本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年1月22日、申請(qǐng)人為基因組股份公司、發(fā)明名稱為“利用合成氣或其它氣態(tài)碳源和甲醇的方法和有機(jī)體”的中國(guó)專利申請(qǐng)200980110100.7的分案申請(qǐng)。本申請(qǐng)案主張2008年1月22日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/022,804號(hào)和2008年6月5日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/059,256號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容各自以引用的方式并入本文。本發(fā)明一般涉及生物合成方法，且更特定地涉及能夠使用合成氣或其它氣態(tài)碳源和甲醇的有機(jī)體。
背景技術(shù)：
：合成氣體(合成氣)是主要由h2和co組成的混合物，可經(jīng)由氣化任何有機(jī)進(jìn)料，例如煤、煤油、天然氣、生物質(zhì)或有機(jī)廢物來(lái)獲得。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出眾多氣化方法，且大部分設(shè)計(jì)是基于在高溫(500-1500℃)下部分氧化(其中限制氧氣含量以避免完全燃燒)有機(jī)物質(zhì)以提供作為0.5:1-3:1h2/co混合物的合成氣。有時(shí)候添加蒸汽以增加氫氣含量，這通常伴隨著經(jīng)水煤氣變換反應(yīng)增加co2產(chǎn)量?，F(xiàn)今，煤是用于工業(yè)制造合成氣的主要基質(zhì)，而合成氣傳統(tǒng)上用于加熱和供能，并且用作甲醇和液態(tài)烴的費(fèi)托合成(fischer-tropschsynthesis)的原料。許多大型化學(xué)和能源公司大規(guī)模地利用煤氣化方法，并在工業(yè)上應(yīng)用這種技術(shù)。除煤以外，許多類型的生物質(zhì)也用于產(chǎn)生合成氣。例如合成氣和co2等氣態(tài)基質(zhì)代表著可用于以生物學(xué)方法制造再生化學(xué)物和燃料的最廉價(jià)且取材最靈活的原料。在第二次世界大戰(zhàn)期間，有超過(guò)一百萬(wàn)個(gè)的小規(guī)模生物質(zhì)氣化裝置投入運(yùn)行，主要是在歐洲，用于驅(qū)動(dòng)小汽車、卡車、輪船和公共汽車。目前有至少3種主要的生物質(zhì)氣化技術(shù)已被驗(yàn)證在工業(yè)規(guī)模下(>20,000,000磅生物質(zhì)/年)有效或正處在被驗(yàn)證的過(guò)程中。生物質(zhì)氣化技術(shù)正在進(jìn)行商業(yè)實(shí)踐，尤其用于熱量和能量產(chǎn)生。生物質(zhì)氣化技術(shù)與燃料或化學(xué)物制造的整合還在開(kāi)發(fā)中，且尚未被證明以商業(yè)規(guī)模廣泛應(yīng)用?？偟膩?lái)說(shuō)，在幾乎世界上任何地點(diǎn)，從包括煤、生物質(zhì)、廢物、聚合物等在內(nèi)的眾多物質(zhì)節(jié)省成本地產(chǎn)生合成氣的技術(shù)當(dāng)前是存在的。因?yàn)榭梢詮陌ㄉ镔|(zhì)在內(nèi)的大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生合成氣，所以使用合成氣的好處包括取材靈活。另一個(gè)好處在于合成氣很便宜，每百萬(wàn)英熱單位的成本為≤$6，表示每磅產(chǎn)物的原料成本為≤$0.10。另外，還存在有效利用合成氣的已知途徑，正如在例如梭菌屬(clostridiumspp.)等有機(jī)體所發(fā)現(xiàn)的。雖然可以獲得利用合成氣的有機(jī)體，但一般來(lái)說(shuō)，已知有機(jī)體的特征不清楚且不是非常適用于商業(yè)開(kāi)發(fā)。舉例來(lái)說(shuō)，梭菌和相關(guān)細(xì)菌是嚴(yán)格厭氧菌，無(wú)法耐受高濃度的某些產(chǎn)物(例如丁醇)，因此限制了滴定度和商業(yè)化潛力。梭菌還產(chǎn)生很多種產(chǎn)物，這在獲得期望產(chǎn)物方面帶來(lái)了分離問(wèn)題。最后，用于操作梭菌基因的靈巧基因工具的開(kāi)發(fā)尚處在初期；因此，它們不能容易地經(jīng)受基因工程以便改進(jìn)期望產(chǎn)物的產(chǎn)率或生產(chǎn)特征。因此，需要開(kāi)發(fā)可利用合成氣或其它氣態(tài)碳源來(lái)產(chǎn)生期望化學(xué)物和燃料的微生物和其使用方法。更特定地說(shuō)，需要開(kāi)發(fā)用于合成氣利用的微生物，其還具有現(xiàn)有的有效基因工具，使其能夠經(jīng)受快速工程改造以便以有用的速率和數(shù)量產(chǎn)生有價(jià)值產(chǎn)物。本發(fā)明滿足此項(xiàng)需求且提供相關(guān)優(yōu)勢(shì)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有乙酰-coa途徑且能夠利用合成氣或合成氣和甲醇。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將co、co2和/或h2轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a(乙酰-coa)、甲基四氫葉酸(甲基-thf)或其它期望產(chǎn)物的途徑的外源蛋白質(zhì)，其中在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下，所述微生物缺乏將co或co2和h2轉(zhuǎn)化為乙酰-coa或甲基四氫葉酸的能力。舉例來(lái)說(shuō)，微生物有機(jī)體可含有至少一種編碼乙酰-coa途徑中的酶或蛋白質(zhì)的外源核酸。微生物有機(jī)體能單獨(dú)利用包含co、co2和/或h2的合成氣或組合利用合成氣和甲醇以產(chǎn)生乙酰-coa。本發(fā)明另外提供一種產(chǎn)生乙酰-coa的方法，例如通過(guò)培養(yǎng)產(chǎn)生乙酰-coa的微生物有機(jī)體，其中所述微生物有機(jī)體在用于產(chǎn)生乙酰-coa的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)至少一種編碼乙酰-coa途徑酶或蛋白質(zhì)的外源核酸以產(chǎn)生乙酰-coa。附圖說(shuō)明圖1顯示利用合成氣作為碳源的示例性wood-ljungdahl途徑。描繪甲基分支，其顯示利用合成氣產(chǎn)生甲基-四氫葉酸(me-thf)。所述甲基分支所涉及的酶依據(jù)圖中所示編號(hào)分別為：1.鐵氧還蛋白氧化還原酶、2.甲酸脫氫酶、3.甲酰四氫葉酸合成酶、4.次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、5.亞甲基四氫葉酸脫氫酶、和6.亞甲基四氫葉酸還原酶。圖2顯示利用合成氣作為碳源的示例性wood-ljungdahl途徑。描繪羰基分支，其顯示利用合成氣產(chǎn)生乙酰輔酶a(乙酰-coa)。氫化酶(12)是合成氣的氫轉(zhuǎn)化為還原當(dāng)量所必需的，而還原當(dāng)量是許多所述反應(yīng)所必需的。所述羰基分支所涉及的酶依據(jù)圖中所示編號(hào)分別是：7.鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白、8.甲基轉(zhuǎn)移酶、9.一氧化碳脫氫酶、10.乙酰-coa合成酶、11.乙酰-coa合成酶二硫鍵還原酶、和12.氫化酶。圖3顯示代謝途徑圖解，其描繪wood-ljungdahl和丁醇產(chǎn)生途徑的整合。能利用合成氣生長(zhǎng)的有機(jī)體典型地獨(dú)有的轉(zhuǎn)化有：1)co脫氫酶，2)氫化酶，3)能量守恒氫化酶(ech)，和4)雙功能co脫氫酶/乙酰-coa合成酶。圖4a和圖4b顯示描繪利用合成氣產(chǎn)生丁醇的過(guò)程的圖解。圖4a顯示合成氣產(chǎn)丁醇過(guò)程的方塊流程圖。圖4b顯示氣化器的細(xì)節(jié)。asu代表氣體分離單元。圖5顯示建議的對(duì)深紅紅螺菌(rhodospirillumrubrum)的聚羥基丁酸(phb)途徑的改造，以便形成1-丁醇。粗體箭頭指示經(jīng)由異源表達(dá)形成丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum/c.acetobutylicum)的1-丁醇途徑的4-基因操縱子而引入的反應(yīng)步驟。所用的縮寫(xiě)有：phb，聚β-羥基丁酸；phbc，phb合成酶；crt，巴豆酸酶；bcd，丁酰輔酶a脫氫酶；etf，電子傳遞黃素蛋白；adhe2，醛/醇脫氫酶。圖6顯示完全wood-ljungdahl途徑，其允許包含co、co2和/或h2的氣體轉(zhuǎn)化為乙酰-coa，乙酰-coa隨后可被轉(zhuǎn)化為例如乙醇或乙酸等細(xì)胞物質(zhì)和產(chǎn)物?？山?jīng)工程改造為生產(chǎn)宿主中的示例性的特異性酶促轉(zhuǎn)化被編號(hào)?？s寫(xiě)：10fthf，10-甲酰四氫葉酸；5mthf，5-甲基四氫葉酸；actp，乙酰磷酸；for，甲酸；methf，亞甲基四氫葉酸；mlthf，次甲基四氫葉酸；thf，四氫葉酸。所述途徑所涉及的酶依據(jù)圖中所示編號(hào)分別為：1)甲酸脫氫酶、2)甲酰四氫葉酸合成酶、3)次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶、5)亞甲基四氫葉酸還原酶、6)甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(acse)、7)類咕啉鐵硫蛋白(acsd)、8)鎳蛋白裝配蛋白(acsf&cooc)、9)鐵氧還蛋白(orf7)、10)乙酰-coa合成酶(acsb&acsc)、11)一氧化碳脫氫酶(acsa)、12)丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(por)、和13)氫化酶(hyd)。圖7顯示合成代謝途徑，其允許包含co、co2和/或h2的氣體和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-coa?？山?jīng)工程改造為生產(chǎn)宿主的特異性酶促轉(zhuǎn)化被編號(hào)。其它縮寫(xiě)：meoh，甲醇。所述途徑所涉及的酶依據(jù)圖中所示編號(hào)分別為：1)甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶(mtab)、2)類咕啉蛋白(mtac)、3)甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(mtaa)、4)甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(acse)、5)類咕啉鐵硫蛋白(acsd)、6)鎳蛋白裝配蛋白(acsf&cooc)、7)鐵氧還蛋白(orf7)、8)乙酰-coa合成酶(acsb&acsc)、9)一氧化碳脫氫酶(acsa)、10)丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(por)、和11)氫化酶(hyd)。圖8顯示將甲醇、co和co2轉(zhuǎn)化為細(xì)胞物質(zhì)(cellmass)和發(fā)酵產(chǎn)物的途徑(目標(biāo)1)。圖9顯示10μgacs90(泳道1)、acs91(泳道2)、mta98/99(泳道3和4)的細(xì)胞提取物、大小標(biāo)準(zhǔn)物(泳道5)和熱乙酸穆?tīng)柺暇?m.thermoacetica)codh(moth_1202/1203)或mtr(moth_1197)蛋白的對(duì)照(50、150、250、350、450、500、750、900和1000ng)的western印跡。圖10顯示co氧化分析結(jié)果。培養(yǎng)細(xì)胞(具有codh/acs操縱子的熱乙酸穆?tīng)柺暇虼竽c桿菌；acs90或acs91或空白載體pza33s)并制備提取物。在55℃在提取物制備當(dāng)天的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)執(zhí)行分析。歷經(jīng)120秒的時(shí)間，在578nm下跟蹤甲基紫精的還原。圖11顯示合成代謝途徑，其用于將包含co、co2和/或h2的氣體和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-coa并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸。其中所述途徑所涉及的酶依據(jù)圖中所示編號(hào)分別為：1)甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶(mtab)、2)類咕啉蛋白(mtac)、3)甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(mtaa)、4)甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(acse)、5)類咕啉鐵硫蛋白(acsd)、6)鎳蛋白裝配蛋白(acsf&cooc)、7)鐵氧還蛋白(orf7)、8)乙酰-coa合成酶(acsb&acsc)、9)一氧化碳脫氫酶(acsa)、10)丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(por)、11)氫化酶(hyd)、12)乙酰乙酰-coa硫解酶(atob)、13)3-羥基丁酰-coa脫氫酶(hbd)、14)巴豆酸酶(crt)、15)巴豆酰-coa水合酶(4-budh)、16)4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)移酶、17)磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶、和18)4-羥基丁酸激酶。圖12顯示合成代謝途徑，其用于將包含co、co2和/或h2的氣體和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-coa并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為1,4-丁二醇。其中所述途徑所涉及的酶依據(jù)圖中所示編號(hào)分別為：1)甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶(mtab)、2)類咕啉蛋白(mtac)、3)甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(mtaa)、4)甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(acse)、5)類咕啉鐵硫蛋白(acsd)、6)鎳蛋白裝配蛋白(acsf&cooc)、7)鐵氧還蛋白(orf7)、8)乙酰-coa合成酶(acsb&acsc)、9)一氧化碳脫氫酶(acsa)、10)丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(por)、11)氫化酶(hyd)、12)乙酰乙酰-coa硫解酶(atob)、13)3-羥基丁酰-coa脫氫酶(hbd)、14)巴豆酸酶(crt)、15)巴豆酰-coa水合酶(4-budh)、16)4-羥基丁酰-coa還原酶(醇形成型)、17)4-羥基丁酰-coa還原酶(醛形成型)、和18)1,4-丁二醇脫氫酶。圖13顯示合成代謝途徑，其用于將包含co、co2和/或h2的氣體轉(zhuǎn)化為乙酰-coa并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸。其中所述途徑所涉及的酶依據(jù)圖中所示編號(hào)分別為：1)甲酸脫氫酶、2)甲酰四氫葉酸合成酶、3)次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶、5)亞甲基四氫葉酸還原酶、6)甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(acse)、7)類咕啉鐵硫蛋白(acsd)、8)鎳蛋白裝配蛋白(acsf&cooc)、9)鐵氧還蛋白(orf7)、10)乙酰-coa合成酶(acsb&acsc)、11)一氧化碳脫氫酶(acsa)、12)丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(por)、13)氫化酶(hyd)、14)乙酰乙酰-coa硫解酶(atob)、15)3-羥基丁酰-coa脫氫酶(hbd)、16)巴豆酸酶(crt)、17)巴豆酰-coa水合酶(4-budh)、18)4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)移酶、19)磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶、和20)4-羥基丁酸激酶。圖14顯示合成代謝途徑，其用于將包含co、co2和/或h2的氣體轉(zhuǎn)化為乙酰-coa并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為1,4-丁二醇。其中所述途徑所涉及的酶依據(jù)圖中所示編號(hào)分別為：1)甲酸脫氫酶、2)甲酰四氫葉酸合成酶、3)次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、4)亞甲基四氫葉酸脫氫酶、5)亞甲基四氫葉酸還原酶、6)甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(acse)、7)類咕啉鐵硫蛋白(acsd)、8)鎳蛋白裝配蛋白(acsf&cooc)、9)鐵氧還蛋白(orf7)、10)乙酰-coa合成酶(acsb&acsc)、11)一氧化碳脫氫酶(acsa)、12)丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(por)、13)氫化酶(hyd)、14)乙酰乙酰-coa硫解酶(atob)、15)3-羥基丁酰-coa脫氫酶(hbd)、16)巴豆酸酶(crt)、17)巴豆酰-coa水合酶(4-budh)、18)4-羥基丁酰-coa還原酶(醇形成型)、19)4-羥基丁酰-coa還原酶(醛形成型)、和20)1,4-丁二醇脫氫酶。