本發(fā)明涉及藥物及其制備方法領域，具體涉及一種正電子放射性藥物、制備方法及其應用。

背景技術：

轉位蛋白TSPO是一種由細胞核編碼，內含169個氨基酸(富含色氨酸)的疏水性蛋白，在各種族間高度保守，在組織中主要定位于線粒體外膜，特別是在與甾體合成相關的組織中高度表達，如腎上腺、性腺、唾液腺等，在腎臟及心臟組織中也有部分表達，而在肝臟及腦中表達水平很低。研究表明，TSPO是甾體激素合成的重要組成部分，可促進膽固醇跨膜轉運進入磷脂膜，增加孕烯醇酮形成及下游神經類固醇合成，修復損傷神經和促進神經生長等。此外，TSPO還參與許多生理功能，如細胞增殖、免疫應答和線粒體呼吸凋亡等。

在中樞神經系統(tǒng)中，TSPO主要分布于膠質細胞線粒體外膜，在靜息小膠質細胞中低水平表達。然而，當發(fā)生炎癥反應時，大腦中小膠質細胞明顯活化增殖，TSPO密度明顯增加，并且TSPO密度增高與中樞神經系統(tǒng)炎癥反應呈正相關：大腦損傷時，小膠質細胞和星形膠質細胞中TSPO的表達上調，并與大腦損傷的程度直接相關；小膠質細胞的激活增殖并產生致炎性細胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)等，引起腦內炎癥反應，隨著近年對多種神經系統(tǒng)病變如阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化、腦梗、進行性肌肉萎縮癥、帕金森病和亨廷頓舞蹈病等發(fā)病機制的深入探索，越來越多的研究結果表明，小膠質細胞激活介導的腦內慢性炎癥反應(即TSPO密度增高)是神經系統(tǒng)病變的病理特征之一。

鑒此，TSPO作為重要的藥物靶點，越來越多的得到了研究者們的關注。一方面，靶向TSPO的正電子成像逐漸成為評價腦損傷、診斷腦外傷進展與狀態(tài)、區(qū)分外周炎癥與腫瘤的重要工具；同時，該類正電子藥物為神經退行性疾病等中樞神經系統(tǒng)疾病的早期診斷提供影像學研究依據。另一方面，各類特異性靶向TSPO的配體在體內實驗中已被證實對神經退行性病變和焦慮的動物模型有顯著療效，并具有神經保護、減少腦內炎癥、促進神經再生、改善記憶和治療應激相關障礙等功能。然而，在其治療型藥物的研究與開發(fā)中，仍有一些問題是值得探討的，如在治療局部神經適應證中TSPO的中長期療效；考慮到TSPO在外周神經系統(tǒng)中高表達，長期給予TSPO配體藥物可能造成的不良反應等。而開發(fā)靶向型正電子藥物可以對研究TSPO配體的療效和安全性提供有力支持。

第一個顯像TSPO的正電子藥物為[¹¹C](R)-PK11195，但由于其透腦率差、信噪比低等問題，無法滿足臨床的需求。因此，越來越多的新型正電子藥物被研發(fā)出來，以期實現更優(yōu)質的成像效果。具有代表性的包括[¹¹C]PBR28，[¹¹C]PBR111，[¹¹C]DAA1106，[¹¹C]MBMP，[¹¹C]ER176，[¹⁸F]AB5186，[¹⁸F]FEDAA1106，[¹⁸F]GE-180和[¹⁸F]DPA-714等，其中[¹⁸F]DPA-714以其高效便捷的放射標記方法、較高的頭腦效率及信噪比等優(yōu)勢，在多種疾病模型上進行了廣泛的正電子計算機斷層顯像(positron emission tomography,PET)研究，包括腦創(chuàng)傷老鼠模型、慢性肝性腦病老鼠模型、亨廷頓病狒狒模型等，臨床上已應用于對肌萎縮、中風后遺癥以及阿爾茲海默癥等疾病的早期診斷和治療療效評估。

然而，研究表明，由于[¹⁸F]DPA-714分子結構中存在-OCH₂CH₂[¹⁸F]基團，在活體內細胞色素P450作用下，會首先發(fā)生脫乙基反應，代謝產生的含有[¹⁸F]標記的乙醇片段會被進一步氧化成[¹⁸F]乙醛、[¹⁸F]乙酸酯及[¹⁸F]乙酸，同時還會發(fā)生[¹⁸F]氟負離子的脫落。由于[¹⁸F]乙酸酯片段可以通過血腦屏障，從而產生非特異性結合的正電子成像信號，干擾檢測。因此，[¹⁸F]DPA-714分子結構的不穩(wěn)定性嚴重干擾PET影像的定量化分析。

技術實現要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種代謝穩(wěn)定型靶向TSPO正電子藥物[¹⁸F]芳基-DPA體系，具體的為[¹⁸F]FDPA，此[¹⁸F]FDPA的化學及放射化學純度高、比活度高且可重復性好，符合注射使用正電子藥物的質量標準；本發(fā)明還提供了[¹⁸F]FDPA的無載體放射性氟-18負離子標記方法，此方法步驟少、產率高、操作簡便且易于自動化生產；本發(fā)明進一步提供了[¹⁸F]FDPA的顯像應用，其可應用在多種炎癥疾病的顯像分析上。

本發(fā)明第一方面提供了式I的化合物

其中R¹和R²各自獨立的選自烷基；

任選的，R¹和R²各自獨立的選自C_1-6烷基。

在一優(yōu)選例中，所述化合物為下列化合物或者下列化合物的立體異構體：

本發(fā)明第二方面提供了所述化合物的制備方法，包括如下步驟：

(1)使式A所示化合物氧化后與式所示B化合物接觸，以便獲得式C所示化合物，以及

(2)使式C所示化合物與氟-18負離子進行接觸，以便獲得式D所示化合物。

在一優(yōu)選例中，所述式A所示化合物與所述式B所示化合物的摩爾比為0.8-1.2，優(yōu)選為1。

在一優(yōu)選例中，所述式A所示化合物的氧化是采用N，N-二乙基2-(2-(4-碘苯基)-5–二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺與單過硫酸氫鉀復合鹽進行接觸。

