本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在水相中測(cè)定蛋白質(zhì)的熒光探針及其合成方法和檢測(cè)方法，具體涉及一種雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)是一類(lèi)重要的生物大分子，是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體內(nèi)一切組織的基礎(chǔ)物質(zhì)，約占人體的18％，具有修補(bǔ)組織、維持機(jī)體正常新陳代謝及各類(lèi)物質(zhì)在體內(nèi)的輸送等諸多功能，與各種形式的生命活動(dòng)有著密切的聯(lián)系，在生物體內(nèi)具有特殊的地位。因此，對(duì)蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別和定量分析有助于推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物診斷以及病原檢測(cè)等方面的發(fā)展，這對(duì)于人類(lèi)探索生命奧秘起著重要的作用。

定量分析痕量蛋白質(zhì)的方法有分光光度法、熒光光度法、共振瑞利散射光譜法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法、等離子體共振法、納米粒子法、過(guò)渡金屬羰基碎片法等。而利用熒光傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法備受關(guān)注，主要是因?yàn)闊晒鈧鞲衅骶哂羞x擇性好、靈敏度高、動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍寬、可實(shí)時(shí)在線檢測(cè)、能夠成像和輸出信號(hào)豐富等優(yōu)點(diǎn)。然而現(xiàn)有的可檢測(cè)蛋白質(zhì)的熒光探針?lè)肿訉?duì)分子合成技術(shù)有著較高的依賴(lài)，且大多疏水性較強(qiáng)，限制了其在水溶液中的應(yīng)用以及對(duì)生物檢測(cè)對(duì)象的傳感。另外，蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多，對(duì)蛋白質(zhì)的區(qū)分識(shí)別則更具有重要意義。然而，目前已發(fā)展的幾種可對(duì)蛋白質(zhì)區(qū)分識(shí)別的熒光傳感器多為陣列型傳感器，即利用多個(gè)熒光探針組合而成的傳感器陣列，通過(guò)采集不同傳感器的熒光響應(yīng)信號(hào)，形成針對(duì)特定蛋白的指紋識(shí)別圖譜，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)各種蛋白質(zhì)的區(qū)分識(shí)別。陣列型傳感存在樣品消耗量大、數(shù)據(jù)采集復(fù)雜等問(wèn)題。因此，發(fā)展能夠有效區(qū)分識(shí)別蛋白質(zhì)的單一型熒光傳感器就顯得非常具有挑戰(zhàn)性和優(yōu)越性。

目前，基于苝酰亞胺衍生物聚集體構(gòu)象調(diào)控的熒光傳感器對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行區(qū)分檢測(cè)方面的報(bào)道很少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針及其合成方法和應(yīng)用，該熒光探針靈敏度高、區(qū)分性好、測(cè)試范圍廣、樣品消耗量小、數(shù)據(jù)采集簡(jiǎn)單；該合成方法操作簡(jiǎn)便，成本低，對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單；該熒光探針能夠應(yīng)用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)和區(qū)分識(shí)別工作中。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明熒光探針采用以下技術(shù)方案：

該熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下：

式中，n＝2、3或4。

本發(fā)明合成方法采用以下技術(shù)方案：包括以下步驟：

1)首先在保護(hù)氣氛下，將芘磺?；苌锏腘-甲基吡咯烷酮溶液加入到苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入無(wú)水醋酸鋅，得到混合溶液；其中芘磺?；苌锖推p酐的摩爾比為(2～4):1；

2)步驟1)得到的混合溶液在攪拌條件下并在150～200℃下加熱回流10～15h，待加熱回流得到的反應(yīng)液冷卻到室溫后，過(guò)濾得濾液；濾液經(jīng)酸洗出現(xiàn)沉淀，抽濾得到濾餅，將濾餅洗滌干燥后，得到雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針。

進(jìn)一步地，芘磺?；苌锏闹苽洳襟E具體包括：

a)在保護(hù)氣氛及冰浴條件下，將芘磺酰氯的三氯甲烷溶液滴加到二氨基含氧烷烴的三氯甲烷溶液中，滴加完畢后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2～8h；

b)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液洗滌并干燥，再依次酸洗、堿洗和萃取，得到有機(jī)層，旋干，制得結(jié)構(gòu)式如下的芘磺酰基衍生物：

