本發(fā)明屬于蛋雞分子遺傳標(biāo)記輔助選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞產(chǎn)蛋性能的分子遺傳標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國地方肉雞品種資源豐富，但與國外商業(yè)品種相比，總體表現(xiàn)產(chǎn)蛋性能不佳，提高肉雞地方品種產(chǎn)蛋性能一直是我國家禽育種的主要目標(biāo)之一。傳統(tǒng)的雞產(chǎn)蛋性能選育方法是通過測定一個世代(500日齡)的產(chǎn)蛋量表型來進(jìn)行選擇。蛋由于表型選擇是一個長期的積累過程，其影響因素又很多，如選擇強(qiáng)度、選擇性狀的數(shù)目、世代間距、環(huán)境條件和營養(yǎng)水平等，都會對表型選擇發(fā)生作用，其變異呈連續(xù)性，加之性狀的表型與其基因型之間的關(guān)系復(fù)雜，在大多數(shù)情況下并不完全吻合，因而選擇往往難以準(zhǔn)確，只有多次重復(fù)同一方法，連續(xù)數(shù)代定向選擇才能取得顯著效果，存在周期長、效率低、成本高、進(jìn)展較慢等缺點(diǎn)。為此，許多研究者正在不斷探索新的更為有效的雞產(chǎn)蛋性狀選擇技術(shù)，以改變傳統(tǒng)選擇方法的不足。

分子遺傳標(biāo)記以物種基因突變造成DNA片段長度多態(tài)性為基礎(chǔ)，具有許多優(yōu)點(diǎn)：(1)可以直接探測DNA水平的差異，不受時空的限制；(2)標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性高；(3)共顯性標(biāo)識，可以區(qū)分純合子與雜合子；(4)可以解釋家系內(nèi)某些個體的遺傳變異；(5)在選擇產(chǎn)蛋性狀的過程中，不必進(jìn)行500日齡的產(chǎn)蛋測定試驗。由此可見，采用DNA分析技術(shù)，通過在DNA分子水平上尋找與雞產(chǎn)蛋性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，在育種計劃中納入分子標(biāo)記信息進(jìn)行輔助選擇是提高選擇效率，縮短世代間隔，提高選擇強(qiáng)度，加快雞產(chǎn)蛋性狀遺傳進(jìn)展的有效途徑。

近年來，隨著對雞產(chǎn)蛋性狀研究的不斷深入，已經(jīng)鑒定出大量與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的基因，包括催乳素、促卵泡激素β亞基、雌激素受體α亞基、卵細(xì)胞卵黃生成受體、促性腺激素釋放激素、血管活性腸肽、類胰島素生長因子和促甲狀腺激素等，這些基因主要是通過調(diào)節(jié)相應(yīng)的激素合成和分泌來影響家禽的產(chǎn)蛋量。

促卵泡激素(Follical Stimulate Hormone,FSH)是動物垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，在下丘腦－垂體－性腺生殖軸中起到重要的作用。趙要風(fēng)等(1997)在豬的FSHβ基因的+809和+810堿基中發(fā)現(xiàn)了一個292bp的插入/缺失突變，把FSHβ基因作為控制豬產(chǎn)仔數(shù)的候選基因同豬產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，證明FSHβ基因與豬產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)。近年來的研究表明FSHβ基因與雞繁殖性狀也有一定的關(guān)系，如洪坤月等(2007)采用PCR-SSCP方法分析太湖雞FSHβ基因多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋20周的產(chǎn)蛋性能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FSHβ基因?qū)μu前期產(chǎn)蛋性能有一定的影響；韓厚明(2006)在文昌雞FSHβ5’調(diào)控區(qū)檢測到6個SNP位點(diǎn)，與開產(chǎn)日齡和40周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05)；周俊(2008)在綠殼蛋雞外顯子3’UTR檢測到A2447G,與開產(chǎn)日齡呈顯著相關(guān)(P<0.05)；楊桓(2011)發(fā)現(xiàn)欣華雞的內(nèi)含子1的T+259G位點(diǎn)不同基因型個體開產(chǎn)日齡差異顯著(P<0.05)。

本發(fā)明采用連接酶反應(yīng)方法(ligase detection reaction,LDR)進(jìn)行FSHβ基因的多態(tài)性檢測、SNP位點(diǎn)篩選和基因分型，并與雞產(chǎn)蛋性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得一個新的雞產(chǎn)蛋性能相關(guān)分子遺傳標(biāo)記，為具有優(yōu)良產(chǎn)蛋性狀的肉雞品種選擇提供可靠的依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是，針對利用分子標(biāo)記技術(shù)選擇雞產(chǎn)蛋性能研究不足，提供一種在雞的生命早期就可開始、準(zhǔn)確性高、選育周期短、成本低的利用FSHβ基因分子遺傳標(biāo)記技術(shù)選擇雞產(chǎn)蛋性能的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種FSH-β基因作為雞產(chǎn)蛋性能相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記，該遺傳標(biāo)記為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或該序列中至少包含第259bp處的T>G突變堿基的特異性片段，導(dǎo)致FSH-β基因的單核苷酸多態(tài)性。

