:一種構(gòu)建多西環(huán)素調(diào)控表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法,其特征在于,具體步驟如下:1、選取4周齡SPF級SD雄性大鼠,提取并培養(yǎng)BMSCs;2、建立Tet-OnAdvancedBMSCs細(xì)胞株:2.1分別以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2為上下游引物,以pTet-OndvancedVector載體為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得目的基因CMV-rtTA;2.2以限制性內(nèi)切酶BamHI、AgeI酶切慢病毒載體GV211,于37℃反應(yīng)3h,酶切產(chǎn)物即為線性化載體DNA;酶切體系:10×CutSmartBuffer5μl,1μg/μL慢病毒載體GV2112μl,10U/μl的限制性內(nèi)切酶BamHI、AgeI酶1μl,ddH2O補(bǔ)足至50μl;2.3配制線性化載體DNA和目的基因重組反應(yīng)體系,于37℃反應(yīng)30min,獲得慢病毒表達(dá)載體GV211-CMV-rtTA;2.4向離心管中加入GV211-CMV-rtTA20μg、pHelper1.015μg、pHelper2.010μg,以InvitrogenLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑補(bǔ)足至1ml,室溫下孵育15min;然后滴入細(xì)胞密度為70%~80%的293T細(xì)胞中,于37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h,棄去培養(yǎng)基,加入含10%血清低糖培養(yǎng)基,于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48~72h;2.5收集步驟2.4培養(yǎng)后的293T細(xì)胞上清液,于4℃,4000g離心10min;取上清液以0.45μm濾器過濾,再收集濾液于4℃,25000rpm,離心2h;棄去上清,加入病毒保存液,即獲得Len-CMV-rtTA慢病毒;2.6將對數(shù)生長期的BMSCs接種于96孔板中,每孔加入4~5×104個細(xì)胞及100μl含10%血清低糖培養(yǎng)基,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%左右時,棄去培養(yǎng)基,向各孔中加入10μl步驟2.5獲得的病毒滴度為2×108TU/ml的Len-CMV-rtTA慢病毒、10μl終濃度為5μg/ml的ploybrene增強(qiáng)液和80μl的含10%血清低糖培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng);感染12h后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入100μl含10%血清低糖培養(yǎng)基;感染72h后,再次以含10%血清低糖培養(yǎng)基換液,并向每孔加入終濃度為9μg/ml的嘌呤毒素進(jìn)行藥物篩選,成活細(xì)胞即為Tet-OnAdvancedBMSCs;3、建立GFP(+)Tet-on-c-metBMSCs細(xì)胞株:3.1合成基因序列TRE-minCMV啟動子-c-met-ALB啟動子-GFP;3.2配制線性化載體DNA和目的基因重組反應(yīng)體系:5×CEIIBuffer2μl,步驟2.2獲得的濃度為800ng/μL線性化載體DNA2.5μl,步驟3.1獲得的濃度為800ng/μL的TRE-minCMV啟動子-c-met-ALB啟動子-GFP1μl,ExnaseII1μl,ddH2O補(bǔ)足至10μl;將反應(yīng)體系置于于37℃反應(yīng)30min,獲得慢病毒表達(dá)載體GV211-TREminCMV-c-met/ALB-GFP;重組反應(yīng)體系:3.3向離心管中加入GV211-TREminCMV-c-met/ALB-GFP20μg、pHelper1.015μg、pHelper2.010μg,以InvitrogenLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑補(bǔ)足至1ml,室溫下孵育15min;然后滴入細(xì)胞密度為70%~80%的293T細(xì)胞中,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h,棄去培養(yǎng)基,加入含10%血清低糖培養(yǎng)基,于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48-72h;3.4收集步驟3.3培養(yǎng)后的293T細(xì)胞上清液,于4℃,4000g離心10min;取上清液以0.45μm濾器過濾,再收集濾液于4℃,25000rpm,離心2h;棄去上清,加入病毒保存液,即獲得慢病毒Len-TREminCMV-c-met/ALB-GFP,其病毒滴度為2×108TU/ml;3.5將對數(shù)生長期的Tet-OnAdvancedBMSCs接種于96孔板中,每孔加入4~5×104個細(xì)胞及100μl含10%血清低糖培養(yǎng)基,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%左右時,棄去培養(yǎng)基,向各孔中加入10μlLen-TREminCMV-c-met/ALB-GFP慢病毒、10μl終濃度為5μg/ml的ploybrene增強(qiáng)液和80μl的含10%血清低糖培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng);感染12h后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入100μl含10%血清低糖培養(yǎng)基;感染72h后,再次以含10%血清低糖培養(yǎng)基換液,并向每孔加入終濃度為9μg/ml的嘌呤毒素;通過流式細(xì)胞儀篩選GFP陽性BMSCs細(xì)胞,即獲得GFP(+)Tet-on-c-metBMSCs細(xì)胞株;其中,所述含10%血清低糖培養(yǎng)基配制方法為:以質(zhì)量百分百計,將89%的DMEM/Low培養(yǎng)基、10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素溶液混合后獲得。