式中，n＝2、3或4。

進(jìn)一步地，步驟a)中芘磺酰氯與二氨基含氧烷烴的摩爾比為1:(5～10)，二氨基含氧烷烴為1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷、3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二胺或3,6,9,12-四氧雜十六烷-1,16-二胺；步驟b)中的洗滌是用飽和食鹽水洗6～7次，干燥是用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，酸洗是采用1mol/L鹽酸洗滌，堿洗是采用3mol/L氫氧化鈉水溶液進(jìn)行洗滌。

進(jìn)一步地，步驟a)中，調(diào)節(jié)滴加速度為5～8s/滴。

進(jìn)一步地，保護(hù)氣氛采用氮?dú)?、氬氣或氖氣，保護(hù)氣氛的流速為0.5～0.8mL/s。

進(jìn)一步地，步驟1)中，無(wú)水醋酸鋅的添加量為苝酐摩爾量的0.65～2倍。

進(jìn)一步地，步驟2)中，酸洗是將濾液滴加到2mol/L的鹽酸溶液中，產(chǎn)生沉淀。

進(jìn)一步地，酸洗后抽濾得到的濾餅依次用甲醇及二次水淋洗；濾餅洗滌干燥后經(jīng)過(guò)洗脫劑進(jìn)行過(guò)柱分離純化，其中洗脫劑采用二氯甲烷、甲醇和三乙胺按體積比為(20～60):1:1配成的混合溶劑。

本發(fā)明熒光探針在檢測(cè)蛋白質(zhì)中的應(yīng)用，所述的蛋白質(zhì)包括胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細(xì)胞色素c。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明公開(kāi)了一種雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI，該探針以對(duì)微環(huán)境敏感、熒光量子產(chǎn)率高、熒光輸出信號(hào)豐富的芘以及具有良好的光化學(xué)穩(wěn)定性、高的熱穩(wěn)定性、寬的吸收波長(zhǎng)范圍的苝酰亞胺為雙報(bào)告基團(tuán)，通過(guò)引入寡聚乙氧基的親水性連接臂，制備了具有多個(gè)發(fā)射帶的熒光衍生物。該探針?lè)肿又械能呕鶊F(tuán)可在480-500nm發(fā)射激基締合物峰，與苝酰亞胺分子的吸收峰可以很好的重合，使得芘和苝酰亞胺基團(tuán)形成一對(duì)很好的能量供體和受體，實(shí)現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，有望賦予該熒光探針?lè)肿釉趩我患ぐl(fā)波長(zhǎng)下具有多個(gè)發(fā)射和檢測(cè)信號(hào)，從而使得傳感體系具有多波長(zhǎng)交互響應(yīng)的識(shí)別性能，為創(chuàng)建新型的表面活性劑調(diào)控的熒光傳感器提供了可能。該雙芘修飾苝酰亞胺衍生物作為熒光探針，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性好、快的響應(yīng)速度和優(yōu)異的識(shí)別性能。

本發(fā)明公開(kāi)的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針的合成方法中采用雙芘修飾苝酰亞胺分子，苝酰亞胺分子具有寬的波長(zhǎng)吸收范圍、較高的熒光量子產(chǎn)率以及好的光化學(xué)穩(wěn)定性，并且由于其強(qiáng)的π-π堆積作用，使其在水溶液中具有特殊的自組裝能力，可形成特定的非共價(jià)超分子聚集體；芘同樣具有良好的熒光發(fā)射性能和較高的熒光量子產(chǎn)量，其所形成的激基締合物可作為苝酐的能量供體，與苝酐進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，合成雙芘修飾的苝酐衍生物可具有芘的單體發(fā)射、激基締合物發(fā)射和苝酐發(fā)射的多發(fā)射帶光譜，且光譜形狀與探針?lè)肿拥木奂癄顟B(tài)密切相關(guān)，從而賦予熒光探針?lè)肿佣鄠€(gè)響應(yīng)信號(hào)，使得傳感體系具有多波長(zhǎng)交互響應(yīng)的識(shí)別性能，創(chuàng)建新型的表面活性劑調(diào)控的熒光傳感體系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種蛋白質(zhì)的區(qū)分傳感；通過(guò)本發(fā)明構(gòu)建的熒光化學(xué)傳感體系具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、區(qū)分性好、樣品消耗量小、數(shù)據(jù)采集簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明合成方法操作簡(jiǎn)便，區(qū)分性好，成本低，對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單。