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及開(kāi)發(fā)和使用能夠利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產(chǎn)生期望產(chǎn)物的微生物。本發(fā)明另外涉及擴(kuò)展利用合成氣的微生物的產(chǎn)物范圍和產(chǎn)生能夠利用合成氣產(chǎn)生期望產(chǎn)物且優(yōu)化產(chǎn)物的產(chǎn)量、滴定度和生產(chǎn)率的重組有機(jī)體。可有效利用合成氣作為生長(zhǎng)和化學(xué)制備的基質(zhì)的重組有機(jī)體，例如大腸桿菌(escherichiacoli)或其它適合于商業(yè)規(guī)?；挠袡C(jī)體的研制為產(chǎn)生可再生的化學(xué)物和燃料提供了具有成本優(yōu)勢(shì)的方法。這些有機(jī)體可經(jīng)優(yōu)化且以合理的成本快速測(cè)試。合成氣用作進(jìn)料的巨大潛力在于其能夠有效且節(jié)省成本地轉(zhuǎn)化為目的化學(xué)物和燃料。合成氣轉(zhuǎn)化的兩種主要技術(shù)是費(fèi)托法和發(fā)酵法。費(fèi)托(f-t)技術(shù)自從第二次世界大戰(zhàn)就已被開(kāi)發(fā)出來(lái)，其涉及基于無(wú)機(jī)物和金屬的催化劑，從而允許有效地產(chǎn)生甲醇或混合烴作為燃料。f-t方法的缺點(diǎn)在于：1)缺乏產(chǎn)物選擇性，導(dǎo)致難以分離期望產(chǎn)物；2)催化劑容易中毒；3)因?yàn)樾枰邷睾透邏?，所以能源成本很高；?)在具有商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的成本下可獲得的產(chǎn)物的范圍很有限。對(duì)于發(fā)酵法，已顯示合成氣可在能將其轉(zhuǎn)化為例如乙醇、乙酸和氫氣等產(chǎn)物的許多厭氧微生物中用作碳源和能源(參看下文和表1)。合成氣的發(fā)酵轉(zhuǎn)化的主要好處有：有機(jī)體選擇性地產(chǎn)生單一產(chǎn)物，對(duì)合成氣雜質(zhì)的耐受性較大，操作溫度和壓力較低，和可能從合成氣獲得大量產(chǎn)物。發(fā)酵法的主要缺點(diǎn)在于，已知能轉(zhuǎn)化合成氣的有機(jī)體傾向于只產(chǎn)生有限范圍的化學(xué)物(例如乙醇和乙酸)，且不能有效地產(chǎn)生其它化學(xué)物；有機(jī)體缺乏基因操作的公認(rèn)工具；且有機(jī)體對(duì)高濃度的最終產(chǎn)物敏感。本發(fā)明涉及產(chǎn)生可有效地從合成氣或其它氣態(tài)碳源產(chǎn)生期望產(chǎn)物(包括化學(xué)物和燃料)的微生物。本發(fā)明的有機(jī)體和方法允許與基于石油的傳統(tǒng)產(chǎn)物和直接衍生自葡萄糖、蔗糖或木質(zhì)纖維素糖的產(chǎn)物相比，顯著節(jié)省成本地產(chǎn)生化學(xué)物和燃料。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其能夠利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產(chǎn)生期望產(chǎn)物，其中所述母體微生物缺乏利用合成氣的天然能力(參看實(shí)施例viii)。在所述微生物中，一種或多種蛋白質(zhì)或酶在微生物中表達(dá)，從而賦予利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產(chǎn)生期望產(chǎn)物的途徑。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種經(jīng)基因修飾的非天然存在的微生物，其例如通過(guò)表達(dá)一種或多種外源蛋白質(zhì)或酶，從而使期望產(chǎn)物的產(chǎn)生效率提高，其中所述母體微生物具有利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產(chǎn)生期望產(chǎn)物的能力。因此，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有能利用合成氣的新穎代謝途徑的微生物，以及產(chǎn)生利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產(chǎn)生期望產(chǎn)物的效率得到提高的微生物。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其表達(dá)編碼以下的基因：與mtaabc型甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)一起催化wood-ljungdahl途徑的羰基分支的酶，和與所述羰基分支有關(guān)的蛋白質(zhì)。所述有機(jī)體能將甲醇(一種可來(lái)源于合成氣的相對(duì)廉價(jià)的有機(jī)原料)和包含co、co2和/或h2的氣體轉(zhuǎn)化為乙酰-coa、細(xì)胞物質(zhì)和產(chǎn)物。大腸桿菌是工業(yè)工作母體有機(jī)體(workhorseorganism)，具有無(wú)與倫比的一套基因工具。將合成氣轉(zhuǎn)化為乙酰-coa(重要代謝物，可由其獲得所有細(xì)胞物質(zhì)組分和許多有價(jià)值的產(chǎn)物)的能力可被工程改造入外部宿主，例如大腸桿菌，其隨后表達(dá)編碼wood-ljungdahl途徑的各種蛋白質(zhì)的外源基因。所述途徑在例如熱乙酸穆?tīng)柺暇?moorellathermoacetica)(以前稱作熱乙酸梭菌(clostridiumthermoaceticum))等產(chǎn)乙酸有機(jī)體中高度活躍，熱乙酸穆?tīng)柺暇缭?942年被分離出時(shí)就作為闡明wood-ljungdahl途徑的模型有機(jī)體(fontaine等人,jbacteriol.43:701-715(1942))。wood-ljungdahl途徑包含兩個(gè)分支：東部或甲基分支，其允許co2轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸(me-thf)；和西部或羰基分支，其允許甲基四氫葉酸、co和輔酶a轉(zhuǎn)化為乙酰-coa(參見(jiàn)圖1和2)。如本文所公開(kāi)，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其表達(dá)催化wood-ljungdahl途徑的兩個(gè)分支的基因。所述有機(jī)體能將包含co、co2和/或h2的氣體轉(zhuǎn)化為乙酰-coa、細(xì)胞物質(zhì)和產(chǎn)物。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其表達(dá)與mtaabc型甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)一起催化wood-ljungdahl途徑的羰基分支的酶的編碼基因。所述有機(jī)體能將甲醇(一種可來(lái)源于合成氣的相對(duì)廉價(jià)的有機(jī)原料)和包含co、co2和/或h2的氣體轉(zhuǎn)化為乙酰-coa、細(xì)胞物質(zhì)和產(chǎn)物。合成氣也稱為發(fā)生爐煤氣，是煤和碳質(zhì)材料(例如生物質(zhì)材料，包括農(nóng)作物和殘余物)的主要?dú)饣a(chǎn)物。合成氣是主要由h2和co組成的混合物，可經(jīng)由氣化任何有機(jī)原料，包括(但不限于)煤、煤油、天然氣、生物質(zhì)和有機(jī)廢物來(lái)獲得。氣化通常在高燃料/氧氣比下進(jìn)行。雖然合成氣主要是h2和co，但也可包含少量的co2和其它氣體。因此合成氣提供一種節(jié)省成本的氣態(tài)碳源，例如co和co2。如本文所公開(kāi)，例如包含co和/或co2的合成氣等氣態(tài)碳源可被本發(fā)明的非天然存在的微生物利用以產(chǎn)生期望產(chǎn)物。雖然碳源在本文中一般例示為合成氣，但應(yīng)了解任何包含co和/或co2的氣態(tài)碳源都可被本發(fā)明的非天然存在的微生物利用。因此，本發(fā)明涉及能利用co和/或co2作為碳源的非天然存在的微生物。wood-ljungdahl途徑催化co和h2轉(zhuǎn)化為乙酰-coa和其它產(chǎn)物，例如乙酸。能利用co和合成氣的有機(jī)體一般也具有經(jīng)由wood-ljungdahl途徑所涵蓋的相同的一組基礎(chǔ)酶和轉(zhuǎn)化作用利用co2和co2/h2混合物的能力。微生物依賴于h2將co2轉(zhuǎn)化為乙酸早在co也可被相同的微生物利用且涉及相同的途徑揭示之前已被公認(rèn)。已顯示許多產(chǎn)乙酸菌可在co2存在下生長(zhǎng)且產(chǎn)生例如乙酸等化合物，只要存在氫以便供應(yīng)必需的還原當(dāng)量即可(參見(jiàn)例如drake,acetogenesis,第3-60頁(yè),chapmanandhall,newyork,(1994))。這可由以下等式概括：2co2+4h2+nadp+npi→ch3cooh+2h2o+natp因此，具有wood-ljungdahl途徑的非天然存在的微生物也可利用co2與h2的混合物來(lái)產(chǎn)生乙酰-coa和其它期望產(chǎn)物。wood-ljungdahl途徑在本領(lǐng)域中為人所熟知，且由可分為2個(gè)分支的12個(gè)反應(yīng)組成：(1)甲基分支和(2)羰基分支。甲基分支將合成氣轉(zhuǎn)化為甲基四氫葉酸(甲基-thf)，而羰基分支則將甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為乙酰-coa。甲基分支中的反應(yīng)是由以下酶或蛋白質(zhì)依次催化：鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。羰基分支中的反應(yīng)是由以下酶或蛋白質(zhì)依次催化：甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如acse)、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白(例如acsf)、鐵氧還蛋白、乙酰-coa合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如cooc)。按照本文提供的關(guān)于引入足夠數(shù)量的編碼核酸以便產(chǎn)生乙酰-coa途徑方面的教導(dǎo)和指導(dǎo)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，也可實(shí)施同樣的工程設(shè)計(jì)導(dǎo)入宿主有機(jī)體中沒(méi)有的編碼wood-ljungdahl酶或蛋白質(zhì)的核酸。因此，將一種或多種編碼核酸引入到本發(fā)明的微生物有機(jī)體中，以致經(jīng)修飾的有機(jī)體含有一個(gè)分支或完全wood-ljungdahl途徑，這會(huì)賦予合成氣利用能力。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物可利用合成氣或其它提供co和/或co2的氣態(tài)碳源來(lái)產(chǎn)生期望產(chǎn)物。在co2的情況下，其它來(lái)源包括(但不限于)氨氣和氫氣工廠里作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的co2，其中甲烷轉(zhuǎn)化為co2；木材和化石燃料的燃燒；啤酒、威士忌和其它酒精飲料釀造過(guò)程中或其它發(fā)酵過(guò)程中作為糖發(fā)酵副產(chǎn)物產(chǎn)生的co2；石灰cao制造中石灰石caco3的熱分解；磷酸鈉制造中作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的co2；和直接來(lái)自于天然二氧化碳來(lái)源，其中二氧化碳是通過(guò)酸化水對(duì)石灰石或白云石的作用而產(chǎn)生。當(dāng)關(guān)于本發(fā)明的微生物有機(jī)體或微生物使用時(shí)，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“非天然存在”欲意謂微生物有機(jī)體具有至少一處在天然存在的所提及物種的菌株(包括所提及物種的野生型菌株)中通常未發(fā)現(xiàn)的基因變異?；蜃儺惏ɡ缫肟杀磉_(dá)的編碼代謝多肽的核酸的修飾、其它核酸添加、核酸缺失和/或微生物遺傳物質(zhì)的其它功能性破壞。所述修飾包括例如所提及物種的異源、同源或異源與同源多肽的編碼區(qū)和其功能片段。其它修飾包括例如非編碼調(diào)控區(qū)，其中修飾會(huì)改變基因或操縱子的表達(dá)。示例性代謝多肽包括乙酰-coa生物合成途徑內(nèi)的酶或蛋白質(zhì)。代謝修飾是指自天然存在的狀態(tài)發(fā)生改變的生化反應(yīng)。因此，非天然存在的微生物可具有對(duì)編碼代謝多肽的核酸或其功能片段的基因修飾。本文公開(kāi)了示例性代謝修飾。當(dāng)關(guān)于微生物有機(jī)體或微生物使用時(shí)，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離的”欲意謂有機(jī)體基本上不含在自然界中發(fā)現(xiàn)所提及的微生物有機(jī)體時(shí)所伴隨的至少一種組分。所述術(shù)語(yǔ)包括移除自然環(huán)境中所伴隨的部分或所有組分的微生物有機(jī)體。所述術(shù)語(yǔ)還包括移除非天然存在的環(huán)境中伴隨微生物有機(jī)體的部分或所有組分的微生物有機(jī)體。因此，分離的微生物有機(jī)體是在自然界中發(fā)現(xiàn)時(shí)或在非天然存在的環(huán)境中生長(zhǎng)、儲(chǔ)存或生存時(shí)與其它物質(zhì)部分或完全分離。經(jīng)分離的微生物有機(jī)體的特定實(shí)例包括部分純的微生物、基本上純的微生物和在非天然存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“微生物性”、“微生物有機(jī)體”或“微生物”欲意謂以古菌域、細(xì)菌域或真核域內(nèi)所包括的顯微細(xì)胞形式存在的任何有機(jī)體。因此，所述術(shù)語(yǔ)欲涵蓋具有顯微尺寸的原核或真核細(xì)胞或有機(jī)體，且包括所有種類的細(xì)菌、古細(xì)菌和真細(xì)菌，以及真核微生物，例如酵母和真菌。所述術(shù)語(yǔ)還包括可經(jīng)培養(yǎng)以用于產(chǎn)生生化物質(zhì)的任何種類的細(xì)胞培養(yǎng)物。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“coa”或“輔酶a”欲意謂有機(jī)輔因子或輔基(酶的非蛋白質(zhì)部分)，其存在為許多酶(脫輔基酶蛋白)形成活性酶系統(tǒng)的活性所必需。輔酶a在某些縮合酶中，在乙?；蚱渌；D(zhuǎn)移中，在脂肪酸合成和氧化，在丙酮酸氧化中和在其它乙酰化作用中發(fā)揮功能。當(dāng)關(guān)于培養(yǎng)或生長(zhǎng)條件使用時(shí)，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本上厭氧”欲意謂液體培養(yǎng)基中的含氧量小于溶解氧飽和含量的約10％。所述術(shù)語(yǔ)還打算包括維持在小于約1％氧氣的氣氛下的液體或固體培養(yǎng)基的密封室。如本文所用的“外源”欲意謂所提及的分子或所提及的活性是引入到宿主微生物有機(jī)體中。分子可例如通過(guò)將編碼核酸引入到宿主遺傳物質(zhì)中而引入，例如通過(guò)編碼核酸整合到宿主染色體中或編碼核酸作為非染色體遺傳物質(zhì)(例如質(zhì)粒)。因此，在關(guān)于編碼核酸的表達(dá)使用時(shí)，所述術(shù)語(yǔ)是指將編碼核酸以可表達(dá)形式引入到微生物有機(jī)體中。當(dāng)關(guān)于生物合成活性使用時(shí)，所述術(shù)語(yǔ)是指活性被引入到宿主參考有機(jī)體中。來(lái)源可為例如同源或異源編碼核酸，其在引入到宿主微生物有機(jī)體中之后表達(dá)所提及的活性。因此，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源”是指所提及的分子或活性是存在于宿主中。類似地，當(dāng)關(guān)于編碼核酸的表達(dá)使用時(shí)，所述術(shù)語(yǔ)是指表達(dá)微生物有機(jī)體內(nèi)所含的編碼核酸。術(shù)語(yǔ)“異源”是指分子或活性是來(lái)源于除所提及的物種以外的來(lái)源，而“同源”是指分子或活性是來(lái)源于所述宿主微生物有機(jī)體。因此，本發(fā)明的編碼核酸的外源表達(dá)可利用異源編碼核酸或同源編碼核酸或其兩者。本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可含有穩(wěn)定的基因變異，這是指微生物在培養(yǎng)超過(guò)5代后仍不會(huì)損失所述變異。一般來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定的基因變異包括持續(xù)超過(guò)10代的修飾，特定來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定的修飾將持續(xù)超過(guò)約25代，且更特定來(lái)說(shuō)，穩(wěn)定的基因修飾將持續(xù)超過(guò)50代，包括無(wú)限持續(xù)下去。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，對(duì)基因變異(包括本文示例的代謝修飾)的描述是關(guān)于合適的宿主有機(jī)體(例如大腸桿菌)和其對(duì)應(yīng)的代謝反應(yīng)，或產(chǎn)生期望遺傳物質(zhì)(例如針對(duì)期望代謝途徑的基因)的合適來(lái)源有機(jī)體。然而，鑒于多種有機(jī)體的完整基因組測(cè)序和基因組學(xué)領(lǐng)域中的高度技術(shù)水平，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地將本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)應(yīng)用于基本上所有其它有機(jī)體。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)并入來(lái)自除所提及物種以外的物種的相同或類似的編碼核酸，本文示例的大腸桿菌代謝變化可容易地應(yīng)用于其它物種。