本發(fā)明屬于抗炎藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速獲得綠原酸粗提物的方法。
背景技術(shù)：
烏蘇里瓦韋[Lepisorus ussuriensis(Regel et Maack)Ching]為蕨類(lèi)水龍骨科瓦韋屬植物，別名石茶、樹(shù)茶、還陽(yáng)草、大石韋等。在中國(guó)分布于安徽、河南、山東、河北、遼寧、吉林、黑龍江。資料記載，烏蘇里瓦韋主要活性成分為綠原酸，具有清熱解毒、利尿、止咳、止血等功效，可用于治療小便不利、小便淋痛、肺熱咳嗽、哮喘、咽喉腫痛、瘡瘍腫毒、風(fēng)濕疼痛、刀傷出血。烏蘇里瓦韋生于海拔800m左右的山地樹(shù)干或巖石上，且植株較矮小(高10余厘米)。該植物目前僅在產(chǎn)地山區(qū)民間應(yīng)用，來(lái)治療各種炎癥疼痛，且療效甚好。但由于其分布區(qū)域較狹窄，生長(zhǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格，植株矮小且產(chǎn)量不大，因此采用組織培養(yǎng)的方法快速獲取其有效成分以保障其開(kāi)發(fā)利用研究尤為重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種快速獲得綠原酸粗提物的方法，可以快速提取烏蘇里瓦韋活性成分，解決了開(kāi)發(fā)資源量不足的問(wèn)題。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種快速獲得綠原酸粗提物的方法，具體按照以下步驟進(jìn)行：
步驟1，配置培養(yǎng)基與培養(yǎng)基的滅菌；
步驟2，消毒處理烏蘇里瓦韋根莖；
步驟3，外植體的接種；
步驟4，根莖愈傷組織培養(yǎng)；
a.根莖愈傷組織的誘導(dǎo)；
以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA 0.3mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA 1mg·L-1作為培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)基瓊脂含量為7.0gL-1，蔗糖含量為30.0g·L-1，pH為5.8；將切成1cm的根莖小塊接種于培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱，在25±2℃下暗培養(yǎng)，培養(yǎng)30天；
b.根莖愈傷組織的增值；
以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA 0.3mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA 1mg·L-1作為培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)基瓊脂含量為7.0g·L-1，蔗糖含量為30.0g·L-1，pH值為5.8；將愈傷組織切成0.5cm×0.5cm的小塊接種于培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱，在25±2℃下暗培養(yǎng)，增殖時(shí)間為25天；
步驟5，烏蘇里瓦韋愈傷組織中有效成分的提??；
取烏蘇里瓦韋根莖愈傷組織研碎后，加70％乙醇超聲提取1h，其中料液比1:20，濃縮，再用正丁醇萃取，然后濃縮成浸膏，即得。
進(jìn)一步的，所述步驟1按照以下步驟進(jìn)行：
以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA 0.5mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA 1mg·L-1作為培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)基瓊脂含量為7.0g·L-1，蔗糖含量為30.0g·L-1，加入雙蒸水使其溶解，用NaOH和HCl溶液將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8±0.2，放入加熱套中加熱并用玻璃棒不斷攪拌使培養(yǎng)基完全溶解；用封口膜封住瓶口，放入立式壓力蒸汽滅菌器中，于101kpa下滅菌20min，然后斷開(kāi)電源打開(kāi)放氣閥，待氣壓降至標(biāo)準(zhǔn)大氣壓后，取出培養(yǎng)基，將滅菌后的培養(yǎng)基放在無(wú)菌操作臺(tái)中；培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中要趁熱，防止培養(yǎng)基凝固，倒入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基厚度為1.5cm，待培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基凝固冷卻以備用。
進(jìn)一步的，無(wú)菌操作臺(tái)在使用前需用紫外燈照射30min，使無(wú)菌操作臺(tái)處于無(wú)菌狀態(tài)。
進(jìn)一步的，所述步驟2按照以下步驟進(jìn)行：
取烏蘇里瓦韋根莖自來(lái)水沖刷10min后，放入燒杯中帶入無(wú)菌接種室備用，倒入濃度75％的酒精消毒30s，無(wú)菌水沖洗1次，用0.1％HgCl2溶液對(duì)根莖進(jìn)行浸泡消毒5min，再用無(wú)菌水沖洗5～6次，將消毒完全的外植體置于鋪有無(wú)菌的濾紙中，吸干外植體表面的水分，將根莖則切成1cm的小段，即可用于無(wú)菌接種。
進(jìn)一步的，所述步驟3按照以下步驟進(jìn)行：
將所有要用到的工具進(jìn)行酒精燈消毒處理，將根莖外植體充分接觸到培養(yǎng)基上后，用蓋子蓋好，并用封口膜封嚴(yán)，將接種外植體的培養(yǎng)皿放在25±2℃環(huán)境下培養(yǎng)，靜等觀察。
本發(fā)明的有益效果是傳統(tǒng)的該藥材使用方法就是采摘其地上部分，泡茶或泡酒飲用。由于其生長(zhǎng)環(huán)境的限制每年只能采摘一次，采摘費(fèi)時(shí)費(fèi)力且產(chǎn)量低。采用本方法可以不受地理位置、時(shí)間等的限制，且可以減少人力物力等。藥理實(shí)驗(yàn)也表明，一定劑量的烏蘇里瓦韋愈傷組織活性成分粗提物與野生烏蘇里瓦韋的抗炎藥理作用無(wú)明顯差別。
附圖說(shuō)明
為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
圖1是綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
一種快速獲得綠原酸粗提物的方法，具體按照以下步驟進(jìn)行：
步驟1，培養(yǎng)基的配置與滅菌