本發(fā)明中的熒光探針具有多個(gè)檢測(cè)信號(hào)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)非金屬蛋白中的胃蛋白酶(PS)、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(O-egg)和β-乳球蛋白(BLG)的區(qū)分識(shí)別，以及金屬蛋白中的鐵蛋白(Ferr)、肌紅蛋白(Myo)、血紅蛋白(Hb)和細(xì)胞色素c(Cyt-c)的區(qū)分識(shí)別。熒光探針PEPBI對(duì)四種非金屬蛋白胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白和β-乳球蛋白的檢出限分別可達(dá)到0.61μmol/L(21.1μg/mL)、0.26μmol/L(17.3μg/mL)、0.46μmol/L(20.4μg/mL)和0.61μmol/L(21.4μg/mL)。熒光探針PEPBI對(duì)四種金屬蛋白鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細(xì)胞色素c的檢出限分別可達(dá)到61.8nmol/L(27.2μg/mL)、0.13μmol/L(2.2μg/mL)、41.6nmol/L(2.7μg/mL)和1.14μmol/L(14.1μg/mL)。

【附圖說(shuō)明】

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測(cè)胃蛋白酶溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測(cè)牛血清蛋白溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測(cè)卵清蛋白溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測(cè)β-乳球蛋白溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測(cè)細(xì)胞色素c溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測(cè)鐵蛋白溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測(cè)血紅蛋白溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖8是本發(fā)明實(shí)施例1制備的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針檢測(cè)肌紅蛋白溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖9是熒光探針PEPBI在不同波長(zhǎng)處(380、400、421、480、544、577nm)對(duì)四種非金屬蛋白質(zhì)(濃度為10μM)的熒光變化log(I/I₀)值的柱狀圖。

圖10是熒光探針PEPBI在不同波長(zhǎng)處(380、400、421、480、544、577nm)對(duì)四種金屬蛋白質(zhì)(濃度為1.0μM)的熒光變化log(I/I₀)值的柱狀圖。

【具體實(shí)施方式】

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明公開(kāi)了一種雙芘修飾苝酰亞胺衍生物的熒光探針，該熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下：

式中，n為2或3或4。

上述基于雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針的合成方法包括下述步驟：

1)合成芘磺?；苌?/p>

在流速為0.5～0.8mL/s的保護(hù)氣氛保護(hù)和冰浴條件下，將芘磺酰氯的三氯甲烷溶液以5～8s/滴的滴加速度滴加到二氨基含氧烷烴的三氯甲烷溶液中，其中保護(hù)氣氛采用氮?dú)?、氬氣或氖氣等其他惰性氣體，芘磺酰氯與二氨基含氧烷烴的摩爾比為1:(5～10)；滴加完后室溫?cái)嚢?～8h，將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6～7次，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，用1mol/L鹽酸進(jìn)行洗滌，再用3mol/L氫氧化鈉水溶液進(jìn)行中和，使pH值在7～8之間。用三氯甲烷萃取，收集萃取后的有機(jī)層，旋干，得到式Ⅰ所示的芘磺?；苌铮浞磻?yīng)方程式如下：

上述的二氨基含氧烷烴為1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷、3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二胺或3,6,9,12-四氧雜十六烷-1,16-二胺中的任意一種。