在一優(yōu)選例中，所述N，N-二乙基2-(2-(4-碘苯基)-5–二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺與單過硫酸氫鉀復合鹽的重量比為1：4-1：1，優(yōu)選為1：2。

在一優(yōu)選例中，所述N，N-二乙基2-(2-(4-碘苯基)-5–二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺是先與三氟乙酸和氯仿接觸，然后與單過硫酸氫鉀復合鹽進行接觸。

在一優(yōu)選例中，所述三氟乙酸與氯仿的體積比為2：1-4：1，優(yōu)選為3：1。

在一優(yōu)選例中，所述N，N-二乙基2-(2-(4-碘苯基)-5–二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺與三氟乙酸的重量比為0.06-0.1，優(yōu)選為0.08。

在一優(yōu)選例中，所述式A所示化合物氧化后是先與乙醇先接觸，然后再與式B所示化合物接觸。

在一優(yōu)選例中，所述式A所示化合物氧化后與乙醇接觸，這時所述式A所示化合物的氧化產物的濃度為10-100mg/mL,優(yōu)選為50mg/mL。

在一優(yōu)選例中，所述式B所示化合物是采用乙酸酐與2-金剛烷酮進行接觸制備而成。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐與2-金剛烷酮的摩爾比為0.8-1.2，優(yōu)選1.1。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐是先與酸性物質先接觸，然后再與2-金剛烷酮進行接觸。

在一優(yōu)選例中，所述酸性物質為丙二酸和濃硫酸。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐與丙二酸的體積比為0.8-1.3，優(yōu)選為1.04。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐與濃硫酸的體積比為150-250，優(yōu)選為200。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐先與酸性物質先接觸時反應條件是升溫至50-70℃反應10-20分鐘后降至室溫。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐先與酸性物質先接觸時反應條件是升溫至60℃反應15分鐘后降至室溫。

在一優(yōu)選例中，所述式B所示化合物是與碳酸鈉先接觸，然后再與式A所示化合物接觸。

在一優(yōu)選例中，所述式B所示化合物與碳酸鈉的摩爾比為1:1-1：5，優(yōu)選1:2。

在一優(yōu)選例中，所述氟-18負離子是采用QMA固相萃取柱捕獲。

在一優(yōu)選例中，所述QMA固相萃取柱上的氟-18負離子是采用含有季銨鹽的洗脫液進行洗脫。

在一優(yōu)選例中，所述式C所示化合物與季銨鹽的重量比0.5：20-20：8，優(yōu)選為1：12。

在一優(yōu)選例中，所述季銨鹽為四丁基甲磺酸銨。

在一優(yōu)選例中，所述采用含有季銨鹽的洗脫液的pH為7-8。

在一優(yōu)選例中，所述含有季銨鹽的洗脫液是由四丁基甲磺酸銨溶于乙腈和水制備而成。

在一優(yōu)選例中，所述含有季銨鹽的洗脫液中乙腈和水的體積比為0.5-1.5，優(yōu)選為1。

在一優(yōu)選例中，所述含有季銨鹽的洗脫液中每8-20mg四丁基甲磺酸銨所對應的乙腈和水的使用量為0.5-1.5mL，優(yōu)選為1mL。

在一優(yōu)選例中，所述氟-18負離子采用洗脫液洗脫后在100-120℃進行加熱并采用5-15mL/min流速的干燥氮氣鼓吹，待溶劑完全被吹干，然后向其中加入其體積是0.5-1.5倍洗脫液體積的無水乙腈，繼續(xù)在100-120℃進行加熱，并采用5-15mL/min流速的干燥氮氣鼓吹，待溶劑完全被吹干，重復2-4次。

在一優(yōu)選例中，所述氟-18負離子采用洗脫液洗脫后在110℃進行加熱并采用10mL/min流速的干燥氮氣鼓吹，待溶劑完全被吹干，然后向其中加入其體積是1倍洗脫液體積的無水乙腈，繼續(xù)在110℃進行加熱，并采用10mL/min流速的干燥氮氣鼓吹，待溶劑完全被吹干，重復3次。

在一優(yōu)選例中，所述式C所示化合物是與乙腈先接觸，然后與氟-18負離子進行接觸。

在一優(yōu)選例中，每mg的式C所示化合物對應使用的乙腈的量為0.2-2mL，優(yōu)選為0.6mL。

在一優(yōu)選例中，所述式C所示化合物與氟-18負離子進行接觸時的反應條件是：100-140℃下反應8-16min，優(yōu)選為120℃下反應12min。

在一優(yōu)選例中，所述式C所示化合物與氟-18負離子在反應完成后是采用乙腈和水組成的終止液進行終止反應。

在一優(yōu)選例中，所述終止液中乙腈和水的體積比為0.5-1.5，優(yōu)選為1。

在一優(yōu)選例中，每0.5-20mg的式C所示化合物對應使用的終止液的量為0.5mL。

在一優(yōu)選例中，每1.8mg的式C所示化合物對應使用的終止液的量為0.5mL。

本發(fā)明第三方面提供了一種化合物，具有式C所示的結構：

本發(fā)明第四方面提供了所述的化合物的制備方法，其方法為：使式A所示化合物氧化后與式所示B化合物接觸，以便獲得式C所示化合物。

在一優(yōu)選例中，所述式A所示化合物與所述式B所示化合物的摩爾比為0.8-1.2，優(yōu)選為1。

在一優(yōu)選例中，所述式A所示化合物的氧化是采用N，N-二乙基2-(2-(4-碘苯基)-5–二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺與單過硫酸氫鉀復合鹽進行接觸。

在一優(yōu)選例中，所述N，N-二乙基2-(2-(4-碘苯基)-5–二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺與單過硫酸氫鉀復合鹽的重量比為1：4-1：1，優(yōu)選為1：2。