進(jìn)一步,如本發(fā)明所述構(gòu)建多西環(huán)素調(diào)控表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法中,所述細(xì)胞密度為70%~80%的293T細(xì)胞是這樣獲得的:轉(zhuǎn)染前24h,用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞,以含10%血清低糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5x106細(xì)胞/15ml,接種于直徑為10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞密度達(dá)70%~80%時即可用于轉(zhuǎn)染;并于轉(zhuǎn)染前2h更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。進(jìn)一步,如本發(fā)明所述構(gòu)建多西環(huán)素調(diào)控表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法中,步驟2.1所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增是指:PCR反應(yīng)體系:5×PSBuffer10μl,2.5mMeach的dNTPMix4μl,10μM的上游引物1μl,10μM的下游引物1μl,10ng/μL的模板1μl,PrimeSTARHSDNApolymerase0.5μl,ddH2O補(bǔ)足至50μl;PCR反應(yīng)條件:98℃預(yù)熱5min;98℃10s,55℃10s,72℃90s,共30個循環(huán);4℃延伸。進(jìn)一步,如本發(fā)明所述構(gòu)建多西環(huán)素調(diào)控表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法中,步驟2.2所述配制線性化載體DNA和目的基因重組反應(yīng)體系為:5×CEIIBuffer2μl,濃度為800ng/μL線性化載體DNA2.5μl,濃度為700ng/μL的目的基因CMV-rtTA1μl,ExnaseII1μl,以ddH2O補(bǔ)足至10μl。本發(fā)明在Clontech公司提供的Tet-on表達(dá)系統(tǒng)基礎(chǔ)之上要進(jìn)行改造,將TRE-minCMV調(diào)控的c-met和ALB啟動子調(diào)控的GFP表達(dá)序列構(gòu)建于同一質(zhì)粒中(該質(zhì)粒為Tet-on系統(tǒng)的反應(yīng)質(zhì)粒),并包裝為慢病毒顆粒,以建立多西環(huán)素控制的c-met表達(dá)系統(tǒng),所獲得的合成基因序列TRE-minCMV啟動子-c-met-ALB啟動子-GFP,該序列含有兩個啟動子TRE-minCMV與ALB,分別調(diào)控c-met與GFP的表達(dá);TRE-minCMV啟動子在rtTA蛋白存在條件下接受多西環(huán)素的調(diào)控,即可用通過多西環(huán)素誘導(dǎo)c-met表達(dá),而ALB啟動子為肝細(xì)胞特異性啟動子,通過該啟動子調(diào)控GFP表達(dá)有利于篩選出能夠分化為肝細(xì)胞的骨髓BMSCs,因此該系統(tǒng)具有通過ALB啟動子調(diào)控GFP在具有類肝細(xì)胞分化潛力BMSCs靶向表達(dá)的功能。本發(fā)明中,兩個啟動子均發(fā)揮其相應(yīng)作用,利用該系統(tǒng)篩選出GFP(+)BMSCs回輸體內(nèi)治療肝衰竭模型,研究BMSCs順HGF濃度定向歸巢和分化能力,以及該能力與HGF/c-met軸表達(dá)水平之間的量效關(guān)系;對于研究該細(xì)胞株回輸體內(nèi)治療肝衰竭,BMSCs順HGF濃度定向歸巢和分化能力,以及該能力與HGF/c-met軸表達(dá)水平之間的量效關(guān)系具有重要意義。附圖說明圖1為基因序列TRE-minCMV啟動子-c-met-ALB啟動子-GFP結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為通過流式細(xì)胞儀篩選具有肝細(xì)胞分化潛力的GFP(+)Tet-on-c-metBMSCs鏡檢圖。圖3為Real-timePCR法檢測c-metmRNA的表達(dá)結(jié)果示意圖。圖4為Western-blot法檢測c-met蛋白的電泳結(jié)果示意圖。圖5為Western-blot法檢測c-met蛋白的表達(dá)結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖,對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行更進(jìn)一步的描述。