2)合成雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針

在流速為0.5～0.8mL/s的氮?dú)鈿夥毡Ｗo(hù)下，將芘磺酰基衍生物的N-甲基吡咯烷酮溶液加入到苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入催化劑量的無(wú)水醋酸鋅，芘磺酰基衍生物和苝酐的摩爾比為(2～4):1，無(wú)水醋酸鋅的添加量約為苝酐摩爾量的0.65～2倍；磁力攪拌器攪拌，在150～200℃下加熱回流10～15h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，過(guò)濾，收集濾液。再將濾液滴加到2mol/L的鹽酸溶液中，出現(xiàn)沉淀，攪拌，過(guò)夜。抽濾得到濾餅，依次用二次水及甲醇對(duì)濾餅進(jìn)行多次淋洗，收集濾餅。然后再用二氯甲烷、甲醇和三乙胺按體積比為(20～60):1:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物。之后，干燥，得到式Ⅱ所示的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針，其反應(yīng)方程式如下：

上述的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在檢測(cè)蛋白質(zhì)中的用途，所述的蛋白質(zhì)為胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細(xì)胞色素c，其檢測(cè)方法如下：

1、配制溶液

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的CTAB，溶于HEPES緩沖液(10mmol/L，pH 7.4)中，配制成20mmol/L的CTAB溶液。將此溶液稀釋成濃度為1.5mmol/L的溶液備用。量取25mL 1.5mmol/L的CTAB溶液，加入100μL濃度為2.5×10^-4mol/L雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI的二甲亞砜溶液，配制成熒光探針濃度為1μmol/L、表面活性劑CTAB濃度為1.5mmol/L的傳感體系，即PEPBI/CTAB體系，分別對(duì)非金屬蛋白中的胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白以及金屬蛋白中的鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細(xì)胞色素c進(jìn)行區(qū)分檢測(cè)。

分別稱(chēng)取一定質(zhì)量的胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細(xì)胞色素c溶于10mmol/L HEPES緩沖溶液中，配制成2.5mmol/L胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、細(xì)胞色素c溶液以及0.25mmol/L鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白溶液。

2、繪制標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)圖譜

分別量取2.5mL的PEPBI/CTAB(1μmol/L/1.5mmol/L)熒光探針溶液于比色皿中，向其中分別滴加2.5mmol/L胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、細(xì)胞色素c溶液以及0.25mmol/L鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白溶液，用毛細(xì)管攪拌使其混合均勻，所得到的溶液中胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、細(xì)胞色素c的濃度均為0～20μmol/L，鐵蛋白、血紅蛋白濃度均為0～1μmol/L，肌紅蛋白的濃度為0～2μmol/L。熒光光譜的測(cè)試均在單光子熒光光譜儀(FS5，Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發(fā)波長(zhǎng)為352nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫分別為3.5和2.7nm。待溶液達(dá)到平衡后，分別繪制熒光強(qiáng)度隨胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細(xì)胞色素c濃度變化的熒光光譜圖，并通過(guò)采集雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI在380nm、400nm、421nm、480nm、544nm、577nm處的熒光強(qiáng)度，算得四種非金屬蛋白質(zhì)濃度為10μmol/L時(shí)傳感體系的log(I/I₀)值以及四種金屬蛋白質(zhì)濃度為1.0μmol/L時(shí)傳感體系的log(I/I₀)值，分別繪制非金屬蛋白濃度為10μmol/L、金屬蛋白濃度為1.0μmol/L時(shí)不同波長(zhǎng)處log(I/I₀)值的標(biāo)準(zhǔn)柱狀圖。

本發(fā)明合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針的化學(xué)穩(wěn)定性好、響應(yīng)速度快、區(qū)分性好、樣品消耗量小、數(shù)據(jù)采集簡(jiǎn)單，可直接進(jìn)行檢測(cè)，如FS5、FLS920型單光子計(jì)數(shù)時(shí)間分辨熒光光譜儀或其他類(lèi)似的光學(xué)檢測(cè)器，分別實(shí)現(xiàn)對(duì)胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白和β-乳球蛋白以及對(duì)鐵蛋白、肌紅蛋白、血紅蛋白和細(xì)胞色素c的區(qū)分檢測(cè)。