在一優(yōu)選例中，所述N，N-二乙基2-(2-(4-碘苯基)-5–二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺是先與三氟乙酸和氯仿接觸，然后與單過硫酸氫鉀復合鹽進行接觸。

在一優(yōu)選例中，所述三氟乙酸與氯仿的體積比為2：1-4：1，優(yōu)選為3：1。

在一優(yōu)選例中，所述N，N-二乙基2-(2-(4-碘苯基)-5–二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺與三氟乙酸的重量比為0.06-0.1，優(yōu)選為0.08。

在一優(yōu)選例中，所述式A所示化合物氧化后是先與乙醇先接觸，然后再與式B所示化合物接觸。

在一優(yōu)選例中，所述式A所示化合物氧化后與乙醇接觸，這時所述式A所示化合物的氧化產物的濃度為10-100mg/mL,優(yōu)選為50mg/mL。

在一優(yōu)選例中，所述式B所示化合物是采用乙酸酐與2-金剛烷酮進行接觸制備而成。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐與2-金剛烷酮的摩爾比為0.8-1.2，優(yōu)選1.1。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐是先與酸性物質先接觸，然后再與2-金剛烷酮進行接觸。

在一優(yōu)選例中，所述酸性物質為丙二酸和濃硫酸。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐與丙二酸的體積比為0.8-1.3，優(yōu)選為1.04。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐與濃硫酸的體積比為150-250，優(yōu)選為200。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐先與酸性物質先接觸時反應條件是升溫至50-70℃反應10-20分鐘后降至室溫。

在一優(yōu)選例中，所述乙酸酐先與酸性物質先接觸時反應條件是升溫至60℃反應15分鐘后降至室溫。

在一優(yōu)選例中，所述式B所示化合物是與碳酸鈉先接觸，然后再與式A所示化合物接觸；

在一優(yōu)選例中，所述式B所示化合物與碳酸鈉的摩爾比為1:1-1：5，優(yōu)選1:2。

本發(fā)明第五方面提供了一種組合物，包含上述三種化合物之一。

本發(fā)明第六方面提供了上述三種化合物或者組合物在制備正電子放射性藥物中的應用。

在一優(yōu)選例中，所述正電子放射性藥物為放射性氟-18標記的PET顯像劑。

在一優(yōu)選例中，所述正電子放射性藥物為機體動態(tài)顯像劑和斷層顯像劑。

在一優(yōu)選例中，所述正電子放射性藥物為用于評價外周炎癥相關疾病的顯像劑。

在一優(yōu)選例中，所述外周炎癥相關疾病為腫瘤、肌肉炎癥、毛囊炎、扁桃體炎、肺炎、肝炎或腎炎。

在一優(yōu)選例中，所述正電子放射性藥物為神經系統(tǒng)疾病的早期診斷的顯像劑。

在一優(yōu)選例中，所述神經系統(tǒng)疾病選自腦中風、腦外傷、腦瘤、慢性肝性腦病、癲癇、帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病和肌萎縮側索硬化癥。

在一優(yōu)選例中，所述腦中風選自腦梗塞、腦缺血、腦卒中、腦栓塞和腦出血。

本發(fā)明使用的術語具有以下定義，除非另有描述：

本發(fā)明涉及的“單過硫酸氫鉀復合鹽”又名“過一硫酸氫鉀復合鹽”、“過硫酸氫鉀復合鹽”，它是一種無機過氧化物，過硫酸氫鉀一般與硫酸氫鉀、硫酸鉀結合成三合鹽的形式存在，因此稱之為單過硫酸氫鉀復合鹽，簡稱：PMPS或KMPS。最早由美國杜邦發(fā)明，商品名為OXONE。

本發(fā)明涉及的“mg”指的是毫克，“mL”指的是毫升。

本發(fā)明涉及的“QMA固相萃取柱”為Waters Sep-Pak light QMA固相萃取柱。

本發(fā)明涉及的“NEt₂”代表例如

本發(fā)明涉及的化合物代表其余依次類推。

本發(fā)明化學式中所涉及的“I”代表碘原子。

本發(fā)明涉及的裸環(huán)輔基SPIAd的中文名稱為(1R,3R,5R,7R)-螺[2,2’-[1,3]金剛烷]-4’,6’-二酮。

本發(fā)明涉及的“50％CH₃CN+50％0.1M甲酸銨水溶液”指的是CH₃CN和0.1M甲酸銨水溶液各以占比50％的體積比例混合，其余類似表述依次類推。

本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明提供的無載體放射性氟-18負離子標記目標化合物[¹⁸F]FDPA是設計將放射性氟-18同位素直接連接在芳環(huán)上，相比于現有技術，應用在PET影像時，可以避免發(fā)生潛在的代謝反應而產生非特異性結合的正電子成像信號，這樣就極大提高了PET影像的定量化分析的質量。

(2)本發(fā)明提供的無載體放射性氟-18負離子標記目標化合物[¹⁸F]FDPA的制備方法：以裸環(huán)三價碘葉立德作為標記前體，以無載體放射性氟-18作為放射源，設計并利用了非常溫和的堿性反應條件，一步得到目標化合物[¹⁸F]FDPA；其反應條件溫和，操作簡便，實現自動化標記，非衰減校正產率達到30％以上，純凈度高于98％，比活度高于296GBq/μmol(4Ci/μmol)。

(3)本發(fā)明將無載體放射性氟-18負離子標記目標化合物[¹⁸F]FDPA應用于炎癥動物模型(包括阿爾茲海默癥老鼠模型和腦缺血老鼠模型)中的PET影像學評價，結果證明[¹⁸F]FDPA作為示蹤劑具有很好的專一性、靶向型和穩(wěn)定性，為后續(xù)進行臨床炎癥相關疾病的診斷、新型TSPO配體藥物研發(fā)和劑量使用等提供了極大的科學支持。