以下實(shí)施例涉及實(shí)驗材料與儀器來源:4周齡SPF級SD雄性大鼠購于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗動物中心;293T細(xì)胞由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染病科李軍教授贈送;胎牛血清購自Corning公司;LowDMEM購自Hyclone公司;pTet-OndvancedVector載體、In-FusionTMPCRCloningKit購自Clotech公司;慢病毒載體GV211(1μg/μL)、基因序列TRE-minCMV啟動子-c-met-ALB啟動子-GFP由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成;慢病毒載體GV211、病毒包裝輔助質(zhì)粒(Helper1.0、Helper2.0)購于購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司;1kpDNAladderMarker購自Fermentas公司;250bpDNAladderMarker購自捷瑞公司;Taqpolymerase購自SinoBio公司;dNTP購自Takara;限制性內(nèi)切酶購自NEB公司;Plasmid抽提Kit購自promega;嘌呤霉素購自amresco公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化公司;無血清培養(yǎng)基、PBS購于Hyclone公司;病毒保存液購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司;胰蛋白酶購于Sigma公司;PCR儀購自AppliedBiosystems公司;positiveclone測序由美季生物技術(shù)完成;穩(wěn)壓DNA電泳儀購自BioRad公司;凝膠成像儀購自天能公司.實(shí)施例涉及的培養(yǎng)基來源/制備方法:含10%血清低糖培養(yǎng)基配方:以質(zhì)量百分百計,將89%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的DMEM/Low培養(yǎng)基(購自Hyclone公司)、10%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的胎牛血清(購自Corning公司)和1%(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的青霉素-鏈霉素溶液(購自碧云天公司,100×雙抗)混合后獲得;以下實(shí)施例涉及的DNA序列:SEQIDNO.1:5’-GGATCCCTTGACATGCTCCCCGGGTA-3’;SEQIDNO.2:5’-ACCGGTTTACCCGGGGAGCATGTCAA-3’;SEQIDNO.3(ALB啟動序列,237bp):SEQIDNO.4(PminCMV序列,60bp):taggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgc60SEQIDNO.5(TRE序列,250bp):SEQIDNO.6(GFP序列,720bp):實(shí)施例1大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的提取與培養(yǎng)選取4周齡SPF級SD雄性大鼠,頸椎脫臼法處死,取出脛骨和股骨,去除兩端干骺端,用5毫升注射器吸取生理鹽水沖洗骨髓腔于50毫升離心管中,1000rpm離心沖洗液10min后,采用3ml含10%血清低糖培養(yǎng)基沖懸離心管底部沉淀,將液體加入到含3ml大鼠淋巴細(xì)胞分離液的15毫升離心管中,2000rpm離心20min后,吸取離心管中第三層白膜層,并加入到含有其4倍體積生理鹽水的離心管中,1000rpm離心10min,含10%血清低糖培養(yǎng)基沖懸底部沉淀接種到培養(yǎng)皿中,并將細(xì)胞放入37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)施例2Tet-OnAdvancedBMSCs細(xì)胞株的建立1、構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體GV211-CMV-rtTA1.1分別以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2為上下游引物,以pTet-OnadvancedVector載體為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系如表1所示,反應(yīng)條件如表2所示;將反應(yīng)物混合后輕輕吹打混勻,置于PCR儀中擴(kuò)增目的基因rtTA及上游CMV啟動子,并以試劑盒回收,測序正確的擴(kuò)增產(chǎn)物即為目的基因CMV-rtTA。表1PCR反應(yīng)體系表2PCR反應(yīng)條件表3慢病毒載體GV211酶切體系試劑體積(μl)ddH2O4210×CutSmartBuffer5慢病毒載體GV211(1μg/μL)2BamHI、AgeI酶(10U/μl)1Total501.2根據(jù)表3,配制50μl酶切體系,按表3順序依次加入各種試劑,用移液器輕輕吹打混勻,置于37℃反應(yīng)3h,以獲得慢病毒載體GV211的酶切產(chǎn)物,以獲得酶切后的線性化載體DNA;表4重組慢病毒表達(dá)載體GV211-CMV-rtTA體系試劑體積(μl)ddH2O3.55×CEIIBuffer2酶切后的線性化載體DNA2.5目的基因CMV-rtTA1ExnaseTMII1Total101.3以步驟1.2獲得的酶切后的線性化載體DNA和步驟1.1獲得的目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物于冰水浴中配制如表4所示的反應(yīng)體系,用移液器輕輕吹打混勻,避克產(chǎn)生氣泡,于37℃反應(yīng)30min,獲得由線性化載體和目的基因CMV-rtTA重組形成的慢病毒表達(dá)載體GV211-CMV-rtTA。