所述基因變異一般包括例如種間同源物的基因變異，且特定來(lái)說(shuō)，直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置換。直系同源物是通過(guò)垂直家系產(chǎn)生關(guān)聯(lián)且在不同有機(jī)體中負(fù)責(zé)基本上相同或一致的功能的基因。舉例來(lái)說(shuō)，小鼠環(huán)氧化物水解酶和人類環(huán)氧化物水解酶可被視為環(huán)氧化物水解的生物功能的直系同源物。例如，當(dāng)基因共有足量的序列相似性以指示其是同源的，或通過(guò)從共同祖先進(jìn)化而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)時(shí)，所述基因通過(guò)垂直家系產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。如果基因具有足量的三維結(jié)構(gòu)相似性但未必具有足量的序列相似性，從而在無(wú)法鑒別到一級(jí)序列相似性的范圍內(nèi)表明其是進(jìn)化自共同祖先，那么所述基因也可被視為直系同源物。直系同源的基因可編碼序列相似性為氨基酸序列同一性的約25％到100％的蛋白質(zhì)。如果編碼氨基酸相似性小于25％的蛋白質(zhì)的基因的三維結(jié)構(gòu)也顯示相似性，那么其也可被視為是由垂直家系產(chǎn)生的。絲氨酸蛋白酶家族的成員(包括組織纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶)被視為是通過(guò)垂直家系從共同祖先產(chǎn)生的。直系同源物包括經(jīng)由例如進(jìn)化而在結(jié)構(gòu)或總體活性上趨異的基因或其編碼的基因產(chǎn)物。舉例來(lái)說(shuō)，在一種物種編碼展現(xiàn)兩種功能的基因產(chǎn)物的情況下，以及在所述功能分離成第二物種中的不同基因的情況下，這三種基因和其對(duì)應(yīng)產(chǎn)物被視為直系同源物。為了產(chǎn)生生物化學(xué)產(chǎn)物，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解可對(duì)具有欲引入或破壞的代謝活性的直系同源基因進(jìn)行選擇，以便構(gòu)建非天然存在的微生物。展現(xiàn)可分離活性的直系同源物的一實(shí)例是不同活性已在兩種或兩種以上物種之間或在單一物種內(nèi)被分離成不同基因產(chǎn)物。一特定實(shí)例是彈性蛋白酶蛋白水解和纖溶酶原蛋白水解(兩種類型的絲氨酸蛋白酶活性)被分離成作為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶的不同分子。另一實(shí)例是支原體5’-3’核酸外切酶和果蠅dna聚合酶iii活性的分離。第一物種的dna聚合物可被視為第二物種的核酸外切酶或聚合酶中一者或兩者的直系同源物，且反之亦然。相反，旁系同源物是通過(guò)例如復(fù)制和隨后的進(jìn)化趨異而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)且具有相似或共同、但不完全相同的功能的同源物。旁系同源物可來(lái)源于或衍生自例如相同物種或不同物種。舉例來(lái)說(shuō)，微粒體環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶i)和可溶性環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶ii)可被視為旁系同源物，因?yàn)槠浯韮煞N共同進(jìn)化自共同祖先的不同酶，催化不同反應(yīng)且在相同物種中具有不同功能。旁系同源物是來(lái)自相同物種的彼此具有顯著序列相似性的蛋白質(zhì)，表明其是同源的或通過(guò)共同進(jìn)化自共同祖先而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。旁系同源蛋白質(zhì)家族的分組包括hipa同源物、熒光素酶基因、肽酶等。非直系同源基因置換是來(lái)自一個(gè)物種的非直系同源基因可取代不同物種中的參考基因功能。取代包括例如能夠在起源物種中執(zhí)行與不同物種中的參考功能相比基本上相同或類似的功能。雖然一般來(lái)說(shuō)，非直系同源基因置換可被鑒別為在結(jié)構(gòu)上與編碼參考功能的已知基因相關(guān)，但是結(jié)構(gòu)相關(guān)性較小但功能類似的基因和其對(duì)應(yīng)的基因產(chǎn)物在本文中使用時(shí)仍然處于所述術(shù)語(yǔ)的含義內(nèi)。功能相似性需要例如非直系同源基因產(chǎn)物的活性位點(diǎn)或結(jié)合區(qū)域與編碼設(shè)法取代的功能的基因相比具有至少一些結(jié)構(gòu)相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源物或無(wú)關(guān)基因。因此，在鑒別和構(gòu)建具有乙酰-coa生物合成能力的本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體的過(guò)程中，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，通過(guò)對(duì)特定物種應(yīng)用本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，代謝修飾的鑒別可包括直系同源物的鑒別和納入或失活。只要參考微生物中存在旁系同源物和/或非直系同源基因置換以用于編碼催化類似或基本上類似的代謝反應(yīng)的酶，那么所屬領(lǐng)域技術(shù)人員也可利用這些進(jìn)化上相關(guān)的基因。直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置換可通過(guò)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來(lái)確定。舉例來(lái)說(shuō)，檢查兩種多肽的核酸或氨基酸序列將會(huì)揭示所比較序列之間的序列同一性和相似性。基于所述相似性，如果相似性足夠高，那么所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可確定蛋白質(zhì)是通過(guò)進(jìn)化自共同祖先而產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的算法(例如align、blast、clustalw等)比較和確定粗略序列相似性或同一性，并且確定序列中可被指派權(quán)重或分?jǐn)?shù)的空位的存在或意義。所述算法在本領(lǐng)域中也是已知的，且類似地可用于確定核苷酸序列相似性或同一性。足以確定關(guān)聯(lián)性的相似性的參數(shù)是基于用于計(jì)算統(tǒng)計(jì)相似性的熟知方法，或在隨機(jī)多肽中發(fā)現(xiàn)類似匹配的概率和所確定匹配的意義來(lái)計(jì)算得出。兩種或兩種以上序列的計(jì)算機(jī)比較在必要時(shí)也可由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員目測(cè)優(yōu)化。預(yù)期相關(guān)的基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)可具有高相似性，例如25％到100％序列同一性。如果掃描足夠大小的數(shù)據(jù)庫(kù)，那么無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)可具有與預(yù)期偶然發(fā)生的概率基本上相同的同一性(約5％)。5％與24％之間的序列可能代表或可能不代表足以推斷所比較序列是相關(guān)序列的同源性?？蓤?zhí)行鑒于數(shù)據(jù)集的大小確定所述匹配的意義的其它統(tǒng)計(jì)分析，以便確定這些序列的相關(guān)性。使用blast算法確定兩種或兩種以上序列的關(guān)聯(lián)性的示例性參數(shù)可例如說(shuō)明如下。簡(jiǎn)言之，氨基酸序列比對(duì)可使用2.0.8版(1999年1月5日)blastp和以下參數(shù)來(lái)進(jìn)行：矩陣：0blosum62；空位開(kāi)放：11；空位延伸：1；x_扣分：50；期望值：10.0；字長(zhǎng)：3；過(guò)濾器：開(kāi)。核酸序列比對(duì)可使用2.0.6版(1998年9月16日)blastn和以下參數(shù)來(lái)進(jìn)行：匹配：1；錯(cuò)配：-2；空位開(kāi)放：5；空位延伸：2；x_扣分：50；期望值：10.0；字長(zhǎng)：11；過(guò)濾器：開(kāi)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員知悉，為了增加或降低比較嚴(yán)格度并確定兩種或兩種以上序列的關(guān)聯(lián)性，可對(duì)上述參數(shù)作哪些修改。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將co和/或co2和h2轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a(乙酰-coa)的途徑的外源蛋白質(zhì)，其中在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下，所述微生物缺乏將co和/或co2和h2轉(zhuǎn)化為乙酰-coa的能力。舉例來(lái)說(shuō)，所述一種或多種外源蛋白質(zhì)或酶可選自鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-coa合成酶、乙酰-coa合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶(參見(jiàn)圖1和實(shí)施例vii和viii)。微生物也可表達(dá)兩種或兩種以上、三種或三種以上以及以此類推(包括直到所有)的賦予將co和/或co2和h2轉(zhuǎn)化為乙酰-coa的途徑的蛋白質(zhì)和酶，例如鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-coa合成酶、乙酰-coa合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶。如本文所公開(kāi)的本發(fā)明的一實(shí)施方案涉及產(chǎn)生一種可利用co和/或co2作為碳源以產(chǎn)生期望產(chǎn)物的非天然存在的微生物。舉例來(lái)說(shuō)，將wood-ljungdahl途徑的羰基和/或甲基分支的蛋白質(zhì)和酶(圖1和2)引入到天然不含wood-ljungdahl酶的微生物中。尤其適用于wood-ljungdahl途徑的基因工程的有機(jī)體是大腸桿菌，其可用的基因操縱工具和發(fā)酵條件已經(jīng)得到充分表征(參見(jiàn)實(shí)施例viii)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將包含co和h2的合成氣或其它氣態(tài)碳源轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a(乙酰-coa)的途徑的外源蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下，缺乏將co和h2轉(zhuǎn)化為乙酰-coa的能力。所述合成氣或其它氣體可進(jìn)一步包含co2。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物可包含提高co2、co和/或h2到乙酰-coa的轉(zhuǎn)化效率的途徑。此外，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將包含co2和h2的氣態(tài)碳源轉(zhuǎn)化為乙酰-coa的途徑的外源蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下，缺乏將co2和h2轉(zhuǎn)化為乙酰-coa的能力。氣體可進(jìn)一步包含co。如本文所論述，外源蛋白質(zhì)可選自鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-coa合成酶、乙酰-coa合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將co和/或co2和h2轉(zhuǎn)化為甲基-四氫葉酸(甲基-thf)的途徑的外源蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下，缺乏將co和/或co2和h2轉(zhuǎn)化為甲基-四氫葉酸的能力。如本文所公開(kāi)，所述一種或多種外源蛋白質(zhì)可選自鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶(參見(jiàn)圖1和實(shí)施例viii)。微生物也可表達(dá)兩種或兩種以上、三種或三種以上以及以此類推(包括直到所有)的賦予將co和/或co2和h2轉(zhuǎn)化為甲基-四氫葉酸的途徑的蛋白質(zhì)和酶，包括至多以下所有酶：鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將包含co和h2的合成氣或其它氣態(tài)碳源轉(zhuǎn)化為甲基-四氫葉酸的途徑的外源蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下，缺乏將co和h2轉(zhuǎn)化為甲基-四氫葉酸的能力。合成氣可進(jìn)一步包含co2。此外，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物將包含co2和h2的氣態(tài)碳源轉(zhuǎn)化為甲基-四氫葉酸的途徑的外源蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下，缺乏將co2和h2轉(zhuǎn)化為甲基-四氫葉酸的能力。氣態(tài)碳源可進(jìn)一步包含co。如上所述，外源蛋白質(zhì)可選自鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。因此，本發(fā)明涉及非天然存在的微生物和利用所述微生物從包含co和/或co2的合成氣或其它氣體產(chǎn)生期望產(chǎn)物(例如乙酰-coa或甲基-四氫葉酸)的方法，尤其涉及產(chǎn)生能利用包含co和/或co2的合成氣或其它氣體的微生物，所述微生物先前不能利用包含co和/或co2的合成氣或其它氣體作為碳源(參見(jiàn)實(shí)施例viii)。此外，微生物可經(jīng)工程改造以便含有wood-ljungdahl途徑的甲基和羰基分支(圖1、2和6)。此外，也可通過(guò)對(duì)微生物進(jìn)行工程改造產(chǎn)生期望產(chǎn)物也能產(chǎn)生其它期望產(chǎn)物，所述工程改造是通過(guò)表達(dá)能產(chǎn)生期望產(chǎn)物(例如產(chǎn)生作為前體的具有乙酰-coa或甲基-四氫葉酸的產(chǎn)物)的蛋白質(zhì)或酶來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)圖3)。如本文所公開(kāi)，所述微生物可通過(guò)表達(dá)賦予期望代謝途徑的蛋白質(zhì)或基因或者通過(guò)確定可驅(qū)使代謝產(chǎn)生期望產(chǎn)物的缺失來(lái)產(chǎn)生。此外，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含基因修飾，所述基因修飾使所述微生物從co和/或co2和h2產(chǎn)生乙酰-coa的效率相對(duì)于不存在所述基因修飾的情況下的所述微生物獲得提高，其中所述微生物包含將co和/或co2和h2轉(zhuǎn)化為乙酰-coa的途徑。在所述微生物中，基因修飾可包括使編碼一種或多種外源蛋白質(zhì)的一種或多種核酸分子得到表達(dá)，借此所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)提高從co和/或co2和h2產(chǎn)生乙酰-coa的效率。所述一種或多種外源蛋白質(zhì)可選自鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-coa合成酶、乙酰-coa合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶，包括至多所有如本文所公開(kāi)的這些蛋白質(zhì)。所述非天然存在的微生物可另外或替代地具有包括一種或多種基因破壞的基因修飾，借此所述一種或多種基因破壞會(huì)提高從co和/或co2和h2產(chǎn)生乙酰-coa的效率。此外，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含使得使用本文所公開(kāi)的方法產(chǎn)生甲基-四氫葉酸或其它期望產(chǎn)物的效率得到提高的基因修飾。因此，本發(fā)明另外涉及提高微生物產(chǎn)生期望產(chǎn)物的效率，所述微生物已經(jīng)具有從包含co和/或co2的合成氣或其它氣體產(chǎn)生期望產(chǎn)物的能力。本發(fā)明還涉及一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用包含co和/或co2的合成氣或其它氣體作為碳源的能力的蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或多種賦予利用co和/或co2的能力的蛋白質(zhì)的情況下缺乏利用碳源的能力。此外，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用一氧化碳和/或二氧化碳作為碳源的能力的蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或一種蛋白質(zhì)的情況下缺乏利用碳源的能力。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用co和/或co2以及h2作為碳源的能力的蛋白質(zhì)，其中所述微生物缺乏在不存在所述一種或一種蛋白質(zhì)的情況下利用碳源的能力。