附圖說明

圖1為本發(fā)明利用通用電氣公司Tracerlab FX_FN自動化合成系統(tǒng)合成[¹⁸F]FDPA的示意圖。

圖2為本發(fā)明的實施例3采用通用電氣公司Tracerlab FX_FN自動化合成系統(tǒng)制備[¹⁸F]FDPA的高效液相色譜檢測結果示意圖，由上至下分別為：HPLC柱壓力示意圖(其中橫坐標為時間，單位為分鐘；縱坐標為柱壓力，單位為MPa)；HPLC放射量檢測器的檢測信號圖譜(其中橫坐標為時間，單位為分鐘；縱坐標為放射量強度大小)；HPLC紫外檢測器的檢測信號圖譜(其中橫坐標為時間，單位為分鐘；縱坐標為紫外吸收大小)。

圖3為本發(fā)明實施例4中采用實施例2手動制備和實施例3自動制備的[¹⁸F]FDPA與標準品共注射的高效液相色譜檢測結果。從上至下分別為HPLC放射量檢測器的檢測信號圖譜和HPLC紫外檢測器的檢測信號圖譜。其中橫坐標為時間，單位為分鐘；上圖縱坐標代表放射量檢測器檢測信號，為[¹⁸F]FDPA放射線信；下圖縱坐標代表紫外檢測器檢測信號，為FDPA的紫外吸收峰。

圖4為本發(fā)明實施例6中利用[¹⁸F]FDPA進行的腦梗大鼠模型中的PET影像學評價的試驗結果示意圖。其中，圖4A為僅注射[¹⁸F]FDPA的成像圖，圖4B為預先1min注射PK11195，之后再注射[¹⁸F]FDPA的成像圖，圖4C為本發(fā)明實施例6中僅注射[¹⁸F]FDPA的時間-放射量曲線，圖4D為本發(fā)明實施例6中預先1min注射PK11195，之后再注射[¹⁸F]FDPA的時間-放射量曲線，圖4C和圖4D中，橫坐標為以分鐘為單位的時間，縱坐標為對[¹⁸F]FDPA的攝取量。

圖5為本發(fā)明實施例7中利用[¹⁸F]FDPA進行的腦梗大鼠模型的體外自顯影試驗結果示意圖。圖5A為僅用[¹⁸F]FDPA涂染缺血腦片的成像圖；圖5B為用[¹⁸F]FDPA和PK11195混合液涂染缺血腦片的成像圖；圖5C為圖5A和圖5B的定量化柱狀圖，其中縱坐標表示結合在腦片單位面積上[¹⁸F]FDPA的放射量，黑色實心區(qū)域表示缺血區(qū)域，即為圖5A的右側部分，白色空心區(qū)域表示常規(guī)區(qū)域，即為圖5A的左側部分。圖5B顯示是幾乎空白(原因是加入的PK11195把靶點全部占據了，[¹⁸F]FDPA根本沒有任何結合)，圖5C右側部分數據也就是圖5B的定量數據，即數據值極低。

圖6為本發(fā)明實施例8利用[¹⁸F]FDPA進行的12月大的正常老鼠和阿爾茲海默癥老鼠模型的體內PET影像及體外自顯影試驗結果示意圖。其中，圖6A是12個月大正常老鼠的體內動態(tài)掃描0-30min的PET成像合圖，分為軸向圖、冠狀圖和縱向圖；圖6B是12個月大阿爾茲海默癥老鼠的體內動態(tài)掃描0-30min的PET成像合圖，分為軸向圖、冠狀圖和縱向圖；位于圖6A圖和6B之間的柱狀是量化軸，顏色越深表示放射量越大，最大為2.0SUV；圖6C是12個月大正常老鼠和阿爾茲海默癥老鼠相同腦區(qū)的體外自顯影圖，量化軸表示顏色越深放射量攝取越多；圖6D是[¹⁸F]FDPA在12月大正常老鼠和阿爾茲海默癥老鼠腦內時間-放射量曲線圖，橫坐標為以分鐘為單位的時間，縱坐標為對[¹⁸F]FDPA的攝取量。

具體實施方式

除非特殊說明，本發(fā)明所用術語具有本發(fā)明所屬領域中的一般含義。

下面參考具體實施例，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品；所用試劑在未注明其他要求時,均指符合相應國家標準的分析純試劑。

實施例1

本實施例提供了一種化合物[¹⁸F]FDPA，具有如下結構：

化學名稱：N，N-二乙基-2-(2-(4-(氟18-氟代苯基))-5，7二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶)-3-基)乙酰胺

分子式：C₂₀H₂₃¹⁸FN₄O

分子量：353.43

此化合物可以作為靶向轉位蛋白TSPO的正電子藥物。

實施例2

本實施例提供了實施例1中的[¹⁸F]FDPA的制備方法(手動制備)，包括如下步驟：

步驟一：制備裸環(huán)輔基SPIAd

向4.8mL乙酸酐(成都化夏試劑，CAS108-24-7,貨號H1133817-500mL)中加入5.0g丙二酸(CAS:141-82-2，貨號:A11526-100g)，隨后加入24μL濃硫酸，反應體系升溫至60℃反應15分鐘后降至室溫。

在48mmol 2-金剛烷酮(Alfa Aesar,CAS 700-58-3,貨號：A14275-100g)中緩慢加入上述反應體系，約半小時到一小時之內加完即可，然后加壓蒸干所有溶劑，得到裸環(huán)輔基SPIAd初產品，將裸環(huán)輔基SPIAd初產品溶解在300mL無水乙醚中，用水返洗三次，每次200mL，收集有機相，用無水硫酸鎂干燥，過濾濃縮，之后所得產品用乙醚和正己烷(v：v＝1:3,10mL)進行重結晶，得到純凈產物，稱為裸環(huán)輔基SPIAd，產率52％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ3.60(s,2H),2.25–2.08(m,6H),1.91(s,2H),1.83–1.71(m,6H).¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ162.94,109.56,37.72,36.77,36.50,33.51,26.12ppm.HRMS(ESI/[M-H]^-)calcd.for C₁₃H₁₅O₄:235.0976,found 235.0979。