2、rtTA基因重組慢病毒包裝、濃縮與純化2.1轉(zhuǎn)染前24h,用胰蛋白酶(購于Gibco公司)消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞,以含10%血清低糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約5×106細(xì)胞/15ml,重新接種于直徑為10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);24h后待細(xì)胞密度達(dá)70%~80%時即可用于轉(zhuǎn)染;并于轉(zhuǎn)染前2h更換為無血清培養(yǎng)基;2.2向一滅菌離心管中加入步驟1獲得的GV211-CMV-rtTA20μg、pHelper1.015μg、pHelper2.010μg,以InvitrogenLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑補(bǔ)足至1ml,室溫孵育15min;然后滴入細(xì)胞密度為70%~80%的293T細(xì)胞中,于37℃,5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h,然后棄去培養(yǎng)基,加入含10%血清低糖培養(yǎng)基,于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48-72h;2.3收集轉(zhuǎn)染后48h(轉(zhuǎn)染時即為0h計起)的293T細(xì)胞上清液;于4℃,4000g離心10min,除去細(xì)胞碎片;再以0.45μm濾器過濾上清液于40ml的超速離心管中;然后分別配平樣品,將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機(jī)內(nèi),設(shè)置離心參數(shù)為25000rpm,離心時間為2h,離心溫度控制在4℃;離心結(jié)束后,棄去上清,盡量去除殘留在管壁上的液體,加入病毒保存液,即獲得rtTA基因慢病毒;2.4基因慢病毒滴度測定:采用熒光法測定病毒滴度,測定前一天,使用293T貼壁細(xì)胞鋪板,96孔板,每孔4×104個細(xì)胞;準(zhǔn)備7個無菌的EP管,分別編號1-7,每管中加入90μl無血清培養(yǎng)基,取待測定的rtTA基因慢病毒液原液10μl加入到1號管中,混勻后,取10μl加入到2號管中,繼續(xù)相同的操作直到第7管;選取所需的細(xì)胞孔,棄去各孔90μl培養(yǎng)基,依次加入90μl稀釋好的7個管中的病毒溶液,培養(yǎng)箱培養(yǎng),4天后,觀察熒光表達(dá)情況,熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少,根據(jù)公式:病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量,即可算出該病毒滴度為2×108TU/ml。2.5確定嘌呤霉素篩選濃度:取對數(shù)生長期的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),用2mlPBS清洗兩遍后,加入2ml胰蛋白酶消化2min,顯微鏡下觀察BMSCs已全部消化下來后,加入2ml含10%血清低糖培養(yǎng)基終止消化,并將其加入到15ml無菌離心管中,1000rpm離心5min,棄去上清,加入6ml含10%血清低糖培養(yǎng)基沖懸底部沉淀,并將其接種于6孔板中。待各孔細(xì)胞長滿后,棄去原培養(yǎng)基,梯度加入含嘌呤霉素的含10%血清低糖培養(yǎng)基2ml,各孔嘌呤霉素濃度分別為0、6、7、8、9、10μg/ml;然后于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng);細(xì)胞每兩天更換一次含相應(yīng)濃度嘌呤霉素的含10%血清低糖培養(yǎng)基,并每天對各孔細(xì)胞生長情況進(jìn)行觀察;4天可以殺死相應(yīng)孔中全部細(xì)胞的嘌呤霉素最低濃度,本實(shí)施例中最終藥物篩選濃度為9μg/ml。3、rtTA基因重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs及轉(zhuǎn)染后嘌呤霉素篩選3.1轉(zhuǎn)染前一天,將處于對數(shù)生長期的BMSCs接種于96孔板中,每孔加入4~5×104個細(xì)胞(接種密度為細(xì)胞3~4天長滿為宜)及100μl含10%血清低糖培養(yǎng)基,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到25%-35%時,棄去原培養(yǎng)基,以感染復(fù)數(shù)(MOI=100)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,即向各孔中加入10μl步驟2.3獲得的rtTA基因慢病毒(病毒滴度為2×108TU/ml)、10μl終濃度為5μg/ml的ploybrene增強(qiáng)液和80μl的含10%血清低糖培養(yǎng)基,于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);3.2感染12h后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入100μl含10%血清低糖培養(yǎng)基;在轉(zhuǎn)染48h后,即可用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況;感染72h后,再次以含10%血清低糖培養(yǎng)基換液,并向每孔加入終濃度為9μg/ml的嘌呤毒素,藥物篩選周期為一周,并在熒光顯微鏡下觀察效果,待顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光陽性率達(dá)100%后,將藥物篩選濃度維持在1.8μg/ml,即獲得穩(wěn)定高效表達(dá)rtTA蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株(即Tet-OnAdvancedBMSCs)。