實(shí)施例1

合成結(jié)構(gòu)式如下的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針：

其合成方法包括如下步驟：

1)合成芘磺酰基衍生物

在流速為0.6mL/s的氮?dú)獗Ｗo(hù)和冰浴攪拌條件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口燒瓶中加入9.97mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后將0.997mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按6s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯與1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩爾比為1:10。滴加完后室溫?cái)嚢?小時(shí)，停止反應(yīng)后，將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6～7次，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，再用1mol/L鹽酸進(jìn)行洗滌，再用3mol/L氫氧化鈉水溶液進(jìn)行中和，使溶液pH值在7，之后用三氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺?；苌铮浞磻?yīng)方程式如下：

2)合成雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針

在流速為0.6mL/s的氮?dú)鈿夥毡Ｗo(hù)下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺?；苌?.64mmol，將其加入到12mL溶有0.32mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入催化劑量的無(wú)水醋酸鋅0.208mmol，此時(shí)，芘磺?；苌锖推p酐的摩爾比為2:1，無(wú)水醋酸鋅的添加量約為苝酐摩爾量的0.65倍；然后用磁力攪拌器攪拌，在180℃下加熱回流15h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，過(guò)濾，收集濾液。然后再將其滴到300mL的2mol/L鹽酸溶液中，攪拌過(guò)夜，抽濾，依次用二次水及甲醇對(duì)濾餅進(jìn)行多次淋洗。收集濾餅，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按體積比為40:1:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物。之后，得到式I所示的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針，其反應(yīng)方程式如下：

上述結(jié)構(gòu)式I的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針的核磁數(shù)據(jù)為：¹H NMR(CDCl₃/Me₄Si,600MHz),δ(ppm):8.88(d,1H,pyrene),8.35(d,1H,pyrene),8.16(s,1H,pyrene),8.14(s,1H,perylene),8.03(d,1H,perylene),7.97(d,1H,pyrene),7.87(d,1H,perylene),7.80(s,1H,perylene),7.65(t,3H,pyrene),5.95(s,1H,-NH-),3.26-4.44(m,12H,-CH₂NH-and-CH₂O-).

實(shí)施例2

合成結(jié)構(gòu)式如下的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針：

其合成方法步驟如下：

在實(shí)施例1的合成芘磺?；苌锊襟E1中，將所用的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷用等摩爾質(zhì)量的3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二胺替換，其它步驟與相應(yīng)的實(shí)施例1相同。

實(shí)施例3

合成結(jié)構(gòu)式如下的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針：

其合成方法步驟如下：

在實(shí)施例1的合成芘磺?；苌锊襟E1中，將所用的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷用等摩爾質(zhì)量的3,6,9,12-四氧雜十六烷-1,16-二胺替換，其它步驟與相應(yīng)的實(shí)施例1相同。

實(shí)施例4

1)合成芘磺?；苌?/p>

在流速為0.5mL/s的氬氣保護(hù)和冰浴攪拌條件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口燒瓶中加入5mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后將1mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按5s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯與1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩爾比為1:5。滴加完后室溫?cái)嚢?小時(shí)，停止反應(yīng)后，將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6～7次，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，再用1mol/L鹽酸進(jìn)行洗滌，再用3mol/L氫氧化鈉水溶液進(jìn)行中和，使溶液pH值在7.5，之后用三氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺?；苌?，其反應(yīng)方程式如下：

2)合成雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針

在流速為0.5mL/s的氬氣氣氛保護(hù)下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺?；苌?.63mmol，將其加入到12mL溶有0.21mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入無(wú)水醋酸鋅0.168mmol，此時(shí)，芘磺?；苌锖推p酐的摩爾比為3:1，無(wú)水醋酸鋅的添加量約為苝酐摩爾量的0.8倍；然后用磁力攪拌器攪拌，在150℃下加熱回流10h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，過(guò)濾，收集濾液。然后再將其滴到300mL的2mol/L鹽酸溶液中，攪拌過(guò)夜，抽濾，依次用二次水及甲醇對(duì)濾餅進(jìn)行多次淋洗。收集濾餅，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按體積比為30:1:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物。之后，得到式I所示的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針。