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用co以及h2和co2作為碳源的能力的蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或一種蛋白質(zhì)的情況下缺乏利用碳源的能力。所述微生物可用于從碳源產(chǎn)生期望產(chǎn)物，例如甲基-四氫葉酸或乙酰輔酶a(乙酰-coa)或其它期望產(chǎn)物，如本文所公開(kāi)，包括從乙酰-coa或甲基-四氫葉酸合成而來(lái)的產(chǎn)物。所述非天然存在的微生物可表達(dá)一種或多種增加產(chǎn)物產(chǎn)量的外源蛋白質(zhì)，如本文所公開(kāi)(參見(jiàn)圖1和2)。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用合成氣或其它氣態(tài)碳源的能力的外源蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下具有利用碳源的能力，借此所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)提高碳源的利用效率。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用一氧化碳作為碳源的能力的外源蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下具有利用碳源的能力，借此所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)提高碳源的利用效率。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用co和/或co2以及h2作為碳源的能力的外源蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下具有利用碳源的能力，借此所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)提高碳源的利用效率。本發(fā)明另外提供一種非天然存在的微生物，其包含一種或多種賦予所述微生物利用co以及h2和co2的能力的外源蛋白質(zhì)，其中所述微生物在不存在所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的情況下具有利用碳源的能力，借此所述一種或多種外源蛋白質(zhì)的表達(dá)會(huì)提高碳源的利用效率。所述微生物可用于從碳源產(chǎn)生期望產(chǎn)物，例如乙酰-coa、甲基-四氫葉酸或其它期望產(chǎn)物，如本文所公開(kāi)。本發(fā)明還提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其能夠利用甲醇和合成氣產(chǎn)生乙酰-coa。因此，微生物有機(jī)體能利用甲醇和co、co2和/或h2(例如co2；co2和h2；co；co和h2；co2和co；或co2、co和h2)產(chǎn)生乙酰-coa。因?yàn)橐阴?coa在大多數(shù)微生物有機(jī)體中產(chǎn)生，所以應(yīng)當(dāng)理解能產(chǎn)生乙酰-coa的本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體是經(jīng)工程改造以便包含期望途徑的微生物有機(jī)體。此外，微生物有機(jī)體經(jīng)工程改造以便利用甲醇和合成氣產(chǎn)生乙酰-coa(參見(jiàn)實(shí)施例)。在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有包含至少一種編碼乙酰-coa途徑酶或蛋白質(zhì)的外源核酸的乙酰輔酶a(乙酰-coa)途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-coa，所述乙酰-coa途徑包含甲醇-甲基轉(zhuǎn)移酶和乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶。在所述非天然存在的微生物有機(jī)體中，乙酰-coa途徑可賦予將co2、co和/或h2、即其組合轉(zhuǎn)化為乙酰-coa的能力。所述乙酰-coa途徑的甲醇-甲基轉(zhuǎn)移酶活性可包括例如選自甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉蛋白(例如mtac)和甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如mtaa)的酶或蛋白質(zhì)(參見(jiàn)實(shí)施例ii和iii)的酶和蛋白質(zhì)。所述乙酰-coa途徑的乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶活性可包括例如選自甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如acse)、類咕啉鐵硫蛋白(例如acsd)、鎳蛋白裝配蛋白(例如acsf)、鐵氧還蛋白、乙酰-coa合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如cooc)的酶或蛋白質(zhì)(參見(jiàn)實(shí)施例ii和iii)。如本文所公開(kāi)，兩種或兩種以上、三種或三種以上、四種或四種以上、五種或五種以上、六種或六種以上、七種或七種以上、八種或八種以上、九種或九種以上等的編碼乙酰-coa途徑的核酸可在本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體中表達(dá)。在一特定實(shí)施方案中，非天然存在的微生物有機(jī)體可包含十種編碼甲醇-甲基轉(zhuǎn)移酶和乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶的外源核酸，所述甲醇-甲基轉(zhuǎn)移酶包括甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉蛋白(例如mtac)和甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如mtaa)，且所述乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶包括甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如acse)、類咕啉鐵硫蛋白(例如acsd)、鎳蛋白裝配蛋白(例如cooc)、鐵氧還蛋白、乙酰-coa合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如acsf)。在另一實(shí)施方案中，非天然存在的微生物有機(jī)體可進(jìn)一步包含丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶。舉例來(lái)說(shuō)，丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶可由外源核酸編碼。在另一實(shí)施方案中，非天然存在的微生物有機(jī)體可進(jìn)一步包含氫化酶，其可由內(nèi)源或外源核酸編碼，如本文所公開(kāi)(參見(jiàn)實(shí)施例ii和iii)。如本文所公開(kāi)，非天然存在的微生物有機(jī)體可含有例如至少一種作為異源核酸的外源核酸。如本文所進(jìn)一步公開(kāi)，非天然存在的微生物有機(jī)體可例如在基本上厭氧的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。本文對(duì)本發(fā)明的描述一般是通過(guò)代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或其產(chǎn)物，或具體通過(guò)一種或多種核酸或基因描述，所述核酸或基因編碼與所提及的代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物相關(guān)的酶或催化所提及的代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物的酶，或與所提及的代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物相關(guān)的蛋白質(zhì)。除非本文明確說(shuō)明，否則所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解提及反應(yīng)時(shí)同樣表示提及反應(yīng)的反應(yīng)物和產(chǎn)物。類似地，除非本文明確說(shuō)明，否則指代反應(yīng)物或產(chǎn)物時(shí)同樣表示提及反應(yīng)，且提及任何這些代謝組分時(shí)同樣表示提及一種或多種編碼催化所提及的反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物的酶或與所提及的反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因。同樣，鑒于代謝生物化學(xué)、酶學(xué)和基因組學(xué)是熟知領(lǐng)域，本文提及基因或編碼核酸也等同于提及對(duì)應(yīng)的所編碼酶和其催化的反應(yīng)，或反應(yīng)的相關(guān)蛋白質(zhì)，以及反應(yīng)的反應(yīng)物和產(chǎn)物。本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可通過(guò)引入編碼一種或多種乙酰-coa生物合成途徑中所涉及的一種或多種酶或蛋白質(zhì)的可表達(dá)核酸來(lái)產(chǎn)生。取決于為生物合成所選的宿主微生物有機(jī)體，可表達(dá)部分或所有的特定乙酰-coa生物合成途徑的核酸。舉例來(lái)說(shuō)，如果所選宿主缺乏期望生物合成途徑的一種或多種酶或蛋白質(zhì)，那么將用于所缺乏酶或蛋白質(zhì)的可表達(dá)核酸引入到宿主中以供隨后的外源表達(dá)。或者，如果所選宿主展現(xiàn)一些途徑基因的內(nèi)源表達(dá)，但缺乏其它基因，那么需要編碼所缺乏酶或蛋白質(zhì)的核酸以便實(shí)現(xiàn)乙酰-coa生物合成。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可通過(guò)引入外源酶或蛋白質(zhì)活性以獲得期望生物合成途徑來(lái)產(chǎn)生，或者期望生物合成途徑可通過(guò)引入一種或多種外源酶或蛋白質(zhì)活性來(lái)獲得，所述一種或多種外源酶或蛋白質(zhì)活性與一種或多種內(nèi)源酶或蛋白質(zhì)一起產(chǎn)生例如乙酰-coa等期望產(chǎn)物。取決于所選宿主微生物有機(jī)體的乙酰-coa生物合成途徑組分，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體將包含至少一種外源表達(dá)的編碼乙酰-coa途徑的核酸，最多為一種或多種乙酰-coa生物合成途徑所有的編碼核酸。舉例來(lái)說(shuō)，乙酰-coa生物合成可在缺乏途徑酶或蛋白質(zhì)的宿主中經(jīng)由對(duì)應(yīng)編碼核酸的外源表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在缺乏乙酰-coa途徑的所有酶或蛋白質(zhì)的宿主中，可包含所有途徑酶或蛋白質(zhì)的外源表達(dá)，但應(yīng)了解即使宿主含有途徑酶或蛋白質(zhì)中的至少一種，也可表達(dá)所有的途徑酶或蛋白質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，可包含用于產(chǎn)生乙酰-coa的所有途徑酶或蛋白質(zhì)的外源表達(dá)，例如甲醇-甲基轉(zhuǎn)移酶，其可包括甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉蛋白(例如mtac)和甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如mtaa)；和乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶，其可包括甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如acse)、類咕啉鐵硫蛋白(例如acsd)、鎳蛋白裝配蛋白(例如acsf)、鐵氧還蛋白、乙酰-coa合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如cooc)。在另一實(shí)施方案中，在用于從合成氣或其它氣態(tài)碳源產(chǎn)生乙酰-coa的途徑中，生物合成途徑中的一種或多種蛋白質(zhì)可選自鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰-coa合成酶、乙酰-coa合成酶二硫鍵還原酶和氫化酶(參見(jiàn)圖2和實(shí)施例vii和viii)。在用于產(chǎn)生甲基-四氫葉酸的途徑中，生物合成途徑中的一種或多種蛋白質(zhì)可選自鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化脫水酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶(參見(jiàn)圖1和實(shí)施例viii)。此外，編碼乙酰-coa和甲基-四氫葉酸的產(chǎn)生所必需的酶的基因可引入到微生物中(參見(jiàn)圖3和實(shí)施例viii)。美國(guó)申請(qǐng)案第11/891,602號(hào)(2007年8月10日申請(qǐng))和wo/2008/115840例如描述用于產(chǎn)生其它期望產(chǎn)物(包括檸檬酸、4-羥基丁酸和1,4-丁二醇)的代謝途徑。根據(jù)本文所提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解以可表達(dá)形式引入的編碼核酸的數(shù)目至少與選定宿主微生物有機(jī)體的乙酰-coa途徑缺乏的相當(dāng)。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可具有一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或至多所有的編碼組成本文所公開(kāi)的乙酰-coa生物合成途徑的酶或蛋白質(zhì)的核酸。在一些實(shí)施方案中，非天然存在的微生物有機(jī)體也可包含其它基因修飾，其促進(jìn)或優(yōu)化乙酰-coa生物合成或賦予宿主微生物有機(jī)體其它有用的功能。一種所述其它功能可包括例如增加一種或多種乙酰-coa途徑前體(例如甲醇)的合成。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)宿主微生物有機(jī)體進(jìn)行選擇，以便其能產(chǎn)生作為天然產(chǎn)生的分子或工程產(chǎn)物的乙酰-coa途徑的前體，所述工程產(chǎn)物提供期望前體的從頭產(chǎn)生，或?qū)е掠伤拗魑⑸镉袡C(jī)體天然產(chǎn)生的前體的產(chǎn)生增多。宿主有機(jī)體可經(jīng)工程改造以便增加前體的產(chǎn)量，如本文所公開(kāi)。此外，已經(jīng)工程改造以產(chǎn)生期望前體的微生物有機(jī)體可用作宿主有機(jī)體，且進(jìn)一步經(jīng)工程改造以表達(dá)乙酰-coa途徑的酶或蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體是從含有合成乙酰-coa的酶促能力的宿主產(chǎn)生。在此特定實(shí)施方案中，可以增加乙酰-coa途徑產(chǎn)物的合成或積累以便例如驅(qū)動(dòng)乙酰-coa途徑反應(yīng)朝產(chǎn)生乙酰-coa的方向進(jìn)行。增加的合成或積累可通過(guò)例如編碼一種或多種上述乙酰-coa途徑酶或蛋白質(zhì)的核酸的過(guò)度表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。乙酰-coa途徑的一種或多種酶和/或蛋白質(zhì)的過(guò)度表達(dá)可例如經(jīng)由一種或多種內(nèi)源基因的外源表達(dá)或經(jīng)由一種或多種異源基因的外源表達(dá)來(lái)進(jìn)行。因此，天然存在的有機(jī)體可容易地變?yōu)楸景l(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體，從而例如經(jīng)由過(guò)度表達(dá)一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種、即至多所有的編碼乙酰-coa生物合成途徑酶或蛋白質(zhì)的核酸來(lái)產(chǎn)生乙酰-coa。此外，非天然存在的有機(jī)體可通過(guò)誘發(fā)內(nèi)源基因的突變，從而導(dǎo)致乙酰-coa生物合成途徑中的酶活性增加來(lái)產(chǎn)生。在尤其有用的實(shí)施方案中，利用編碼核酸的外源表達(dá)。外源表達(dá)賦予宿主定制表達(dá)和/或調(diào)控元件的能力，以及實(shí)現(xiàn)由使用者控制的期望表達(dá)水平的應(yīng)用。然而，其它實(shí)施方案中也可利用內(nèi)源表達(dá)，例如通過(guò)移除負(fù)調(diào)控效應(yīng)分子或當(dāng)連接于可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子或其它調(diào)控元件時(shí)誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子。因此，具有天然存在的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的內(nèi)源基因可通過(guò)提供適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑而得到上調(diào)，或內(nèi)源基因的調(diào)控區(qū)可經(jīng)工程改造以并入可誘導(dǎo)的調(diào)控元件，從而允許在期望時(shí)間對(duì)內(nèi)源基因增加的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。類似地，可包含可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子作為引入非天然存在的微生物有機(jī)體中的外源基因的調(diào)控元件。