實(shí)施例3GFP(+)Tet-on-c-metBMSCs細(xì)胞株的建立1、構(gòu)建慢病毒Len-TREminCMV-c-met/ALB-GFP1.1交由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成基因序列TRE-minCMV啟動子-c-met-ALB啟動子-GFP,其結(jié)構(gòu)如圖1所示,ALB啟動序列(237bp)如SEQIDNO.3所示,minCMV啟動子序列(60bp)如SEQIDNO.4所示,TRE序列(250bp)如SEQIDNO.5所示,GFP序列(720bp)如SEQIDNO.6所示;1.2配制線性化載體DNA和目的基因重組反應(yīng)體系:5×CEIIBuffer2μl,實(shí)施例2步驟1.2獲得的酶切后的線性化載體DNA(濃度800ng/μL)2.5μl,TRE-minCMV啟動子-c-met-ALB啟動子-GFP(濃度800ng/μL)1μl,ExnaseII1μl,ddH2O補(bǔ)足至10μl;將上述體系至于37℃反應(yīng)30min,即獲得慢病毒表達(dá)載體GV211-TREminCMV-c-met/ALB-GFP;1.3向離心管中加入上述GV211-TREminCMV-c-met/ALB-GFP20μg、pHelper1.015μg、pHelper2.010μg,以InvitrogenLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑補(bǔ)足至1ml,室溫下孵育15min;然后滴入細(xì)胞密度為70%~80%的293T細(xì)胞中,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h,然后棄去原培養(yǎng)基,加入含10%血清低糖培養(yǎng)基,于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48-72h;1.4收集上述293T細(xì)胞上清液,于4℃,4000g離心10min;取上清液以0.45μm濾器過濾,收集濾液于4℃,25000rpm,離心2h;棄去上清,加入病毒保存液,即獲得慢病毒Len-TREminCMV-c-met/ALB-GFP(病毒滴度為2×108TU/ml);2、慢病毒Len-TREminCMV-c-met/ALB-GFP轉(zhuǎn)染Tet-OnAdvancedBMSCs細(xì)胞株2.1轉(zhuǎn)染前一天,將處于對數(shù)生長期的Tet-OnAdvancedBMSCs接種于96孔板中,每孔加入4~5×104個細(xì)胞(接種密度為細(xì)胞3~4天長滿為宜)及100μl含10%血清低糖培養(yǎng)基,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到25%-35%時,棄去原培養(yǎng)基,以感染復(fù)數(shù)(MOI=100)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,即向各孔中加入10μl步驟1.4獲得的慢病毒Len-TREminCMV-c-met/ALB-GFP、10μl終濃度為5μg/ml的ploybrene增強(qiáng)液和80μl的含10%血清低糖培養(yǎng)基,于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);2.2感染12h后,棄去培養(yǎng)基,每孔加入100μl含10%血清低糖培養(yǎng)基;在轉(zhuǎn)染48h后,即可用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況;感染72h后,再次以含10%血清低糖培養(yǎng)基換液,并向每孔加入終濃度為9μg/ml的嘌呤毒素,藥物篩選周期為一周,并在熒光顯微鏡下觀察效果,待顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光陽性率達(dá)100%后,將藥物篩選濃度維持在1.8μg/ml,即獲得西環(huán)素調(diào)控表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株(即GFP(+)Tet-on-c-metBMSCs細(xì)胞株)。實(shí)施例41、流式細(xì)胞儀篩選具有肝細(xì)胞分化潛力的GFP(+)Tet-on-c-metBMSCs實(shí)驗組:實(shí)施例2獲得的GFP(+)Tet-on-c-metBMSCs;對照組:無基因修飾的BMSCs;(實(shí)驗方法參考文獻(xiàn):XiaoLK,etal.StemCellsInt.2016;2016:8906945)。實(shí)驗結(jié)果如圖2所示,其中,圖2A為普通顯微鏡下觀察GFP(+)Tet-on-c-metBMSCs形態(tài)示意圖,可見該細(xì)胞生長良好;圖2B為熒光顯微鏡下觀察部分GFP(+)Tet-on-c-metBMSCs,可見其可表達(dá)GFP;圖2C為對照組GFP陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù);圖2D為實(shí)驗組GFP陽性表達(dá)細(xì)胞。實(shí)驗組獲得GFP的陽性表達(dá),利用流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果示GFP(+)BMSCs占總細(xì)胞數(shù)約57%。說明獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pALB-GFP質(zhì)粒的BMSCs中約57%細(xì)胞具備表達(dá)ALB的功能,即具有潛在分化為肝細(xì)胞的能力,另一方面也說明約43%細(xì)胞缺少ALB啟動子發(fā)揮作用的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,推測可能不具備分化類肝細(xì)胞的潛力。