實(shí)施例5

1)合成芘磺?；苌?/p>

在流速為0.8mL/s的氖氣保護(hù)和冰浴攪拌條件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口燒瓶中加入8mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后將1mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按8s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯與1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩爾比為1:8。滴加完后室溫?cái)嚢?小時(shí)，停止反應(yīng)后，將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6～7次，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，再用1mol/L鹽酸進(jìn)行洗滌，再用3mol/L氫氧化鈉水溶液進(jìn)行中和，使溶液pH值在7.5，之后用三氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺?；苌铮浞磻?yīng)方程式如下：

2)合成雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針

在流速為0.8mL/s的氖氣氣氛保護(hù)下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺酰基衍生物0.60mmol，將其加入到12mL溶有0.15mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入無(wú)水醋酸鋅0.3mmol，此時(shí)，芘磺?；苌锖推p酐的摩爾比為4:1，無(wú)水醋酸鋅的添加量約為苝酐摩爾量的2倍；然后用磁力攪拌器攪拌，在200℃下加熱回流12h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，過(guò)濾，收集濾液。然后再將其滴到300mL的2mol/L鹽酸溶液中，攪拌過(guò)夜，抽濾，依次用二次水及甲醇對(duì)濾餅進(jìn)行多次淋洗。收集濾餅，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按體積比為60:1:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物。之后，得到式I所示的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針。

實(shí)施例6

1)合成芘磺?；苌?/p>

在流速為0.7mL/s的氮?dú)獗Ｗo(hù)和冰浴攪拌條件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口燒瓶中加入7mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后將1mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按7s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯與1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩爾比為1:7。滴加完后室溫?cái)嚢?小時(shí)，停止反應(yīng)后，將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6～7次，然后用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，再用1mol/L鹽酸進(jìn)行洗滌，再用3mol/L氫氧化鈉水溶液進(jìn)行中和，使溶液pH值在8，之后用三氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺?；苌铮浞磻?yīng)方程式如下：

2)合成雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針

在流速為0.7mL/s的氮?dú)鈿夥毡Ｗo(hù)下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺酰基衍生物0.50mmol，將其加入到12mL溶有0.2mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入無(wú)水醋酸鋅0.3mmol，此時(shí)，芘磺酰基衍生物和苝酐的摩爾比為2.5:1，無(wú)水醋酸鋅的添加量約為苝酐摩爾量的1.5倍；然后用磁力攪拌器攪拌，在160℃下加熱回流14h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，過(guò)濾，收集濾液。然后再將其滴到300mL的2mol/L鹽酸溶液中，攪拌過(guò)夜，抽濾，依次用二次水及甲醇對(duì)濾餅進(jìn)行多次淋洗。收集濾餅，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按體積比為20:1:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物。之后，得到式I所示的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針。

實(shí)施例7

實(shí)施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測(cè)胃蛋白酶的用途，其使用方法如下：

1、配制溶液

向1.5mmol/L CTAB的HEPES緩沖溶液(10mmol/L，pH 7.4)中加入雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI，配制成1.0μmol/L熒光探針溶液。稱(chēng)取一定質(zhì)量的胃蛋白酶溶于10mmol/L HEPES緩沖溶液中，配制成2.5mmol/L胃蛋白酶溶液。

2、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

量取2.5mL 1.0μmol/L熒光探針的CTAB溶液(1.5mmol/L)于比色皿中，加入2.5mmol/L胃蛋白酶溶液，用毛細(xì)管攪拌使其混合均勻，使得混合溶液中胃蛋白酶的濃度分別為1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、10、15和20μmol/L。熒光光譜的測(cè)試均在單光子熒光光譜儀(FS5，Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發(fā)波長(zhǎng)均為352nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫分別為3.5和2.7nm。待溶液達(dá)到平衡后，繪制熒光強(qiáng)度隨胃蛋白酶濃度變化的熒光光譜圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖可見(jiàn)，隨著胃蛋白酶濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)比例型變化。