本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易根據(jù)本發(fā)明的分子遺傳標(biāo)記設(shè)計出用于擴(kuò)增該分子標(biāo)記的引物和探針，所述引物序列如SEQ ID No.2-3所示；鑒定所述分子標(biāo)記的探針，所述探針序列如SEQ ID No.4-6所示，從而用于該遺傳標(biāo)記的檢測，例如通過PCR擴(kuò)增得到所述遺傳標(biāo)記，再通過克隆測序得到相應(yīng)的序列，或者通過Bsm I-RFLP多態(tài)性進(jìn)行檢測。因而，本發(fā)明還包括用于擴(kuò)增所述分子遺傳標(biāo)記的引物或鑒定所述分子遺傳標(biāo)記的探針，以及含有所述引物或探針的試劑盒。

本發(fā)明還提供一種分子遺傳標(biāo)記、引物或探針在雞產(chǎn)蛋性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，擴(kuò)增雞育種材料的基因組DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳并回收，對測序得到的序列進(jìn)行多態(tài)性分析，在FSH-β基因rs259突變位點(diǎn)獲得TT、TG和GG三種基因型，選育出TT基因型純合個體組建配套系，交配得到后代為產(chǎn)蛋量高的后代，可以提高產(chǎn)蛋數(shù)。

本發(fā)明的原理：連接酶檢測反應(yīng)是一種高特異性基因檢測技術(shù)，其主要基于核酸特異雜交原理，一對雜交探針雜交于待檢DNA序列上相鄰的位置，并在雜交后經(jīng)連接酶連接形成一條完整的探針，再結(jié)合不同的檢測方式實(shí)現(xiàn)檢測。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明提出雞產(chǎn)蛋性能相關(guān)的FSHβ基因多態(tài)性分析與分子標(biāo)記選擇方法，可為通過分子標(biāo)記輔助育種(MAS)技術(shù)提高母雞產(chǎn)蛋性能提供新途徑。在應(yīng)用于雞產(chǎn)蛋性能的選擇工作中，具有以下的有益效果：

第一，本發(fā)明是根據(jù)基因型對雞產(chǎn)蛋性能的選擇，具有精確度高、操作簡單、費(fèi)用低(選擇成本約為0.3元/只)等特點(diǎn)，并可以進(jìn)行自動化的規(guī)模檢測；

第二，利用本發(fā)明的分子標(biāo)記方法可以在雞的生命早期(出生后1周內(nèi))即可開始選擇雞產(chǎn)蛋性能的性狀，可以縮短世代間隔，提高選擇強(qiáng)度，較早地選擇出優(yōu)良的種雞親本，從而加速雞的育種進(jìn)程，與常規(guī)的雞產(chǎn)蛋性能測定選擇方法比較每代可縮短選擇時間16個月；

第三，利用本發(fā)明的分子標(biāo)記方法對雞產(chǎn)蛋性能性狀進(jìn)行選擇，不僅可為雞育種工作中標(biāo)記輔助選擇提供一個更為有效、簡便易行的分子標(biāo)記方法，同時可以克服常規(guī)雞產(chǎn)蛋性能選擇方法工作量大、易受環(huán)境影響和育種周期長等缺點(diǎn)，為雞產(chǎn)蛋性能改良提供一種有效的分子標(biāo)記育種手段，從而加速雞的遺傳進(jìn)展。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1本發(fā)明雞FSH-β基因rs259位點(diǎn)基因分型圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例

本發(fā)明所述的利用分子標(biāo)記輔助選擇雞產(chǎn)蛋性能的方法，是在完成下列基礎(chǔ)工作后取得的：

1.引物與探針

FSH-β基因多態(tài)性檢測引物與探針如表1和表2：

表1 FSH-β基因多態(tài)性檢測引物

表2 FSH-β基因多態(tài)性引物探針

2.連接酶檢測反應(yīng)對SNP多態(tài)性的研究

根據(jù)引物和探針的分子量加TE稀釋至50pmol/μL作為母液。多重PCR、LDR時各引物母液等比混合成可直接進(jìn)行反應(yīng)的mixture溶液。PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片段，按照下表準(zhǔn)備PCR Master Mix(20μL體系)。

表3 PCR反應(yīng)體系

在1.5mL離心管中分別加入200μL PCR-buffer(10×)，60μL Mg²⁺(100mM)，200μL Dntp(20mM/each)，20μL Taq酶(5U/μL)，400μL Q-solution(4×)，40μL primer(5pM)，最后加入980μL去離子水。充分混勻后離心，再取19μL分裝在200μL的PCR反應(yīng)管中，最后加入1μL基因組DNA。