2、通過多西環(huán)素體外誘導(dǎo)GFP(+)Tet-on-c-metBMSCs細(xì)胞株表達(dá)c-metGFP(+)Tet-on-c-metBMSCs細(xì)胞株體外培養(yǎng),在其含10%血清的低糖培養(yǎng)基中加不同濃度的多西環(huán)素(分別為0.01、0.1、1、10、100ng/ml),并將細(xì)胞放入37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h后收集細(xì)胞。通過Real-timePCR法檢測c-metmRNA的表達(dá)情況(參考文獻(xiàn):ZhuX,etal.CellDeathDis.2016;7(6):e2239),結(jié)果如圖3所示,可見,c-metmRNA表達(dá)水平與多西環(huán)素的濃度相關(guān),即隨著多西環(huán)素濃度的增加(0.1、1、10ng/ml),表達(dá)水平逐步升高,10ng/ml與100ng/ml的多西環(huán)素濃度誘導(dǎo)的c-met表達(dá)水平無明顯差異,圖3中P<0.01是指兩組具有統(tǒng)計學(xué)差異。通過Western-blot法檢測c-met蛋白的表達(dá)情況(檢參考文獻(xiàn):ZhuX,etal.CellDeathDis.2016;7(6):e2239),結(jié)果如圖4所示,隨著多西環(huán)素濃度的增加,圖4中,從左至右1-5分別為細(xì)胞依次加入0.01、0.1、1、10、100ng/ml多西環(huán)素后,Western-blot法檢測的c-met蛋白表達(dá)量也逐步升高。圖5為Western-blot法檢測c-met蛋白的表達(dá)情況示意圖,可見隨著多西環(huán)素濃度的增加(0.1、1、10ng/ml),c-met蛋白表達(dá)量逐步升高,10ng/ml的多西環(huán)素誘導(dǎo)c-met表達(dá)量達(dá)到最高水平,結(jié)果說明c-met基因高表達(dá)的最佳多西環(huán)素誘導(dǎo)濃度為10ng/ml。本發(fā)明具體應(yīng)用途徑很多,以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對于本
      技術(shù)領(lǐng)域
      的普通技術(shù)人員來說,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以作出若干改進(jìn),這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>江蘇省人民醫(yī)院<120>構(gòu)建多西環(huán)素調(diào)控表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法<130>6<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>1ggatcccttgacatgctccccgggta26<210>2<211>26<212>DNA<213>人工合成<400>2accggtttacccggggagcatgtcaa26<210>3<211>237<212>DNA<213>人工合成<400>3caaagtcttgtgcatgggggtgggggtggggttagaggggaacagctccagatggcaaac60atacgcaagggatttagtcaaacaactttttggcaaagatggtatgattttgtaatgggg120taggaaccaattgaaatgcgaggtaagtatggttaatgatctacagttattggttaaaga180agtatattagagcgagtctttctgcacacacgatcacctttcctatcaaccccacta237<210>4<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>4taggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgc60<210>5<211>250<212>DNA<213>人工合成<400>5cgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgata60gagaacgatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccc120tatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgatagagaacgtatgtc180gagtttatccctatcagtgatagagaacgtatgtcgagtttactccctatcagtgataga240gaacgtatgt250<210>6<211>720<212>DNA<213>人工合成<400>6atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180ctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag240cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc300ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360gtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcac420aagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac480ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgcc540gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa720當(dāng)前第1頁1 2 3 
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