應(yīng)了解，在本發(fā)明的方法中，所述一種或多種外源核酸中的任一種皆可引入到微生物有機(jī)體中以產(chǎn)生本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體?？梢牒怂嵋员憷缳x予微生物有機(jī)體乙酰-coa生物合成途徑?；蛘?，可引入編碼核酸以便產(chǎn)生中間微生物有機(jī)體，其具有催化一些賦予乙酰-coa生物合成能力所必需的反應(yīng)的生物合成能力。舉例來(lái)說(shuō)，具有乙酰-coa生物合成途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體可包含至少兩種編碼期望酶或蛋白質(zhì)的外源核酸，所述期望酶或蛋白質(zhì)為例如甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶與類咕啉蛋白的組合、甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶與甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的組合、類咕啉蛋白與類咕啉鐵硫蛋白的組合、鎳蛋白裝配蛋白與鐵氧還蛋白的組合等。因此，應(yīng)了解本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可包含生物合成途徑的兩種或兩種以上酶或蛋白質(zhì)的任何組合。類似地，應(yīng)了解本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可視需要包含生物合成途徑的三種或三種以上酶或蛋白質(zhì)的任何組合，例如甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白(例如acsd)和乙酰-coa合成酶；類咕啉蛋白(例如mtac)、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如cooc或acsf)；甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如acse)、鐵氧還蛋白和乙酰-coa合成酶等，只要期望生物合成途徑的酶和/或蛋白質(zhì)的組合導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的期望產(chǎn)物即可。類似地，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可視需要包含如本文所公開(kāi)的生物合成途徑的四種、五種、六種、七種、八種、九種或以上酶或蛋白質(zhì)的任何組合，只要期望生物合成途徑的酶和/或蛋白質(zhì)的組合導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的期望產(chǎn)物即可。除了本文所述的乙酰-coa的生物合成外，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體和方法也可以彼此的各種組合以及與本領(lǐng)域中熟知的其它微生物有機(jī)體和方法的各種組合來(lái)利用，以便通過(guò)其它途徑實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的生物合成。舉例來(lái)說(shuō)，除了使用產(chǎn)乙酰-coa微生物有機(jī)體外，一種產(chǎn)生乙酰-coa的替代方案是添加另一種能將乙酰-coa途徑中間物轉(zhuǎn)化為乙酰-coa的微生物有機(jī)體。一種所述程序包括例如發(fā)酵可產(chǎn)生乙酰-coa途徑中間物的微生物有機(jī)體。乙酰-coa途徑中間物可接著用作底物以供第二微生物有機(jī)體將乙酰-coa途徑中間物轉(zhuǎn)化為乙酰-coa。乙酰-coa途徑中間物可直接添加到第二有機(jī)體的另一培養(yǎng)物中，或者可例如通過(guò)細(xì)胞分離從乙酰-coa途徑中間物生產(chǎn)者的原始培養(yǎng)物移除這些微生物有機(jī)體，隨后可向發(fā)酵液中添加第二有機(jī)體以便無(wú)需中間純化步驟即可產(chǎn)生最終產(chǎn)物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體和方法可以眾多亞途徑裝配以便實(shí)現(xiàn)例如乙酰-coa的生物合成。在這些實(shí)施方案中，本發(fā)明的期望產(chǎn)物的生物合成途徑可分到不同的微生物有機(jī)體中，且不同的微生物有機(jī)體可共培養(yǎng)以便產(chǎn)生最終產(chǎn)物。在所述生物合成方案中，一種微生物有機(jī)體的產(chǎn)物是另一種微生物有機(jī)體的底物，直到合成最終產(chǎn)物為止。舉例來(lái)說(shuō)，乙酰-coa的生物合成可通過(guò)構(gòu)建含有用于將一種途徑中間物轉(zhuǎn)化為另一種途徑中間物或產(chǎn)物的生物合成途徑的微生物有機(jī)體來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘?，乙酰-coa也可經(jīng)由使用兩種有機(jī)體在同一容器中共培養(yǎng)或共發(fā)酵而以生物合成方法從微生物有機(jī)體產(chǎn)生，其中第一微生物有機(jī)體產(chǎn)生乙酰-coa中間物，而第二微生物有機(jī)體將中間物轉(zhuǎn)化為乙酰-coa。根據(jù)本文所提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體和方法，連同其它微生物有機(jī)體、具有亞途徑的其它非天然存在的微生物有機(jī)體的共同培養(yǎng)物、和本領(lǐng)域中熟知的用于產(chǎn)生乙酰-coa的其它化學(xué)和/或生物化學(xué)程序的組合存在眾多組合和置換。此外，因?yàn)橐阴?coa是其它期望產(chǎn)物的前體，所以本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可用作宿主有機(jī)體，其根據(jù)需要被賦予其它利用乙酰-coa作為前體或中間物的期望途徑。乙酰-coa途徑酶或蛋白質(zhì)的編碼核酸的來(lái)源可包括例如其中經(jīng)編碼基因產(chǎn)物能催化所提及的反應(yīng)的任何物種。所述物種包括原核和真核有機(jī)體，其包括(但不限于)細(xì)菌(包括古細(xì)菌和真細(xì)菌)和真核生物(包括酵母、植物、昆蟲(chóng)、動(dòng)物和哺乳動(dòng)物，包括人類)。所述來(lái)源的示例性物種包括例如大腸桿菌、巴氏甲烷八疊球菌(methanosarcinabarkeri)、嗜乙酸甲烷八疊球菌(methanosarcinaacetivorans)、熱乙酸穆?tīng)柺暇?、生氫氧化碳嗜熱?carboxydothermushydrogenoformans)、深紅紅螺菌(rhodospirillumrubrum)、伍氏醋酸桿菌(acetobacteriumwoodii)、食甲基丁酸桿菌(butyribacteriummethylotrophicum)、自產(chǎn)乙烷梭菌(clostridiumautoethanogenum)、嗜羧酸梭菌(clostridiumcarboxidivorans)、楊氏梭菌(clostridiumljungdahlii)、粘液真桿菌(eubacteriumlimosum)、普氏產(chǎn)醋桿菌(oxobacterpfennigii)、產(chǎn)生消化鏈球菌(peptostreptococcusproductus)、沼澤紅假單胞菌p4(rhodopseudomonaspalustrisp4)、膠狀紅長(zhǎng)命菌(rubrivivaxgelatinosus)、檸檬酸桿菌y19(citrobacterspy19)、嗜乙酸甲烷八疊球菌c2a、巴氏甲烷八疊球菌、東方脫硫芽孢彎曲菌(desulfosporosinusorientis)、脫硫脫硫弧菌(desulfovibriodesulfuricans)、普通脫硫弧菌(desulfovibriovulgaris)、熱自氧穆?tīng)柺暇?moorellathermoautotrophica)、太平洋羧酸雙分枝菌(carboxydibrachiumpacificus)、熱自氧羧酸胞菌(carboxydocellathermoautotrophica)、thermincolacarboxydiphila、嗜羧酸熱石桿菌(thermolithobactercarboxydivorans)、嗜羧酸熱彎曲菌(thermosinuscarboxydivorans)、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌(methanothermobacterthermoautotrophicus)、嗜羧酸脫硫腸狀菌(desulfotomaculumcarboxydivorans)、庫(kù)氏脫硫腸狀菌(desulfotomaculumkuznetsovii)、致黑脫硫腸狀菌(desulfotomaculumnigrificans)、熱苯脫硫腸狀菌熱共養(yǎng)亞種(desulfotomaculumthermobenzoicumsubsp.thermosyntrophicum)、弗氏互營(yíng)桿菌(syntrophobacterfumaroxidans)、尿酸梭菌(clostridiumacidurici)、非洲脫硫弧菌(desulfovibrioafricanus)等，以及本文公開(kāi)的或可作為對(duì)應(yīng)基因的來(lái)源有機(jī)體獲得的其它示例性物種。然而，因?yàn)楝F(xiàn)在可從超過(guò)550種物種獲得完整基因組序列(其中超過(guò)一半可從例如ncbi等公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得)，包括395種微生物基因組和多種酵母、真菌、植物和哺乳動(dòng)物基因組，所以對(duì)于相關(guān)或遠(yuǎn)親物種中的一種或多種基因鑒別編碼必需乙酰-coa生物合成活性的基因是常規(guī)的且在本領(lǐng)域中為人所熟知，包括例如已知基因的同源物、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置換，和有機(jī)體之間基因變異的互換。因此，本文參考特定有機(jī)體(例如大腸桿菌)描述的能實(shí)現(xiàn)乙酰-coa的生物合成的代謝變化可容易地應(yīng)用于其它微生物，同樣包括原核和真核有機(jī)體。根據(jù)本文所提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將知悉在一種有機(jī)體中示例的代謝變化可同樣地應(yīng)用于其它有機(jī)體。在一些情況下，例如當(dāng)無(wú)關(guān)物種中存在替代乙酰-coa生物合成途徑時(shí)，宿主物種可被賦予乙酰-coa生物合成，例如通過(guò)從無(wú)關(guān)物種外源表達(dá)一種或多種旁系同源物，這會(huì)催化類似但不相同的代謝反應(yīng)置換所提及的反應(yīng)。因?yàn)椴煌袡C(jī)體的代謝網(wǎng)絡(luò)之間存在某些差別，所以所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解不同有機(jī)體之間的實(shí)際基因使用可有所不同。然而，根據(jù)本文所提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員還將了解，本發(fā)明的教導(dǎo)和方法可應(yīng)用于所有的微生物有機(jī)體，其中使用本文中示例的用于在合成乙酰-coa的目的物種中構(gòu)建微生物有機(jī)體的代謝變化的同源代謝變化。宿主微生物有機(jī)體可選自以下物種且非天然存在的微生物有機(jī)體可在以下物種中產(chǎn)生：例如細(xì)菌、酵母、真菌或各種適用于發(fā)酵過(guò)程的其它微生物中的任一種。示例性細(xì)菌包括選自以下的物種：大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(anaerobiospirillumsucciniciproducens)、產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(actinobacillussuccinogenes)、產(chǎn)琥珀酸曼海姆氏菌(mannheimiasucciniciproducens)、菜豆根瘤菌(rhizobiumetli)、枯草桿菌(bacillussubtilis)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、(gluconobacteroxydans)、氧化葡萄糖酸桿菌(zymomonasmobilis)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)、天藍(lán)色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)、丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)、熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)和惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)。示例性酵母或真菌包括選自以下的物種：釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)、馬克斯克魯維酵母(kluyveromycesmarxianus)、土曲霉(aspergillusterreus)、黑曲霉(aspergillusniger)和畢赤酵母(pichiapastoris)。大腸桿菌是尤其有用的宿主有機(jī)體，因?yàn)槠涫堑玫匠浞直碚鞯倪m用于基因工程的微生物有機(jī)體。其它尤其有用的宿主有機(jī)體包括酵母，例如釀酒酵母。適合作為宿主有機(jī)體的示例性產(chǎn)乙酸菌包括(但不限于)深紅紅螺菌、熱乙酸穆?tīng)柺暇凸厦搧喠蛩峋?desulfitobacteriumhafniense)(參見(jiàn)實(shí)施例)。用于構(gòu)建非天然存在的乙酰-coa生產(chǎn)宿主和測(cè)試其表達(dá)水平的方法可例如通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的重組和檢測(cè)方法來(lái)執(zhí)行。例如sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第3版,coldspringharborlaboratory,newyork(2001)；和ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwileyandsons,baltimore,md(1999)描述所述方法。用于產(chǎn)生乙酰-coa的途徑中所涉及的外源核酸序列可使用本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)穩(wěn)定地或暫時(shí)地引入宿主細(xì)胞中，所述技術(shù)包括(但不限于)接合、電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染和超聲波轉(zhuǎn)化。對(duì)于在大腸桿菌或其它原核細(xì)胞中的外源表達(dá)，真核核酸的基因或cdna中的一些核酸序列可編碼導(dǎo)向信號(hào)，例如n端線粒體導(dǎo)向信號(hào)或其它導(dǎo)向信號(hào)，必要時(shí)其可在轉(zhuǎn)化到原核宿主細(xì)胞中之前被移除。舉例來(lái)說(shuō)，移除線粒體前導(dǎo)序列會(huì)導(dǎo)致在大腸桿菌中的表達(dá)有所增加(hoffmeister等人,j.biol.chem.280:4329-4338(2005))。對(duì)于在酵母或其它真核細(xì)胞中的外源表達(dá)，基因可在細(xì)胞溶質(zhì)中表達(dá)而無(wú)需添加前導(dǎo)序列，或可通過(guò)添加合適的導(dǎo)向序列(例如適用于宿主細(xì)胞的線粒體導(dǎo)向或分泌序列)而導(dǎo)向到線粒體或其它細(xì)胞器或經(jīng)導(dǎo)向用于分泌。因此，應(yīng)了解為了移除或包含導(dǎo)向序列而對(duì)核酸序列所作的適當(dāng)修飾可并入外源核酸序列中以便賦予所需性質(zhì)。此外，可使用本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化以獲得蛋白質(zhì)的優(yōu)化表達(dá)?？蓸?gòu)建一種或多種表達(dá)載體以包括如本文示例的一種或多種乙酰-coa生物合成途徑編碼核酸，所述編碼核酸可操作性連接到在宿主有機(jī)體中具有功能的控制序列上。適用于本發(fā)明的微生物宿主有機(jī)體的表達(dá)載體包括例如質(zhì)粒、噬菌體載體、病毒載體、附加體(episome)和人工染色體，其包括可用于穩(wěn)定整合到宿主染色體中的載體和選擇序列或標(biāo)記。另外，表達(dá)載體可包括一種或多種選擇標(biāo)記基因和適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列。也可包括選擇標(biāo)記基因，其例如提供抗生素或毒素抗性、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷或供應(yīng)培養(yǎng)基中沒(méi)有的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物。表達(dá)控制序列可包括本領(lǐng)域中熟知的組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子等。當(dāng)打算共表達(dá)兩種或兩種以上外源編碼核酸時(shí)，這兩種核酸皆可插入例如單一表達(dá)載體中或單獨(dú)的表達(dá)載體中。對(duì)于單一載體表達(dá)，編碼核酸可操作性地連接于一種常用表達(dá)控制序列或連接于不同的表達(dá)控制序列，例如一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和一種組成型啟動(dòng)子。代謝或合成途徑中所涉及的外源核酸序列的轉(zhuǎn)化可使用本領(lǐng)域中熟知的方法進(jìn)行證實(shí)。