反應過程如下：

步驟二：制備裸環(huán)三價碘葉立德前體

(1)制備乙醇反應體系

將50mg(即0.11mmol)N，N-二乙基2-(2-(4-碘苯基)-5–二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺(結構如式1所示，該化合物的合成方法參考文獻：Damont,A.；Médran-Navarrete,V.；Cacheux,F.；Kuhnast,B.；Pottier,G.；Bernards,N.；Marguet,F.；Puech,F.；Boisgard,R.；Dollé,F.Novel Pyrazolo[1,5-a]pyrimidines as Translocator Protein 18kDa(TSPO)Ligands:Synthesis,in Vitro Biological Evaluation,[¹⁸F]-Labeling,and in Vivo Neuroinflammation PET Images.J.Med.Chem.,2015,58,7449–7464.)溶解在由0.39mL三氟乙酸和0.13mL氯仿組成的混合溶液中，再向其中加入100mg(即0.165mmol)單過硫酸氫鉀復合鹽(Sigma-Aldrich，CAS號70693-62-8，貨號與規(guī)格228036-100G)，室溫下攪拌50分鐘后，加壓蒸發(fā)掉所有溶劑得到初產品，將此初產品置于真空泵上抽干約30分鐘，隨后加入3.0mL乙醇，得到乙醇反應體系。

(2)反應制備裸環(huán)三價碘葉立德前體的粗產品

取步驟一制備得到的裸環(huán)輔基SPIAd 25.3mg(即0.11mmol)溶于0.5mL的10％(m/m)的碳酸鈉水溶液中，緩慢加入上述乙醇反應體系，室溫下劇烈攪拌下至體系呈透明狀，隨后向其中補加0.3mL的10％的碳酸鈉水溶液中調整pH等于9。反應液室溫下劇烈攪拌1小時后，加5mL水稀釋體系，隨后用二氯甲烷萃取三次，每次5mL。合并有機相，用無水硫酸鎂干燥后，過濾旋干有機溶劑，得到裸環(huán)三價碘葉立德前體的粗產品。

(3)裸環(huán)三價碘葉立德前體的粗產品的純化

將裸環(huán)三價碘葉立德前體的粗產品進行硅膠色譜柱層析，洗脫體系為200mL的乙酸乙酯，之后加大極性至甲醇和乙酸乙酯的混合液(v/v＝1:10，200mL)，得到產物濃縮旋干為白色固體粉末狀，即裸環(huán)三價碘葉立德前體(式2)，質量26.1mg，產率為34％。表征如下：Mp 142-143℃.¹H NMR(300MHz,DMSO)δ7.87-7.81(m,4H),6.90(s,1H),3.89(s,2H),3.50(q,J＝7.2Hz,2H),3.31(s,3H),3.24(q,J＝7.1Hz,2H),2.69(s,3H),2.34(s,2H),1.93(d,J＝13.8Hz,4H),1.79(s,2H),1.65(d,J＝11.0Hz,6H),1.19-1.13(m,3H),0.9(t,J＝7.2Hz,3H)；¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ169.2,163.0,158.4,152.5,147.6,145.2,136.4,132.9,130.5,116.3,109.5,105.5,102.2,58.0,42.1,37.0.35.3,33.7,27.7,26.4,24.7,16.7,14.7,13.5；HRMS(m/z):[M+Na]⁺calculated for 719.1706,found 719.1703.

反應過程如下：

步驟三：利用裸環(huán)三價碘葉立德前體制備[¹⁸F]FDPA

(1)利用QMA固相萃取柱捕獲氟-18負離子

氟-18負離子的生產是通過¹⁸O(p,n)¹⁸F，應用小體積[¹⁸O]H₂O靶，用18MeV的質子束流持續(xù)轟擊60min。利用Waters Sep-Pak light QMA固相萃取柱(天津德祥茂隆科技有限公司，WAT023525，SEP-PAK LIGHT QMA 50BX。)，從[¹⁸O]H₂O捕獲并分離8-10mCi的高純度氟-18負離子，具體操作步驟參考文獻：Damont,A.；Hinnen,F.；Kuhnast,B.；-Peyronneau,M.；James,M.；Luus,C.；Tavitian,B.；Kassiou,M.；Dollé,F.Radiosynthesis of[¹⁸F]DPA-714,a selective radioligand for imaging the translocator protein(18kDa)with PET.J.Labelled Comp.Radiopharm.2008,51,286-292。

(2)洗脫QMA固相萃取柱上的氟-18負離子

將13.5mg四丁基甲磺酸銨(Tetrabutylammonium methanesulfonate，TBAOMs，CAS 65411-49-6,上海瀚鴻化學，SR15010135)溶于由0.5mL乙腈和0.5mL水組成的混合溶液中，得到洗脫液；利用1mL注射器吸取洗脫液后將注射器與QMA固相萃取柱連接，以6mL/min的流速緩慢推出洗脫液，使之流經QMA固相萃取柱時充分洗脫其上吸附的8-10mCi的氟-18負離子同位素，收集在V形反應瓶中。

這里需要強調的是，通常洗脫氟-18負離子時采用的堿液為碳酸鉀或四乙基碳酸氫銨的乙腈/水混合溶液，pH在9-10左右；但該堿性環(huán)境下裸環(huán)三價碘葉立德前體會在放射標記條件下(氟-18負離子)迅速分解，無法完成下列步驟(4)的反應，也就無法得到標記產物。經過反復嘗試，最后選擇弱的pH為7-8的四丁基甲磺酸銨(tetrabutylammonium methanesulfonate，TBAOMs)洗脫時，下面步驟(4)的反應才能發(fā)生，這是通過長期摸索且不斷嘗試才發(fā)現的，是本發(fā)明非常突出的特點。此外，pH在7-8的其它堿例如四乙基高氯酸銨(tetraethylammonium perchlorate，TEAOCl₄)、草酸鉀或四乙基三氟甲磺酸銨(Tetraethylammonium trifluoromethanesulfonate,TEAOTf)也可實現部分轉化，但經多次條件篩選結果發(fā)現采用TBAOMs時標記產率是最高的。