在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上設(shè)置如下程序

Program：

95℃變性15min，35個循環(huán)，每個循環(huán)3個溫度，94℃30s，56℃1min，72℃1min，最后72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，取2μL反應(yīng)產(chǎn)物在3.0％瓊脂糖膠電泳檢測，獲得預(yù)期長度片段。將PCR產(chǎn)物測序，獲得如下序列(SEQ ID No.1)。

AGCAGTGGAAAGAGAAGAATGTGAACTCTGCATTACAGTGAATGCCACGTGGTGCTCAGGATACTGCTTCACAAGGGTGAGAATCTTGAGCTTAATTCAGGCACCATAATTAAGTATTCAAGTGACGTATGAACAACCTGTTTCTTTGGTTTATAACAAACACATGAGCAAGATGAT/GCCTTATGAAAGAAAGGGCTGAATAACTGCTGTGTTGTTCAATAAGAAAGTAGATACATAGCCAAACTGAACTGTAAAGGGAAGGGTGAAAAAATGCTAGCTAAATTTGAATCTTTATTTGGCTGCATGCATTACAGTCATATTGTATAACTAGAGCTGAAAGTATGATAATCTGGATCTCTGCTGTCTGTTCAAT

注：黑體標(biāo)注位點(diǎn)為rs259位點(diǎn)。

PCR產(chǎn)物的連接酶檢測反應(yīng)：在PCR產(chǎn)物中加入等體積ddH₂O稀釋，作為連接反應(yīng)的模板。按照下表進(jìn)行鏈接反應(yīng)Mix(10μL體系)。

表4 PCR連接酶檢測反應(yīng)體系

在1.5mleppendorf離心管中分別加入100ul buffer(10×),100μL Probe Mix,5μL連接酶，695μL去離子水。充分混勻后離心，再取9μL分裝在200ul的PCR反應(yīng)管中，最后再加入1μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物。

在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上設(shè)置如下程序：

Program：

95℃變性2min，35個循環(huán)，每個循環(huán)有2個溫度，94℃30s，50℃2min將PCR反應(yīng)管放入PCR儀進(jìn)行連接反應(yīng)。

各取1μl LDR連接產(chǎn)物與1μl ABI GS-500ROX熒光標(biāo)記分子量標(biāo)和1μL去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2分鐘，冰中驟冷，于5％聚丙烯酰胺和5mol/L尿素中3000V電泳2.5小時，應(yīng)用GENESCANTM672軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、泳道線校正、遷移片段大小測量和校正內(nèi)在分子量標(biāo)準(zhǔn)；應(yīng)用Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和基因分型。

雞FSH-β基因rs259位點(diǎn)基因分型如圖1所示。

3.基因型和產(chǎn)蛋性狀及體重性狀的關(guān)聯(lián)分析

本試驗基因型和產(chǎn)蛋性能及體重性狀關(guān)聯(lián)分析采用單因素方差分析，用強(qiáng)連鎖分析軟件JMP10(John’s Mackintosh Program 10)進(jìn)行分析，所用模型如下：Y＝G+F(M)+M+e

其中Y是表型值，G是基因效應(yīng)，F(xiàn)(M)父系效應(yīng)，M是母系效應(yīng)，e是隨機(jī)效應(yīng)。數(shù)據(jù)表示為最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)差。FSH-β基因SNP位點(diǎn)基因型與產(chǎn)蛋性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表5。

表5 FSH-β基因rs259位點(diǎn)基因型與蛋用性狀的關(guān)聯(lián)分析

注：同一行肩標(biāo)不同者表示差異顯著。

本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 一種雞產(chǎn)蛋性能相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記及應(yīng)用

<130> 說明書、權(quán)利要求書

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 372

<212> DNA

<213> FSH-β基因擴(kuò)增片段

<400> 1

agcagtggaa agagaagaat gtgaactctg cattacagtg aatgccacgt ggtgctcagg 60

atactgcttc acaagggtga gaatcttgag cttaattcag gcaccataat taagtattca 120

agtgacgtat gaacaacctg tttctttggt ttataacaaa cacatgagca agatgatcct 180

tatgaaagaa agggctgaat aactgctgtg ttgttcaata agaaagtaga tacatagcca 240

aactgaactg taaagggaag ggtgaaaaaa tgctagctaa atttgaatct ttatttggct 300

gcatgcatta cagtcatatt gtataactag agctgaaagt atgataatct ggatctctgc 360

tgtctgttca at 372

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> rs259-F

<400> 2

agcagtggaa agagaagaa 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> rs259-R

<400> 3

attgaacaga cagcagaga 19

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 259_modify

<400> 4

tcatcttgct catgtgtttg tttttttttt tttttttt 38

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 259_T

<400> 5

tttttttttt ttttttttca gccctttctt tcataagga 39

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 259_G

<400> 6

tttttttttt tttttttttt cagccctttc tttcataagg c 41