所述方法包括例如核酸分析，例如mrna的northern印跡技術(shù)或聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)，或基因產(chǎn)物表達(dá)的免疫印跡技術(shù)，或其它用于測(cè)試所引入核酸序列或其對(duì)應(yīng)基因產(chǎn)物的表達(dá)的合適分析方法。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解外源核酸是足量表達(dá)以產(chǎn)生期望產(chǎn)物，且應(yīng)進(jìn)一步了解可使用本領(lǐng)域中熟知且如本文所公開(kāi)的方法優(yōu)化表達(dá)水平以獲得充分表達(dá)。本發(fā)明另外提供一種通過(guò)培養(yǎng)具有乙酰-coa途徑的本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體來(lái)產(chǎn)生乙酰-coa的方法。乙酰-coa途徑可包含例如至少一種編碼乙酰-coa途徑酶或蛋白質(zhì)的外源核酸，其在用于產(chǎn)生乙酰-coa的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-coa，所述乙酰-coa途徑包含甲醇-甲基轉(zhuǎn)移酶和乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶。在所述乙酰-coa途徑中，甲醇-甲基轉(zhuǎn)移酶可包括選自甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉蛋白(例如mtac)和甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(mtaa)的酶或蛋白質(zhì)。此外，在所述乙酰-coa途徑中，乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶可包括例如選自甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(例如acse)、類咕啉鐵硫蛋白(例如acsd)、鎳蛋白裝配蛋白(例如acsf)、鐵氧還蛋白、乙酰-coa合成酶、一氧化碳脫氫酶和鎳蛋白裝配蛋白(例如cooc)的酶或蛋白質(zhì)。非天然存在的微生物有機(jī)體可處在基本上厭氧培養(yǎng)基中。在一特定實(shí)施方案中，非天然存在的微生物有機(jī)體可在co2、co和/或h2、即其組合以及甲醇存在下培養(yǎng)。非天然存在的微生物有機(jī)體可進(jìn)一步包含丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶，其可由外源核酸表達(dá)。非天然存在的微生物有機(jī)體還可進(jìn)一步包含氫化酶，其例如由內(nèi)源或外源核酸編碼。在另一實(shí)施方案中，非天然存在的微生物有機(jī)體可在存在電子受體(例如硝酸鹽)、尤其在基本上厭氧條件下培養(yǎng)(參見(jiàn)實(shí)施例iii)。應(yīng)了解可向微生物培養(yǎng)物中添加適量硝酸鹽以實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)的期望增加，例如1mm到100mm硝酸鹽，或視需要更低或更高濃度，只要添加量為生物質(zhì)的期望增加提供足量的電子受體即可。所述量視情況包括(但不限于)5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、40mm、50mm以實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)的期望增加?？墒褂檬熘椒▓?zhí)行用于測(cè)試乙酰-coa產(chǎn)生的合適純化和/或分析。對(duì)于打算測(cè)試的每種經(jīng)工程改造的菌株，可培養(yǎng)合適的復(fù)制菌株，例如一式三份培養(yǎng)物。舉例來(lái)說(shuō)，可監(jiān)測(cè)經(jīng)工程改造的生產(chǎn)宿主中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物形成?？赏ㄟ^(guò)例如hplc(高效液相色譜)、gc-ms(氣相色譜-質(zhì)譜法)和lc-ms(液相色譜-質(zhì)譜法)或其它合適的分析方法等方法，使用本領(lǐng)域中熟知的常規(guī)程序來(lái)分析終產(chǎn)物和中間物和其它有機(jī)化合物。也可用培養(yǎng)物上清液來(lái)測(cè)試發(fā)酵液中的產(chǎn)物釋放情況。副產(chǎn)物和殘余葡萄糖可通過(guò)hplc，使用例如針對(duì)葡萄糖和醇類的折射率檢測(cè)器和針對(duì)有機(jī)酸的uv檢測(cè)器(lin等人,biotechnol.bioeng.90:775-779(2005))，或其它在本領(lǐng)域中熟知的合適分析和檢測(cè)方法來(lái)定量。來(lái)自外源dna序列的單獨(dú)酶或蛋白質(zhì)活性也可使用本領(lǐng)域中熟知的方法來(lái)分析(參見(jiàn)實(shí)施例iii)。乙酰-coa或來(lái)源于乙酰-coa的產(chǎn)物可使用本領(lǐng)域中熟知的各種方法與培養(yǎng)物中的其它組分分離。來(lái)源于乙酰-coa的產(chǎn)物包括(但不限于)乙醇、丁醇、異丁醇、異丙醇、1,4-丁二醇、琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、4-羥基丁酸、3-羥基丙酸、乳酸、甲基丙烯酸、己二酸和丙烯酸。所述分離方法包括例如萃取程序，以及包括連續(xù)液液萃取、滲透蒸發(fā)、膜過(guò)濾、膜分離、反滲透、電滲析、蒸餾、結(jié)晶、離心、萃取過(guò)濾、離子交換色譜、尺寸排阻色譜、吸附色譜和超濾的方法。所有上述方法皆為本領(lǐng)域中所熟知。可培養(yǎng)本文所述的任何非天然存在的微生物有機(jī)體以產(chǎn)生和/或分泌本發(fā)明的生物合成產(chǎn)物。舉例來(lái)說(shuō)，可培養(yǎng)產(chǎn)乙酰-coa微生物有機(jī)體以便以生物合成產(chǎn)生乙酰-coa或來(lái)源于乙酰-coa的產(chǎn)物。為了產(chǎn)生乙酰-coa，在具有甲醇和包含co、co2和/或h2的氣體以及其它必需營(yíng)養(yǎng)物作為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌株。非常需要在發(fā)酵罐中維持厭氧條件以降低全過(guò)程的成本。所述條件可例如通過(guò)首先用氮?dú)鈬娚渑囵B(yǎng)基，然后用隔膜和螺旋蓋密封燒瓶來(lái)獲得。對(duì)于在厭氧條件下未觀察到生長(zhǎng)的菌株，可通過(guò)在隔膜上打出用于有限通氣的小孔來(lái)應(yīng)用微氧條件。示例性厭氧條件先前已有描述且為本領(lǐng)域中所熟知。例如美國(guó)專利申請(qǐng)案第11/891,602號(hào)(2007年8月10日申請(qǐng))和wo/2008/115840描述示例性需氧和厭氧條件。發(fā)酵可如本文所公開(kāi)以分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)方式進(jìn)行。必要時(shí)，可通過(guò)根據(jù)需要添加堿(例如naoh或其它堿)或酸使培養(yǎng)基維持在所需ph下而使培養(yǎng)基的ph維持在期望ph，尤其中性ph，例如約7的ph。生長(zhǎng)速率可通過(guò)使用分光光度計(jì)(600nm)測(cè)量光學(xué)密度來(lái)測(cè)定，且葡萄糖攝取速率可通過(guò)監(jiān)測(cè)碳源隨時(shí)間的消耗來(lái)測(cè)定。生長(zhǎng)培養(yǎng)基可包含例如任何可向非天然存在的微生物供應(yīng)碳源的碳水化合物源。所述碳水化合物源包括例如糖，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。其它碳水化合物源包括例如再生原料和生物質(zhì)。可在本發(fā)明方法中用作原料的生物質(zhì)的示例性類型包括纖維素類生物質(zhì)、半纖維素類生物質(zhì)和木質(zhì)素原料或所述原料的部分。所述生物質(zhì)原料含有例如可用作碳源的碳水化合物基質(zhì)，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。根據(jù)本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解除上文示例者之外的再生原料和生物質(zhì)也可用于培養(yǎng)本發(fā)明的微生物有機(jī)體以供產(chǎn)生乙酰-coa。因此，根據(jù)本文所提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將了解可產(chǎn)生非天然存在的微生物有機(jī)體，其在利用例如碳水化合物、甲醇和包含co、co2和/或h2的氣體等碳源生長(zhǎng)時(shí)，可細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或分泌經(jīng)生物合成的本發(fā)明化合物。所述化合物包括(但不限于)乙酰-coa和乙酰-coa途徑中的任何中間代謝物，以及來(lái)源于乙酰-coa的產(chǎn)物，包括乙醇、丁醇、異丁醇、異丙醇、1,4-丁二醇、琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、4-羥基丁酸、3-羥基丙酸、乳酸、甲基丙烯酸、己二酸和丙烯酸。為了實(shí)現(xiàn)期望化合物或中間物的生物合成，需要對(duì)一種或多種所需酶或蛋白質(zhì)活性進(jìn)行工程改造，包括例如并入部分或所有乙酰-coa生物合成途徑。因此，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其在利用碳水化合物或其它碳源生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生乙酰-coa，且在利用碳水化合物或其它碳源生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生和/或分泌乙酰-coa途徑中所示的任何中間代謝物或產(chǎn)生和/或分泌來(lái)源于乙酰-coa的產(chǎn)物。本發(fā)明的產(chǎn)乙酰-coa微生物有機(jī)體可引發(fā)從例如5-甲基-四氫葉酸(me-thf)等中間物啟動(dòng)合成?？墒褂萌绫疚氖纠谋绢I(lǐng)域中熟知的方法構(gòu)建本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體，以便以足夠量外源表達(dá)至少一種編碼乙酰-coa途徑酶或蛋白質(zhì)的核酸以產(chǎn)生乙酰-coa。應(yīng)了解本發(fā)明的微生物有機(jī)體是在足以產(chǎn)生乙酰-coa的條件下培養(yǎng)。根據(jù)本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可實(shí)現(xiàn)乙酰-coa的生物合成，從而產(chǎn)生約0.001-200mm或以上的細(xì)胞內(nèi)濃度。乙酰-coa的細(xì)胞內(nèi)濃度一般介于約3-150mm之間，尤其介于約5-125mm之間，且更尤其介于約8-100mm之間，包括約10mm、20mm、50mm、80mm或以上。還可從本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體獲得介于這些示例性范圍之間和在這些示例性范圍以上的細(xì)胞內(nèi)濃度。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)條件包括厭氧或基本上厭氧的生長(zhǎng)或維持條件。示例性厭氧條件先前已有描述且為本領(lǐng)域中所熟知。本文描述了用于發(fā)酵過(guò)程的示例性厭氧條件，且其也例如描述于美國(guó)專利申請(qǐng)案第11/891,602號(hào)(2007年8月10日申請(qǐng))和wo/2008/115840中。這些條件中的任一種以及本領(lǐng)域中熟知的其它厭氧條件皆可用于非天然存在的微生物有機(jī)體。在所述厭氧條件下，產(chǎn)乙酰-coa微生物有機(jī)體可以5-10mm或以上的細(xì)胞內(nèi)濃度以及本文示例的所有其它濃度合成乙酰-coa。應(yīng)了解以上描述是指細(xì)胞內(nèi)濃度，且產(chǎn)乙酰-coa微生物有機(jī)體可細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生乙酰-coa。此外，可細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和/或分泌來(lái)源于乙酰-coa的產(chǎn)物。所述產(chǎn)物包括(但不限于)乙醇、丁醇、異丁醇、異丙醇、1,4-丁二醇、琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、4-羥基丁酸、3-羥基丙酸、乳酸、甲基丙烯酸、己二酸和丙烯酸。培養(yǎng)條件可包括例如液體培養(yǎng)程序以及發(fā)酵和其它大規(guī)模培養(yǎng)程序。如本文所述，本發(fā)明的生物合成產(chǎn)物的尤其有用的產(chǎn)量可在厭氧或基本上厭氧的培養(yǎng)條件下獲得。如本文所述，一種用于實(shí)現(xiàn)乙酰-coa的生物合成的示例性生長(zhǎng)條件包括厭氧培養(yǎng)或發(fā)酵條件。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的非天然存在的微生物有機(jī)體可在厭氧或基本上厭氧條件下維持、培養(yǎng)或發(fā)酵。簡(jiǎn)言之，厭氧條件是指沒(méi)有氧的環(huán)境?；旧蠀捬鯒l件包括在例如培養(yǎng)基中的溶解氧濃度保持在0與10％飽和度之間的條件下培養(yǎng)、分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。基本上厭氧條件還包括在維持于小于1％氧的氣氛的密封室內(nèi)，在液體培養(yǎng)基中或固體瓊脂上生長(zhǎng)或放置細(xì)胞。氧的百分比可通過(guò)例如用n2/co2混合物或其它合適的一種或多種非氧氣體噴射培養(yǎng)物來(lái)維持。本文所述的培養(yǎng)條件可以按比例擴(kuò)大和連續(xù)擴(kuò)大以供產(chǎn)生乙酰-coa。示例性生長(zhǎng)程序包括例如補(bǔ)料分批發(fā)酵和分批分離；補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)分離；或連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)分離。所有這些過(guò)程皆為本領(lǐng)域中所熟知。發(fā)酵程序尤其適用于以生物合成方法產(chǎn)生商業(yè)數(shù)量的乙酰-coa。通常情況下且如同不連續(xù)培養(yǎng)程序中的情況一樣，乙酰-coa的連續(xù)和/或接近連續(xù)產(chǎn)生將包括在充足的營(yíng)養(yǎng)物和培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的非天然存在的產(chǎn)乙酰-coa有機(jī)體以保持和/或接近保持指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)。在所述條件下的連續(xù)培養(yǎng)可包括例如1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或以上。此外，連續(xù)培養(yǎng)可包括1周、2周、3周、4周或5周或以上和至多數(shù)月?；蛘?，本發(fā)明的有機(jī)體可根據(jù)特定應(yīng)用的需要培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。應(yīng)了解連續(xù)和/或接近連續(xù)培養(yǎng)條件還可包括這些示例性時(shí)段之間的所有時(shí)間間隔。應(yīng)進(jìn)一步了解，本發(fā)明的微生物有機(jī)體的培養(yǎng)時(shí)間是足以產(chǎn)生足量產(chǎn)物用于期望目的的時(shí)段。發(fā)酵程序?yàn)楸绢I(lǐng)域中所熟知。簡(jiǎn)言之，用于以生物合成方法產(chǎn)生乙酰-coa的發(fā)酵可例如以下列方式利用：補(bǔ)料分批發(fā)酵和分批分離；補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)分離；或連續(xù)發(fā)酵和連續(xù)分離。分批和連續(xù)發(fā)酵程序的實(shí)例為本領(lǐng)域中所熟知。除了使用本發(fā)明的產(chǎn)乙酰-coa微生物有機(jī)體連續(xù)產(chǎn)生大量乙酰-coa的上述發(fā)酵程序外，產(chǎn)乙酰-coa微生物有機(jī)體也可例如根據(jù)需要同時(shí)經(jīng)歷化學(xué)合成程序以將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其它化合物，或產(chǎn)物可自發(fā)酵培養(yǎng)物分離，和依次經(jīng)歷化學(xué)轉(zhuǎn)化以將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其它化合物。多年來(lái)，已經(jīng)分離出至少三十種不同的野生型有機(jī)體，且其顯示可利用合成氣或合成氣的組分生長(zhǎng)，包括能將合成氣轉(zhuǎn)化為乙醇的微生物(vega等人,appl.biochem.biotechnol.20/21:781-797(1989))(參見(jiàn)表1)。用于改良型合成氣發(fā)酵的候選有機(jī)體包括產(chǎn)乙酸菌、光能利用菌、硫酸還原菌和產(chǎn)甲烷菌，其可利用co和/或co2/h2作為唯一的碳源和能源(sipma等人,crit.rev.biotechnol.26:41-65.(2006))。嗜溫產(chǎn)乙酸菌嗜羧酸梭菌代表最有前景用于合成氣生成化學(xué)物平臺(tái)(syngas-to-chemicalsplatform)的有機(jī)體中的一種，因?yàn)槠渚哂锌焖俦对鰰r(shí)間且已顯示可利用合成氣生長(zhǎng)期間天然產(chǎn)生乙醇和少量的丁醇(henstra等人,curr.opin.biotechnol.18:200-206(2007))。可開(kāi)發(fā)用于這種有機(jī)體的基因工具。