培養(yǎng)基的配置：以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA 0.3mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA1mg·L-1作為培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)基瓊脂含量為7.0g·L-1，蔗糖含量為30.0g·L-1，加入雙蒸水使其溶解，用NaOH和HCl溶液將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8±0.2，放入加熱套中加熱并用玻璃棒不斷攪拌使培養(yǎng)基完全溶解。用封口膜封住瓶口，放入立式壓力蒸汽滅菌器中，于101kpa下滅菌20min。20min后斷開(kāi)電源打開(kāi)放氣閥，待氣壓降至標(biāo)準(zhǔn)大氣壓后，取出培養(yǎng)基，將滅菌后的培養(yǎng)基放在無(wú)菌操作臺(tái)中。無(wú)菌操作臺(tái)在使用前需用紫外燈照射30min，使無(wú)菌操作臺(tái)處于無(wú)菌狀態(tài)。培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中要趁熱，防止培養(yǎng)基凝固且倒入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基厚度應(yīng)為1.5cm左右，待培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基凝固冷卻以備用。
步驟2，實(shí)驗(yàn)材料處理
取烏蘇里瓦韋根莖自來(lái)水沖刷10min后，放入燒杯中帶入無(wú)菌接種室備用，倒入75％酒精消毒30s，無(wú)菌水沖洗1次，用0.1％HgCl2溶液對(duì)根莖進(jìn)行浸泡消毒5min，再用無(wú)菌水沖洗5～6次，將消毒完全的外植體置于鋪有無(wú)菌的濾紙中，吸干外植體表面的水分，將根莖則切成1cm左右的小段，即可用于無(wú)菌接種。
步驟3，外植體的接種
將所有要用到的工具進(jìn)行酒精燈消毒處理，將根莖外植體充分接觸到培養(yǎng)基上后，用蓋子蓋好，并用封口膜封嚴(yán)，將接種外植體的培養(yǎng)皿放在25±2℃環(huán)境下培養(yǎng)，靜等觀察。以上操作都要時(shí)刻注意無(wú)菌操作，以防止培養(yǎng)過(guò)程中感染細(xì)菌，影響其生長(zhǎng)。
步驟4，根莖愈傷組織培養(yǎng)
a.根莖愈傷組織的誘導(dǎo)
以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA 0.3mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA 1mg·L-1作為培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)基瓊脂含量為7.0gL-1，蔗糖含量為30.0g·L-1，pH為5.8左右；將根莖切成1cm左右的小塊接種于培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱，在25±2℃下暗培養(yǎng)，培養(yǎng)30天。
b.根莖愈傷組織的增值
以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA 0.3mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA 1mg·L-1作為培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，培養(yǎng)基瓊脂含量為7.0g·L-1，蔗糖含量為30.0g·L-1，pH值為5.8；將愈傷組織切成0.5cm×0.5cm左右的小塊接種于培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱，在25±2℃下暗培養(yǎng)，增殖時(shí)間為25天。
步驟5，烏蘇里瓦韋愈傷組織中有效成分的提取
取烏蘇里瓦韋根莖愈傷組織研碎后，加70％乙醇(料液比1:20)超聲提取1h，濃縮，再用正丁醇萃取，然后濃縮成浸膏，即為烏蘇里瓦韋活性成分濃縮物。
采用組織培養(yǎng)的方法獲得藥用植物有效成分的技術(shù)已經(jīng)有很多實(shí)例，實(shí)驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)很成熟。針對(duì)烏蘇里瓦韋這種療效甚好的抗炎藥物進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)25天，外植體即可增加重量為原來(lái)的10倍以上，而且由于是離體培養(yǎng)，還不受季節(jié)的限制，解決了開(kāi)發(fā)資源量不足的問(wèn)題，對(duì)今后將烏蘇里瓦韋開(kāi)發(fā)成一種抗炎中藥提供了資源保障。
采用紫外分光光度法對(duì)烏蘇里瓦韋愈傷組織中的綠原酸含量進(jìn)行了測(cè)定。測(cè)定方法及結(jié)果如下：
1.供試品溶液的制備
精密稱(chēng)取愈傷組織0.2g，置于研缽中研碎后，加蒸餾水超聲提取1h，過(guò)濾濃縮后，用乙醇定容于25mL容量瓶中，備用。
2.對(duì)照品溶液的配置
取綠原酸對(duì)照品，精密稱(chēng)取4.77mg，加乙醇定容于10mL容量瓶中，即得0.477mg·mL-1的對(duì)照品溶液。
3.紫外分光光度法檢測(cè)波長(zhǎng)的確定
綠原酸含量測(cè)定波長(zhǎng)的選擇，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光度譜圖，得到綠原酸在324nm處有較為平緩的最大吸收峰，故選324nm作為綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。
4.線性關(guān)系的考察
分別精密吸取3.2.2.2綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL置于10mL容量瓶中，配置成3.816μg·mL-1、4.77μg·mL-1、7.155μg·mL-1、9.54μg·mL-1、11.92μg·mL-1、14.31μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液以備用，取水作為空白對(duì)照，于324nm處測(cè)定6種樣品吸光值，并以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.愈傷組織中綠原酸的含量測(cè)定
a.線性關(guān)系的考察結(jié)果
以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制得出的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1，進(jìn)行回歸分析得y＝0.050x+0.011，R2＝0.993(n＝6)，說(shuō)明綠原酸對(duì)照品在3.816～14.31μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
b.供試品溶液中綠原酸含量測(cè)定結(jié)果
根據(jù)烏蘇里瓦韋抑愈傷組織提取綠原酸含量正交最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，最終得綠原酸的含量為3.318mg g-1。
研究表明，野生烏蘇里瓦韋中地上部分綠原酸含量為2.635mg g-1，其根莖愈傷組織中的綠原酸含量高于野生烏蘇里瓦韋。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。