(3)氟-18負離子的共沸干燥

將V形反應瓶置于110℃進行加熱，并同時伴有10mL/min流速的干燥氮氣鼓吹，進行5分鐘后V形反應瓶中的溶劑完全被吹干，之后向其中加入1mL無水乙腈，繼續(xù)在110℃加熱條件下，并同時伴有10mL/min流速的干燥氮氣進行鼓吹，進行5分鐘后至溶劑完全被吹干，此過程重復3次，最后一次將V形反應瓶從加熱器中取出，氮氣鼓吹至體系溫度降至室溫。

(4)氟-18負離子與裸環(huán)三價碘葉立德前體的反應生成[¹⁸F]FDPA

將步驟二制備得到的1.8mg的裸環(huán)三價碘葉立德前體(式2)溶于1mL乙腈中，隨后加入本步驟中(3)的V形反應瓶中，體系封口，置于加熱器中在120℃下反應12分鐘，然后將V形反應瓶從加熱器中取出置于冰中冷卻30秒后開蓋，加入0.5mL由乙腈與水(體積比為1:1)組成的混合溶液終止反應。

反應過程如下：

(5)[¹⁸F]FDPA的分離純化

將所有反應溶液(含有式3)注射入半制備高效液相色譜HPLC進行分離純化。

高效液相色譜法分離純化條件如下：

色譜儀器：美國沃特世高效液相色譜儀

半制備色譜柱:CAPCELL PAK C₁₈,250x 10mm

流動相:45％乙腈+55％水，混合完畢后加入總體積0.1％的三乙胺。

三者混合后，超聲1min去除空氣氣泡，即得流動相。

流速:5.0mL/min

柱溫：23℃

檢測器：沃特世2487雙波長吸收檢測器(Waters 2487DualλAbsorbance Detector)由紫外檢測器(λ＝254nm)和放射量檢測器共同檢測。

收集產物保留時間：14.7分鐘

收集分離得到的產物，蒸干所有溶劑，重新溶于3毫升無菌生理鹽水中，并通過0.22微米針頭式濾器，得到可供注射用的[¹⁸F]FDPA放射量為2.8±0.6GBq(75.6±16.2mCi)。全部反應時間為75分鐘，衰減校正產率為49±12％，比活度大于260GBq/μmol(7Ci/μmol)。

產物鑒定：

(1)經測試，[¹⁸F]FDPA的半衰期為110.1±0.2分鐘，符合[¹⁸F]同位素的半衰期數值，說明其同位素純度高。

(2)通過與非放射性化合物FDPA的共注射HPLC判斷，產物結構為式3所示化合物(對應于權利要求的式D所示化合物)。具體譜圖數據見實施例4。

實施例3

本實施例提供了[¹⁸F]FDPA合成系統(tǒng)，如圖1所示，包括：

氟-18負離子產生裝置；

氟-18負離子洗脫裝置；

加料裝置；

反應裝置；

HPLC純化裝置；

萃取、收集裝置；

以及閥門v1、閥門v3、閥門v5、閥門v6、閥門v7、閥門v8、閥門v10、閥門v13、閥門v18、閥門v20、閥門v24和閥門v25。

所述氟-18負離子產生裝置包括GE回旋加速器和氦氣產生器，所述GE回旋加速器經過氦氣產生器通過閥門v10與洗脫裝置的QMA固相萃取柱連接，

所述氟-18負離子洗脫裝置包括洗脫液產生器和QMA固相萃取柱，所述洗脫液產生器為小瓶1，小瓶1依次通過閥門v1和v10與QMA固相萃取柱上下連接，所述QMA固相萃取柱分別通過閥門v10和閥門v13與反應裝置的反應瓶12上下連接。

所述加料裝置包括小瓶3、小瓶5和小瓶6，所述小瓶3通過閥門v3與反應裝置的反應瓶12上下連接，所述小瓶5通過閥門v5與反應裝置的反應瓶12上下連接，所述小瓶6通過閥門v6與反應裝置的反應瓶12上下連接

所述反應裝置包括反應瓶12。

所述HPLC純化裝置包括瓶14和半制備HPLC設備

所述萃取、收集裝置包括大瓶15、C18固相萃取柱16、小瓶7、小瓶8、收集瓶17和針頭式濾器，所述小瓶7通過閥門v7與C18固相萃取柱16上下連接，所述小瓶8通過閥門v8與C18固相萃取柱16上下連接。

本實施例接著利用上述[¹⁸F]FDPA合成系統(tǒng)進行[¹⁸F]FDPA的制備(自動化制備)，包括如下步驟：

(1)利用QMA固相萃取柱捕獲氟-18負離子

使用GE回旋加速器通過¹⁸O(p，n)¹⁸F核反應產生的放射性氟-18負離子通過閥門v10進入反應模塊中，隨后通過氦氣產生器產生的氦氣壓力被吸附于Waters QMA固相萃取柱上。

(2)洗脫QMA固相萃取柱上的氟-18負離子

將20.0mg四丁基甲磺酸銨(TBAOMs)溶于由0.5mL乙腈和0.5mL水組成的混合溶液中，預先注入小瓶1中，反應開始后通過真空泵將小瓶1中的TBAOMs溶液通過閥門v10、QMA固相萃取柱、閥門v11抽入反應瓶12中，即將放射性氟-18負離子從QMA固相萃取柱上洗脫至反應瓶12中。

(3)氟-18負離子的共沸干燥

反應瓶12處開始85℃進行加熱、鼓氮氣過程，持續(xù)3分鐘后，在氦氣壓力下將預先置于小瓶5中的1mL干燥乙腈溶液注入反應瓶12，85℃下鼓氮氣8分鐘，之后體系升至110℃，鼓氮氣同時進行真空抽氣，持續(xù)4分鐘，確保反應瓶12中的溶劑全部蒸干。之后反應體系在空氣氣流下降溫至40℃待加料。