針對(duì)產(chǎn)氫紫色非硫細(xì)菌、即深紅紅螺菌的目標(biāo)基因缺失或插入的基因工具已經(jīng)存在，所述細(xì)菌是另一種用于開(kāi)發(fā)合成氣利用以產(chǎn)生期望產(chǎn)物的優(yōu)良候選有機(jī)體，但其天然從合成氣產(chǎn)生氫且因此可根據(jù)需要工程改造代謝改變，一些合成氣利用型有機(jī)體的代謝是已知的。舉例來(lái)說(shuō)，例如嗜羧酸梭菌等產(chǎn)乙酸菌可通過(guò)利用wood-ljungdahl途徑在co或co2存在下生長(zhǎng)，甚至可在不存在葡萄糖的情況下生長(zhǎng)，只要存在氫以便供應(yīng)必需的還原當(dāng)量即可。圖3說(shuō)明wood-ljungdahl途徑(也參見(jiàn)圖1和2)，且所述途徑顯示產(chǎn)乙酸菌經(jīng)由產(chǎn)生關(guān)鍵的代謝中間物乙酰-coa而利用co作為唯一碳源和能源的能力。特定來(lái)說(shuō)，co可經(jīng)氧化以產(chǎn)生還原當(dāng)量和co2，或可被直接同化成乙酰-coa，其隨后轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)或代謝物。重要的是，乙酰-coa是關(guān)鍵的代謝中間物，可用作許多代謝物和其它化學(xué)實(shí)體的前體。因此，微生物從合成氣或其它氣態(tài)碳源產(chǎn)生乙酰-coa的能力允許對(duì)合成氣利用型有機(jī)體或能利用其它氣態(tài)碳源的有機(jī)體進(jìn)行工程改造，以便產(chǎn)生作為期望產(chǎn)物的許多化學(xué)物和燃料。為了表征合成氣或其它氣態(tài)碳源作為可行的原料經(jīng)由發(fā)酵來(lái)商業(yè)制造化學(xué)物和燃料的應(yīng)用，進(jìn)行可行性研究以解決與當(dāng)前系統(tǒng)有關(guān)的關(guān)鍵問(wèn)題和難題。初步代謝建模工作已經(jīng)表明合成氣轉(zhuǎn)化為化學(xué)物可在熱力學(xué)上非常有利，且特定化學(xué)物可作為專有產(chǎn)物制得。這不僅會(huì)降低下游加工需求，而且會(huì)最大化產(chǎn)物產(chǎn)量。此外，期望產(chǎn)物的產(chǎn)生可與生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)，因此可根據(jù)需要連續(xù)進(jìn)行發(fā)酵。因?yàn)檫B續(xù)過(guò)程是維持在高細(xì)胞濃度下且節(jié)約分批往返時(shí)間，所以其在經(jīng)濟(jì)上更為有利。如本文所公開(kāi)，本發(fā)明涉及開(kāi)發(fā)能利用合成氣或其它氣態(tài)碳源的微生物，從而允許以高產(chǎn)率、滴度和生產(chǎn)率將co和/或co2有效地轉(zhuǎn)化為化學(xué)產(chǎn)物。一個(gè)示例性的適用商業(yè)實(shí)施方案涉及開(kāi)發(fā)能以≥80％理論最大值的產(chǎn)率、≥50g/l的產(chǎn)物耐受性(producttolerance)、≥50g/l的滴度和至少2g/l/h的生產(chǎn)率產(chǎn)生特定化學(xué)物的有機(jī)體。雖然這些標(biāo)準(zhǔn)在商業(yè)上很有用，但應(yīng)了解能獲得小于任何或所有這些標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果的有機(jī)體也適用于本發(fā)明。舉例來(lái)說(shuō)，有機(jī)體可以大于或等于75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％等中的任一種的產(chǎn)率產(chǎn)生特定化學(xué)物，只要所得產(chǎn)率足以滿足期望應(yīng)用即可。類似地，有機(jī)體可獲得大于或等于45g/l、40g/l、35g/l、30g/l、25g/l、20g/l、15g/l、10g/l等中的任一種的產(chǎn)物耐受性，只要所得產(chǎn)率足以滿足期望應(yīng)用即可。此外，有機(jī)體可獲得大于或等于200g/l、190g/l、180g/l、170g/l、160g/l、150g/l、140g/l、130g/l、120g/l、110g/l、100g/l、90g/l、80g/l、70g/l、60g/l、50g/l、45g/l、40g/l、35g/l、30g/l、25g/l、20g/l、15g/l、10g/l等中的任一種的滴度，只要所得產(chǎn)率足以滿足期望應(yīng)用即可。此外，有機(jī)體可獲得1.5g/l/h、1g/l/h、0.5g/l/h等中的至少任一種的生產(chǎn)率，只要所得產(chǎn)率足以滿足期望應(yīng)用即可。如本文所公開(kāi)，對(duì)丁醇作為合成氣利用產(chǎn)物的假設(shè)分析表明，能有效利用便宜且容易獲得的合成氣作為原料，且可得到可能比當(dāng)前石油化學(xué)方法節(jié)省≥50％成本的方法，特別是在合成氣作為原料的低成本方面。除了低成本外，合成氣還是一種豐富且適應(yīng)性強(qiáng)的基質(zhì)，可從煤和許多類型的生物質(zhì)產(chǎn)生，所述生物質(zhì)包括能源作物，例如柳枝稷，以及廢物，例如廢木材、農(nóng)業(yè)廢物、乳業(yè)廢物和市政固體廢物。因此，產(chǎn)生能利用合成氣或其它氣態(tài)碳源產(chǎn)生期望產(chǎn)物的有機(jī)體的能力允許從幾乎任何生物質(zhì)源產(chǎn)生期望產(chǎn)物。這種特征避免了針對(duì)用于生物燃料或化學(xué)物生產(chǎn)的每種類型的生物質(zhì)特別開(kāi)發(fā)不同方法的需求。對(duì)于合成氣產(chǎn)生中的廢物的利用也可用于降低環(huán)境污染并緩解生物廢物的嚴(yán)重處理問(wèn)題。此外，合成氣作為原料不會(huì)引起在例如基于玉米產(chǎn)生乙醇的情況下存在的進(jìn)料與燃料的爭(zhēng)議。鑒于可用于產(chǎn)生合成氣的基質(zhì)的范圍很廣，預(yù)期這種原料的供應(yīng)和成本結(jié)構(gòu)在很多年內(nèi)都會(huì)保持相對(duì)穩(wěn)定。最后，合成氣廣泛用于加熱和供能，且因此可用作生物質(zhì)能的來(lái)源，其可補(bǔ)充或消除生產(chǎn)上對(duì)基于石油的能量的需求，從而提供額外的成本節(jié)約。雖然在本文的各個(gè)實(shí)施方案中示例丁醇作為期望產(chǎn)物，但應(yīng)了解可產(chǎn)生任何能由本發(fā)明的微生物產(chǎn)生的產(chǎn)物并利用其產(chǎn)生期望產(chǎn)物。期望產(chǎn)物一般包括(但不限于)可用于化學(xué)合成或可用作燃料的烴類。示例性期望產(chǎn)物包括(但不限于)甲醇、乙醇、丁醇、乙酸、丁酸、乳酸、琥珀酸、4-羥基丁酸、1,4-丁二醇等。在其它方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有可包含至少一種編碼4-羥基丁酸途徑酶的外源核酸的4-羥基丁酸途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生4-羥基丁酸。4-羥基丁酸途徑酶可包括乙酰乙酰-coa硫解酶、3-羥基丁酰-coa脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-coa水合酶、4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶和4-羥基丁酸激酶。在其它方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有可包含至少一種編碼1,4-丁二醇途徑酶的外源核酸的1,4-丁二醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生1,4-丁二醇。1,4-丁二醇途徑酶可包括乙酰乙酰-coa硫解酶、3-羥基丁酰-coa脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-coa水合酶、4-羥基丁酰-coa還原酶(醇形成型)、4-羥基丁酰-coa還原酶(醛形成型)和1,4-丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還可包含具有至少一種編碼乙酰-coa途徑酶的外源核酸的乙酰-coa途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-coa。乙酰-coa途徑酶可包括類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-coa合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在其它方面，本發(fā)明提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有可包含至少一種編碼1,4-丁二醇途徑酶的外源核酸的1,4-丁二醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生1,4-丁二醇。1,4-丁二醇途徑酶可包括乙酰乙酰-coa硫解酶、3-羥基丁酰-coa脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-coa水合酶、4-羥基丁酰-coa還原酶(醇形成型)、4-羥基丁酰-coa還原酶(醛形成型)和1,4-丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還可包含具有至少一種編碼乙酰-coa途徑酶的外源核酸的乙酰-coa途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-coa。乙酰-coa途徑酶可包括乙酰-coa合成酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。在其它方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生4-羥基丁酸的方法，其可包含培養(yǎng)具有4-羥基丁酸途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體。所述途徑可包含至少一種編碼4-羥基丁酸途徑酶的外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生4-羥基丁酸的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生4-羥基丁酸。4-羥基丁酸途徑酶可包括乙酰乙酰-coa硫解酶、3-羥基丁酰-coa脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-coa水合酶、4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶和4-羥基丁酸激酶。在其它方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1,4-丁二醇的方法，其可包含培養(yǎng)具有1,4-丁二醇途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體。所述途徑可包含至少一種編碼1,4-丁二醇途徑酶的外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生1,4-丁二醇的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生1,4-丁二醇。1,4-丁二醇途徑可包含乙酰乙酰-coa硫解酶、3-羥基丁酰-coa脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-coa水合酶、4-羥基丁酰-coa還原酶(醇形成型)、4-羥基丁酰-coa還原酶(醛形成型)和1,4-丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還可包含具有至少一種編碼乙酰-coa途徑酶的外源核酸的乙酰-coa途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-coa。乙酰-coa途徑酶可包括類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-coa合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。最后，在一些方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生1,4-丁二醇的方法，其可包含培養(yǎng)具有1,4-丁二醇途徑的非天然存在的微生物有機(jī)體。所述途徑可包含至少一種編碼1,4-丁二醇途徑酶的外源核酸，所述外源核酸在用于產(chǎn)生1,4-丁二醇的條件和足夠時(shí)間下足量表達(dá)以產(chǎn)生1,4-丁二醇。1,4-丁二醇途徑可包含乙酰乙酰-coa硫解酶、3-羥基丁酰-coa脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-coa水合酶、4-羥基丁酰-coa還原酶(醇形成型)、4-羥基丁酰-coa還原酶(醛形成型)和1,4-丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還可包含具有至少一種編碼乙酰-coa途徑酶的外源核酸的乙酰-coa途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生乙酰-coa。乙酰-coa途徑酶可包括乙酰-coa合成酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的有機(jī)體具有功能性甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、合成乙酰-coa的能力和從乙酰-coa合成4-hb的能力，如圖11所描繪。本文所述的其它有機(jī)體具有功能性甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、合成乙酰-coa的能力和從乙酰-coa合成bdo的能力，如圖12所描繪。本發(fā)明還提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有可包含至少一種編碼4-羥基丁酸途徑酶的外源核酸的4-羥基丁酸途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生4-羥基丁酸。4-羥基丁酸途徑酶可包括乙酰乙酰-coa硫解酶、3-羥基丁酰-coa脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-coa水合酶、4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶和4-羥基丁酸激酶。所述有機(jī)體還可包含至少一種例如以下的酶或多肽：類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-coa合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在一些實(shí)施方案中，具有4-羥基丁酸途徑的有機(jī)體可包含甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。所述有機(jī)體利用例如以下的原料：1)甲醇和co，2)甲醇、co2和h2，3)甲醇、co、co2和h2，4)甲醇和包含co和h2的合成氣，和5)甲醇和包含co、co2和h2的合成氣。其它具有4-羥基丁酸途徑的有機(jī)體可具有甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。所述有機(jī)體利用例如以下的原料：1)co，2)co2和h2，3)co和co2，4)包含co和h2的合成氣，和5)包含co、co2和h2的合成氣。本發(fā)明還提供一種非天然存在的微生物有機(jī)體，其具有可包含至少一種編碼1,4-丁二醇途徑酶的外源核酸的1,4-丁二醇途徑，所述外源核酸足量表達(dá)以產(chǎn)生1,4-丁二醇。1,4-丁二醇途徑酶包括例如乙酰乙酰-coa硫解酶、3-羥基丁酰-coa脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-coa水合酶、4-羥基丁酰-coa還原酶(醇形成型)、4-羥基丁酰-coa還原酶(醛形成型)和1,4-丁二醇脫氫酶。所述有機(jī)體還可包含至少一種例如以下的酶或多肽：類咕啉蛋白、甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白裝配蛋白、鐵氧還蛋白、乙酰-coa合成酶、一氧化碳脫氫酶、丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶和氫化酶。在一些實(shí)施方案中，具有1,4-丁二醇途徑的有機(jī)體可包含甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶。所述有機(jī)體利用例如以下的原料：1)甲醇和co，2)甲醇、co2和h2，3)甲醇、co、co2和h2，4)甲醇和包含co和h2的合成氣，和5)甲醇和包含co、co2和h2的合成氣。在其它實(shí)施方案中，具有1,4-丁二醇途徑的有機(jī)體可包含甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶。所述有機(jī)體利用選自由諸如以下組成的組的原料：1)co，2)co2和h2，3)co和co2，4)包含co和h2的合成氣，和5)包含co、co2和h2的合成氣。本發(fā)明的示例性微生物有機(jī)體可含有如圖13所描繪的途徑。所述有機(jī)體可含有wood-ljungdahl途徑的功能性甲基分支、合成乙酰-coa的能力和從乙酰-coa合成4-羥基丁酸的能力。本發(fā)明的另一示例性微生物有機(jī)體可含有如圖14所描繪的途徑。所述有機(jī)體可含有wood-ljungdahl途徑的功能性甲基分支、合成乙酰-coa的能力和從乙酰-coa合成1,4-丁二醇的能力。為了產(chǎn)生更好的生產(chǎn)者，可利用代謝建模來(lái)優(yōu)化生長(zhǎng)條件。也可用建模來(lái)設(shè)計(jì)基因剔除，其另外優(yōu)化途徑的利用(參見(jiàn)例如美國(guó)專利公開(kāi)案us2002/0012939、us2003/0224363、us2004/0029149、us2004/0072723、us2003/0059792、us2002/0168654和us2004/0009466，和美國(guó)專利第7,127,379號(hào))。