實(shí)施例8

實(shí)施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測(cè)牛血清蛋白的用途，其使用方法與實(shí)施例7相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖可見(jiàn)，隨著牛血清蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)比例型變化。

實(shí)施例9

實(shí)施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測(cè)卵清蛋白的用途，其使用方法與實(shí)施例7相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖可見(jiàn)，隨著卵清蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)比例型變化。

實(shí)施例10

實(shí)施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測(cè)β-乳球蛋白的用途，其使用方法與實(shí)施例7相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖可見(jiàn)，隨著β-乳球蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)比例型變化。

實(shí)施例11

實(shí)施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測(cè)細(xì)胞色素c的用途，其使用方法與實(shí)施例7相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5，由圖可見(jiàn)，隨著細(xì)胞色素c濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)猝滅型變化。

實(shí)施例12

實(shí)施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測(cè)鐵蛋白的用途，其使用方法如下：

1、配制溶液

向1.5mmol/L CTAB的緩沖溶液(10mmol/LHEPES，pH 7.4)中加入雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針，配制成1.0μmol/L熒光探針的CTAB溶液。稱(chēng)取一定質(zhì)量的鐵蛋白溶于10mmol/L HEPES緩沖溶液中，配制成0.25mmol/L鐵蛋白溶液。

2、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

量取2.5mL 1.0μmol/L熒光探針溶液于比色皿中，加入0.25mmol/L鐵蛋白溶液，用毛細(xì)管攪拌使其混合均勻，使得混合溶液中鐵蛋白的濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7和1.0μmol/L。熒光光譜的測(cè)試均在單光子熒光光譜儀(FS5，Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發(fā)波長(zhǎng)均為352nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫分別為3.5和2.7nm。待測(cè)試完畢后，繪制熒光強(qiáng)度隨鐵蛋白濃度變化的熒光光譜圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6，由圖可見(jiàn)，隨著鐵蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)猝滅型變化。

實(shí)施例13

實(shí)施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測(cè)血紅蛋白肌紅蛋白的用途，其使用方法與實(shí)施例12相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7，由圖可見(jiàn)，隨著血紅蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)猝滅型變化。

實(shí)施例14

實(shí)施例1合成的雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針在水相中檢測(cè)肌紅蛋白的用途(肌紅蛋白的濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5和2.0μmol/L)，其使用方法與實(shí)施例12相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8，由圖可見(jiàn)，隨著肌紅蛋白濃度的增加，體系的熒光呈現(xiàn)猝滅型變化。

實(shí)施例15

采集雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI在380nm、400nm、421nm、480nm、544nm、577nm處的熒光強(qiáng)度，繪制四種非金屬蛋白濃度為10μM時(shí)不同波長(zhǎng)處log(I/I₀)值的標(biāo)準(zhǔn)柱狀圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9，由圖可見(jiàn)，四種非金屬蛋白質(zhì)在同一濃度下有不同程度的響應(yīng)。

實(shí)施例16

采集雙芘修飾苝酰亞胺衍生物熒光探針PEPBI在380nm、400nm、421nm、480nm、544nm、577nm處的熒光強(qiáng)度，繪制四種金屬蛋白濃度為1.0μM時(shí)不同波長(zhǎng)處log(I/I₀)值的標(biāo)準(zhǔn)柱狀圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10，由圖可見(jiàn)，四種金屬蛋白質(zhì)在同一濃度下有不同程度的響應(yīng)。

通過(guò)以上實(shí)施例，可以得到，在本發(fā)明選定的傳感體系中，分別加入四種非金屬蛋白和四種金屬蛋白，體系可以實(shí)現(xiàn)對(duì)非金屬蛋白的比例型響應(yīng)以及對(duì)金屬蛋白的猝滅型響應(yīng)。并且，通過(guò)采集不同波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，做出log(I/I₀)對(duì)蛋白質(zhì)濃度的柱狀圖，就可以分別實(shí)現(xiàn)對(duì)非金屬蛋白和金屬蛋白的指紋圖譜識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)各種蛋白質(zhì)的區(qū)分識(shí)別。