(4)氟-18負離子與裸環(huán)三價碘葉立德前體的反應生成[¹⁸F]FDPA

預先將2mg裸環(huán)三價碘葉立德前體(式2，制備方法見實施例2)溶于1mL無水乙腈中，加入小瓶3中，在氦氣壓力下將小瓶3的該溶液通過閥門v3注入反應瓶12中，隨后關閉反應瓶12周圍的閥門v13、閥門v20和閥門v24，反應體系升溫至120℃反應12分鐘。反應完畢后打開閥門v24和閥門v25，體系降溫至40℃，然后將預先置于小瓶6中的由1.5mL乙腈和1.5mL水組成的混合溶液加入反應體系停止反應。

(5)[¹⁸F]FDPA的分離純化

在瓶14中預先加入2.5mL的HPLC流動相溶劑，反應瓶12中的全部溶液由氦氣壓力轉移至瓶14中，接著將瓶14中的所有溶液通過氦氣壓力注射入半制備HPLC設備中，隨即開始分離純化，

高效液相色譜法分離純化條件如下：

色譜儀器：美國沃特世高效液相色譜儀

半制備色譜柱:Luna C18semi-preparative,250×10.00mm,

流動相:50％CH₃CN+50％0.1M甲酸銨水溶液

流速:5.0mL/min

柱溫：23℃

檢測器：沃特世2487雙波長吸收檢測器(Waters 2487DualλAbsorbance Detector)由紫外檢測器(λ＝254nm)和放射量檢測器共同檢測。

(6)萃取、收集

高效液相色譜法檢測結果如圖2所示，將產物峰對應的部分(保留時間為17.2分鐘，見圖2中的方框部分)，通過閥門v18收集如大瓶15中，大瓶15中預先加入了23mL注射用級別的無菌水(United States Pharmacopeia(USP)；Hospira)；大瓶15中的溶液在氦氣壓力作用下通過置于16號位置的C18固相萃取柱(即Waters Sep-pak C18固相萃取小柱，產品編號WAT043395)，并用小瓶7中預先加入的10mL無菌水沖洗C18固相萃取柱16以去除可能殘余的鹽類雜質、HPLC流動相和放射性氟-18負離子。最后在氦氣壓力下利用小瓶8中預先注入的1.0mL無水乙醇洗脫C18固相萃取柱16上的產物，收集至預先加入了10mL無菌生理鹽水的產物收集瓶17中。收集瓶17中的所有溶液在氦氣壓力作用下通過0.22微米針頭式濾器，得到可供注射用的[¹⁸F]FDPA。

自動化合成完畢后，測量得到產物[¹⁸F]FDPA的非衰減校正產率為27±5％(n＝7)，比活度大于148GBq/μmol(4Ci/μmol)。

實施例4

將實施例2和實施例3制備得到的[¹⁸F]FDPA均進行產物純度及專一性測試，以確定收集產物是[¹⁸F]FDPA。具體方法為采用高效液相色譜法：取0.2mg FDPA(結構如下圖)溶解于1mL乙腈中；將實施例2和實施例3制備得到的[¹⁸F]FDPA溶液各吸取0.1mL，分別溶于上述乙腈溶液中。得到的溶液震蕩混合后，分別注射入HPLC中。

化學名稱：N，N-二乙基-2-(2-(4-氟苯基))-5，7二甲基吡唑[1,5-a]嘧啶)-3-基)乙酰胺

簡稱：FDPA

分子量：354.43

性狀：白色固體粉末，無特殊氣味，不揮發(fā)。

合成方法見參考文獻：Selleri,S.；Bruni,F.；Costagli,C.；Costanzo,A.；Guerrini,G.；Ciciani,G.；Costa,B.；Martini,C.2‐Arylpyrazolo[1,5‐a]pyrimidin‐3‐yl Acetamides.New Potent and Selective Peripheral Benzodiazepine Receptor Ligands,Bioorg.Med.Chem.2001,9,2661–2671.

高效液相色譜法檢測條件如下：

色譜儀器：美國沃特世高效液相色譜儀

分析色譜柱:Phenomenex Luna C18,250x 4.6mm

流動相:70％CH₃CN+30％0.1M甲酸銨水溶液

流速:1.0mL/min

柱溫：23℃

檢測器：沃特世2487雙波長吸收檢測器(Waters 2487DualλAbsorbance Detector)，由紫外檢測器(λ＝254nm)和放射量檢測器共同檢測(紫外檢測器串聯在放射量檢測器之前，即物質隨流動相先流經紫外檢測器，再流經放射量檢測器，所以從精確性上，紫外出峰一般早于放射峰大約0.1-0.2min左右被認為是同時出峰)。

高效液相色譜法檢測結果如圖3所示。從圖可知，出峰信號時間完全一致，從而確定經質量控制測試后，實施例2的手動制備得到的[¹⁸F]FDPA及實施例3自動制備得到的[¹⁸F]FDPA結構確定無誤，化學及放射化學純度均大于99％，滿足臨床前PET影像要求。

實施例5

本實施例提供了[¹⁸F]FDPA在動物血漿中的穩(wěn)定性評價，具體方法為：

分別利用實施例2和實施例3制備的[¹⁸F]FDPA各分5份，每份10μL，約2.0MBq(54μCi)，均與100μL正常血漿(購于美國Abcam公司)混合，在37℃震蕩下孵育。分別在20min、40min、60min、90min、120min依次取出混合液，加入等體積的乙腈溶液使蛋白變性，劇烈震蕩后離心2min(離心速率為6000轉每分鐘)沉降蛋白，然后吸取上清液50μL注射入高效液相色譜中，根據放射檢測器出峰時間來判斷[¹⁸F]FDPA在動物血漿中的穩(wěn)定性。

高效液相色譜儀器：美國沃特世高效液相色譜儀

分析色譜柱:Phenomenex Luna C18,250x 4.6mm

流動相:70％CH₃CN+30％0.1M甲酸銨水溶液

流速:1.0mL/min

柱溫：23℃

檢測器：沃特世2487雙波長吸收檢測器(Waters 2487DualλAbsorbance Detector)，由紫外檢測器(λ＝254nm)和放射量檢測器共同檢測。

結果顯示，[¹⁸F]FDPA在37℃下動物血清中非常穩(wěn)定，120分鐘之內沒有任何分解，這同時也說明了[¹⁸F]FDPA用在PET影像時可以避免發(fā)生潛在的代謝反應而產生非特異性結合的正電子成像信號。

實施例6

本實施例為利用[¹⁸F]FDPA進行了腦梗大鼠模型中的PET影像學評價，具體方法為：

制備腦梗大鼠模型，在手術七天后，通過尾靜脈注射入20MBq(540μCi)實施例2的[¹⁸F]FDPA，動態(tài)掃描90分鐘，進行PET影像實驗。老鼠模型制作方式及PET掃描操作見參考文獻：Tiwari,A.K.；Yui,J.；Fujinaga,M.；Kumata,K.；Shimoda,Y.；Yamasaki,T.；Xie,L.；Hatori,A.；Maeda,J.；Nengaki,N.；Zhang M.-R.Characterization of a novel acetamidobenzoxazolone-based PET ligand for translocator protein(18kDa)imaging of neuroinflammation in the brain.J.Neurochem.2014,129,712-720。

PET影像實驗結果如圖4所示，結果顯示，在腦梗一側[¹⁸F]FDPA的攝取量明顯高于正常腦側；腦梗側的最大攝取量出現在注射后的第10分鐘，為1.20±0.08SUV；正常腦側最大攝取量僅為0.54±0.01SUV，并且呈較快的消除行為，第2分鐘攝取量與第45分鐘攝取量比值為2.7；在注射后第10分鐘和第90分鐘，腦梗側和正常腦側的攝取量比值分別為5.41±0.12和4.26±0.34，有明顯差異；抑制實驗采用預先通過尾靜脈注射靶向TSPO的配體PK11195(3毫克每千克)，之后1分鐘時再注射示蹤劑[¹⁸F]FDPA，結果顯示腦梗側和正常腦側對示蹤劑的攝取量幾乎一致，表明了[¹⁸F]FDPA在體內有很好的靶向性、專一性。

進而，利用簡化參照組織模型分析方法，對[¹⁸F]FDPA在體內與轉位蛋白TSPO的非取代性結合能力(BP_ND)進行了計算。結果表明，[¹⁸F]FDPA對TSPO的結合能力高達4.02±1.32(p<0.05)，優(yōu)于現有已經報道的示蹤劑[¹¹C]MBMP(2.03±0.24,p<0.05)，[¹⁸F]FEBMP(2.72±0.27,p<0.05)和[¹¹C]PK11195(1.59±0.33,p<0.05)，說明[¹⁸F]FDPA將對定量化TSPO能提供更加準確的科學信息。

實施例7

本實施例提供了利用實施例2制備得到的[¹⁸F]FDPA進行的腦梗大鼠模型的體外自顯影試驗，利用[¹⁸F]FDPA對腦梗模型大鼠腦片進行培育。老鼠模型腦片制作方式及自顯影數據采集操作見參考文獻：Tiwari,A.K.；Yui,J.；Fujinaga,M.；Kumata,K.；Shimoda,Y.；Yamasaki,T.；Xie,L.；Hatori,A.；Maeda,J.；Nengaki,N.；Zhang M.-R.Characterization of a novel acetamidobenzoxazolone-based PET ligand for translocator protein(18kDa)imaging of neuroinflammation in the brain.J.Neurochem.2014,129,712-720。

結果如圖5所示，結果顯示，對比于正常腦側，腦梗側攝取信號明顯高，腦梗側與正常腦側的信號比約為7:1；相似的，將2.0MBq(54μCi)[¹⁸F]FDPA與1mg PK11195(上海浩然生物技術有限公司，品牌ALEXIS，貨號ALX-550-346-M010，規(guī)格10mg)混合后對腦片進行培育，發(fā)現信號差異消失。這些結果說明了[¹⁸F]FDPA在體外具有很好的靶向型和專一性。

實施例8

本實施例提供了針對實施例2制備得到的[¹⁸F]FDPA的阿爾茲海默癥老鼠模型評價。具體的，是對12個月大的正常老鼠(B6C3F1/J)和阿爾茲海默癥轉基因老鼠模型(APP/PS1)(購自北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司，購買網址：http://www.bio-equip.com/sho w1service.asp？serviceid＝13039)進行了[¹⁸F]FDPA的評價工作。

具體步驟為：將正常老鼠和上述阿爾茲海默癥轉基因老鼠麻醉后置于小動物PET掃描儀中，分別通過尾靜脈注射方式將實施例2制備得到的可供注射用的[¹⁸F]FDPA150μL(約45μCi放射量)緩慢注射入兩種老鼠體內，注射時間均為10秒，隨即開始分別進行動態(tài)掃描，時間長度為60分鐘，影像采集窗口設置為0.5分鐘2個、1分鐘5個、12分鐘2個、30分鐘1個(共10個)。掃描完畢后機器自動進行數據整理，轉換成可供分析的PET圖像。

結果顯示，在APP/PS1老鼠模型中，[¹⁸F]FDPA可以迅速通過血腦屏障，在注射后3分鐘達到1.50±0.13SUV，對比于正常老鼠對[¹⁸F]FDPA的攝取量而言，阿爾茲海默癥老鼠大腦攝取量高1.6倍；體外自顯影實驗表明，轉基因老鼠腦片中大腦皮層、丘腦、紋狀體各腦區(qū)攝取量對小腦攝取量比值遠遠高于同樣年齡的正常老鼠相應區(qū)域攝取量，說明[¹⁸F]FDPA可以作為阿爾茲海默癥疾病的早期診斷試劑。