建模分析允許可靠地預(yù)測(cè)使代謝朝著更有效產(chǎn)生乙酰-coa或來(lái)源于乙酰-coa的產(chǎn)物的方向移動(dòng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。一種鑒別和設(shè)計(jì)有利于期望產(chǎn)物的生物合成的代謝改變的計(jì)算方法是optknock計(jì)算框架(burgard等人,biotechnol.bioeng.84:647-657(2003))。optknock是一種代謝建模和模擬程序，其暗示可形成過(guò)量產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物的遺傳穩(wěn)定的微生物的基因缺失策略。特定來(lái)說(shuō)，所述框架檢查微生物的完整代謝和/或生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)，以便暗示促使期望生物化學(xué)產(chǎn)物變成細(xì)胞生長(zhǎng)的專性副產(chǎn)物的基因操作。通過(guò)用具有戰(zhàn)略意義的基因缺失或其它功能基因破壞使生物化學(xué)生產(chǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)偶聯(lián)，在生物反應(yīng)器中歷經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間后施加于經(jīng)工程改造的菌株的生長(zhǎng)選擇壓力可導(dǎo)致性能提高，因?yàn)樯L(zhǎng)與生物化學(xué)生產(chǎn)被強(qiáng)制偶聯(lián)。最后，當(dāng)構(gòu)建基因缺失時(shí)，經(jīng)設(shè)計(jì)的菌株還原成其野生型狀態(tài)的可能性可以忽略，因?yàn)閛ptknock所選擇的基因會(huì)從基因組完全移除。因此，所述計(jì)算方法可用于鑒別可實(shí)現(xiàn)期望產(chǎn)物的生物合成的替代途徑，或與非天然存在的微生物有機(jī)體結(jié)合使用以便進(jìn)一步優(yōu)化期望產(chǎn)物的生物合成。簡(jiǎn)言之，optknock是本文中用于指代建模細(xì)胞代謝的計(jì)算方法和系統(tǒng)的術(shù)語(yǔ)。optknock程序涉及將特定約束納入通量平衡分析(fba)模型中的模型和方法的框架。這些約束包括例如定性動(dòng)態(tài)信息、定性調(diào)控信息和/或dna微陣列實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。optknock還例如通過(guò)縮窄經(jīng)由通量平衡模型產(chǎn)生的通量邊界，隨后探測(cè)在基因添加或缺失存在下代謝網(wǎng)絡(luò)的性能極限來(lái)計(jì)算各種代謝問(wèn)題的解決方案。optknock計(jì)算框架允許構(gòu)建能夠有效地詢問(wèn)代謝網(wǎng)絡(luò)的性能極限的模型公式，并提供對(duì)所得混合整數(shù)線性規(guī)劃問(wèn)題求解的方法。本文中稱為optknock的代謝建模和模擬方法是描述于例如2002年1月10日申請(qǐng)的美國(guó)公開(kāi)案2002/0168654、2002年1月10日申請(qǐng)的國(guó)際專利第pct/us02/00660號(hào)和2007年8月10日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)案第11/891,602號(hào)，以及wo/2008/115840中。另一種鑒別和設(shè)計(jì)有利于產(chǎn)物的生物合成產(chǎn)生的代謝變化的計(jì)算方法是被稱作的代謝建模和模擬系統(tǒng)。這種計(jì)算方法和系統(tǒng)是描述于例如2002年6月14日申請(qǐng)的美國(guó)公開(kāi)案2003/0233218和2003年6月13日申請(qǐng)的國(guó)際專利申請(qǐng)案第pct/us03/18838號(hào)中。是一種計(jì)算系統(tǒng)，可用于產(chǎn)生硅中(insilico)網(wǎng)絡(luò)模型并模擬質(zhì)量、能量或電荷通過(guò)生物系統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)的通量，以便界定含有化學(xué)反應(yīng)在系統(tǒng)中任何和所有可能的功能性的解空間，從而確定生物系統(tǒng)的允許活性的范圍。這種方法被稱作基于約束的建模，因?yàn)榻饪臻g是由例如所包括反應(yīng)的已知化學(xué)計(jì)量以及反應(yīng)熱力學(xué)和與通過(guò)反應(yīng)的最大通量能力約束等約束界定?？稍儐?wèn)這些約束所界定的空間以確定生物系統(tǒng)或其生物化學(xué)組分的表型能力和行為。這些計(jì)算方法與生物現(xiàn)實(shí)一致，因?yàn)樯锵到y(tǒng)適用性強(qiáng)且可以許多不同方式獲得相同結(jié)果。經(jīng)由進(jìn)化機(jī)制設(shè)計(jì)生物系統(tǒng)，所述進(jìn)化機(jī)制已經(jīng)受所有活系統(tǒng)必須面對(duì)的基本約束限制。因此，基于約束的建模策略涵蓋這些一般現(xiàn)實(shí)。此外，經(jīng)由縮窄約束而對(duì)網(wǎng)絡(luò)模型連續(xù)施加進(jìn)一步約束的能力導(dǎo)致解空間的尺寸變小，從而提高生理性能或表型的預(yù)測(cè)精確性。根據(jù)本文所提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠應(yīng)用代謝建模和模擬的各種計(jì)算框架，以便設(shè)計(jì)和實(shí)施期望化合物在宿主微生物有機(jī)體中的生物合成。所述代謝建模和模擬方法包括例如上文以和optknock示例的計(jì)算系統(tǒng)。為了說(shuō)明本發(fā)明，本文關(guān)于建模和模擬的optknock計(jì)算框架描述了一些方法。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將知悉如何使用optknock對(duì)本領(lǐng)域中熟知的任何其它代謝建模和模擬計(jì)算框架和方法應(yīng)用代謝變化的鑒別、設(shè)計(jì)和實(shí)施。上文所述的方法將提供一組用于破壞的代謝反應(yīng)。所述組內(nèi)每個(gè)反應(yīng)的消除或代謝修飾可導(dǎo)致期望產(chǎn)物在有機(jī)體的生長(zhǎng)期中作為專性產(chǎn)物產(chǎn)生。因?yàn)檫@些反應(yīng)是已知的，所以二層optknock問(wèn)題的解決方案也將提供催化這一組反應(yīng)內(nèi)每個(gè)反應(yīng)的一種或多種酶的相關(guān)編碼基因。對(duì)于一組反應(yīng)和其參與每個(gè)反應(yīng)的酶的對(duì)應(yīng)編碼基因的鑒別一般是自動(dòng)化方法，這可經(jīng)由將所述反應(yīng)與在酶和編碼基因之間具有關(guān)系的反應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)。一旦得到鑒別，就通過(guò)至少一種編碼這一組反應(yīng)內(nèi)每個(gè)代謝反應(yīng)的基因的功能破壞在目標(biāo)細(xì)胞或有機(jī)體中實(shí)施打算破壞以產(chǎn)生期望產(chǎn)物的這一組反應(yīng)。一種尤其有用的實(shí)現(xiàn)反應(yīng)組的功能破壞的方法是缺失每種編碼基因。然而，在一些情況下，通過(guò)其它基因畸變破壞反應(yīng)可能是有利的，包括例如突變、調(diào)控區(qū)(例如啟動(dòng)子或調(diào)控因子的順式結(jié)合位點(diǎn))缺失或在許多位置中的任一個(gè)位置截?cái)嗑幋a序列。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)希望快速評(píng)定產(chǎn)物偶聯(lián)時(shí)，或當(dāng)遺傳逆轉(zhuǎn)不太可能發(fā)生時(shí)，產(chǎn)生少于基因集合的總體缺失的缺失的這些畸變可能是有利的。為了針對(duì)上述二層optknock問(wèn)題確定其它生產(chǎn)解決方案，從而產(chǎn)生用于破壞的其它各組反應(yīng)或可實(shí)現(xiàn)生物合成(包括期望產(chǎn)物的生長(zhǎng)偶聯(lián)型生物合成)的代謝修飾，可實(shí)施被稱作整數(shù)分割的優(yōu)化方法。所述方法是通過(guò)對(duì)上文示例的optknock問(wèn)題迭代求解來(lái)進(jìn)行，其中在每次迭代時(shí)納入被稱作整數(shù)分割的另一種約束。整數(shù)分割約束有效地防止求解過(guò)程選擇在任何先前迭代中鑒別的完全相同的一組反應(yīng)，所述迭代強(qiáng)制產(chǎn)物生物合成與生長(zhǎng)偶聯(lián)。舉例來(lái)說(shuō)，如果先前鑒別的生長(zhǎng)偶聯(lián)型代謝修飾規(guī)定反應(yīng)1、2和3用于破壞，那么以下約束防止在隨后求解中同時(shí)考慮相同的反應(yīng)。整數(shù)分割方法在本領(lǐng)域中是熟知的且可描述于例如burgard等人,biotechnol.prog.17:791-797(2001)。和本文關(guān)于與代謝建模和模擬的optknock計(jì)算框架組合使用而描述的所有方法一樣，減少迭代計(jì)算分析中的冗余度的整數(shù)分割方法也可與本領(lǐng)域中熟知的其它計(jì)算框架(包括例如)一起應(yīng)用。本文中示例的方法允許構(gòu)建以生物合成方式產(chǎn)生期望產(chǎn)物的細(xì)胞和有機(jī)體，包括強(qiáng)制目標(biāo)生物化學(xué)產(chǎn)物的產(chǎn)生與經(jīng)工程改造以具有所鑒別基因變異的細(xì)胞或有機(jī)體的生長(zhǎng)偶聯(lián)。因此，本文所述的計(jì)算方法允許鑒別和實(shí)施通過(guò)選自optknock或的硅中方法鑒別的代謝修飾。這組代謝修飾可包括例如一種或多種生物合成途徑酶的添加和/或一種或多種代謝反應(yīng)的功能破壞，包括例如通過(guò)基因缺失來(lái)破壞。如上文所討論，optknock方法的開(kāi)發(fā)是基于突變型微生物網(wǎng)絡(luò)當(dāng)經(jīng)歷長(zhǎng)期生長(zhǎng)選擇時(shí)可朝向其以計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的最大生長(zhǎng)表型進(jìn)化這一前提。換句話說(shuō)，所述方法調(diào)節(jié)有機(jī)體在選擇性壓力下自我優(yōu)化的能力。optknock框架允許對(duì)基于網(wǎng)絡(luò)化學(xué)計(jì)量迫使生物化學(xué)生產(chǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)偶聯(lián)的基因缺失組合進(jìn)行窮舉。對(duì)于最佳基因/反應(yīng)剔除的鑒別需要對(duì)二層優(yōu)化問(wèn)題求解，所述問(wèn)題選擇活性反應(yīng)組，使得所得網(wǎng)絡(luò)的最佳生長(zhǎng)答案過(guò)量產(chǎn)生目的生物化學(xué)物(burgard等人,biotechnol.bioeng.84:647-657(2003))。大腸桿菌代謝的硅中化學(xué)計(jì)量模型可用于鑒別先前示例的代謝途徑的必需基因，且描述于例如美國(guó)專利公開(kāi)案us2002/0012939、us2003/0224363、us2004/0029149、us2004/0072723、us2003/0059792、us2002/0168654和us2004/0009466，以及美國(guó)專利第7,127,379號(hào)中。如本文所公開(kāi)，optknock數(shù)學(xué)框架可用于定位導(dǎo)致期望產(chǎn)物的生長(zhǎng)偶聯(lián)型生產(chǎn)的基因缺失。此外，二層optknock問(wèn)題的解決方案僅提供一組缺失。為了列舉所有有意義的解決方案、即導(dǎo)致生長(zhǎng)偶聯(lián)型生產(chǎn)形成的所有剔除集合，可實(shí)施被稱作整數(shù)分割的優(yōu)化技術(shù)。這要求對(duì)optknock問(wèn)題迭代求解，其中在每次迭代時(shí)納入被稱作整數(shù)分割的另一種約束，如上文所討論。應(yīng)了解不會(huì)對(duì)本發(fā)明的各種實(shí)施方案的活性造成實(shí)質(zhì)影響的修飾也可涵蓋在本文提供的本發(fā)明的定義中。因此，以下實(shí)施例打算說(shuō)明但不限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例i用于合成氣發(fā)酵的有機(jī)體和途徑本實(shí)施例描述能利用合成氣的有機(jī)體和示例性途徑。多年來(lái)，已經(jīng)分離出至少三十種不同的有機(jī)體，且其顯示可利用合成氣或合成氣的組分(例如co、co2和h2)生長(zhǎng)(henstra等人,curr.opin.biotechnol.18:200-206(2007)；sipma等人,crit.rev.biotechnol.26:41-65(2006))。表1提供所述有機(jī)體的實(shí)例以及其許多性質(zhì)，例如最佳生長(zhǎng)溫度、最佳生長(zhǎng)ph、倍增時(shí)間、產(chǎn)物概況和生理群。表1：co利用物種的實(shí)例和其生理特征。從henstra等人,curr.opin.biotechnol.18:200-206(2007)；sipma等人,crit.rev.biotechnol.26:41-65(2006))改編。被考慮利用合成氣的一種有機(jī)體類型是嗜熱產(chǎn)乙酸菌，因?yàn)槠淠苣褪芨哌_(dá)72℃的溫度，這會(huì)減少污染問(wèn)題并降低與經(jīng)由蒸餾分離例如丁醇等產(chǎn)物相關(guān)的加熱成本。然而，尚未證實(shí)嗜熱細(xì)菌可從合成氣產(chǎn)生醇，其主要產(chǎn)物為氫氣、乙酸和/或h2s。產(chǎn)乙酸嗜熱細(xì)菌的倍增時(shí)間也比嗜溫產(chǎn)乙酸菌要長(zhǎng)。因此，最初的研究是集中于用嗜溫產(chǎn)乙酸菌產(chǎn)生例如丁醇等期望產(chǎn)物，因?yàn)檫@些有機(jī)體具有最快的倍增時(shí)間且已經(jīng)顯示可從合成氣產(chǎn)生醇類。最初的表征是對(duì)楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌進(jìn)行。在所有的合成氣利用型有機(jī)體中，楊氏梭菌具有關(guān)于其代謝能力和最佳發(fā)酵條件的豐富知識(shí)體系。嗜羧酸梭菌已顯示利用合成氣生長(zhǎng)期間可天然產(chǎn)生少量的丁醇(henstra等人,curr.opin.biotechnol.18:200-206(2007))。一些示例性合成氣利用型有機(jī)體的代謝途徑是已知的。圖1和2顯示兩種利用合成氣的示例性途徑。例如楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌等產(chǎn)乙酸菌可利用從己糖到一氧化碳的范圍內(nèi)的多種碳源生長(zhǎng)。例如葡萄糖等己糖首先經(jīng)由embden-meyerhof-parnas(emp)糖酵解代謝為丙酮酸，其接著經(jīng)由丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶轉(zhuǎn)化為乙酰-coa。乙酰-coa可用于組建生物質(zhì)前體或可轉(zhuǎn)化為乙酸，其經(jīng)由乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶產(chǎn)生能量。葡萄糖至乙酸、能量和還原當(dāng)量的總體轉(zhuǎn)化是：c6h12o6+4adp+4pi→2ch3cooh+2co2+4atp+8[h]產(chǎn)乙酸菌甚至從葡萄糖中提取更多的能量供應(yīng)到乙酸轉(zhuǎn)化，同時(shí)也通過(guò)進(jìn)一步經(jīng)由wood-ljungdahl途徑將co2轉(zhuǎn)化為乙酸來(lái)維持氧化還原平衡。2co2+8[h]+nadp+npi→ch3cooh+natp以上等式中的系數(shù)n表示這種轉(zhuǎn)化是產(chǎn)生能量的過(guò)程，因?yàn)樵S多產(chǎn)乙酸菌可在co2存在下經(jīng)由wood-ljungdahl途徑生長(zhǎng)，甚至在沒(méi)有葡萄糖的情況下也可生長(zhǎng)，只要存在氫以便供應(yīng)必需的還原當(dāng)量即可。2co2+4h2+nadp+npi→ch3cooh+2h2o+natp圖3所說(shuō)明的wood-ljungdahl途徑與na+或h+離子梯度的產(chǎn)生偶聯(lián)，所述離子梯度可分別經(jīng)由na+或h+依賴性atp合成酶產(chǎn)生atp(muller,appl.environ.microbiol.69:6345-6353(2003))?；谶@些已知的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)乙酸菌也可具有利用co作為唯一碳源和能源的能力。特定來(lái)說(shuō)，co可經(jīng)氧化以產(chǎn)生還原當(dāng)量和co2，或可被直接同化成乙酰-coa，其隨后轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)或乙酸。4co+2h2o→ch3cooh+2co2然而，當(dāng)存在足夠的氫以滿足還原當(dāng)量的需求時(shí)，甚至可獲得更高的乙酸產(chǎn)率。2co+2h2→ch3cooh根據(jù)圖3，經(jīng)由乙酰-coa產(chǎn)生乙酸時(shí)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)atp分子，而從乙酰-coa產(chǎn)生乙醇時(shí)則不會(huì)產(chǎn)生atp分子且需要兩個(gè)還原當(dāng)量。因此不預(yù)期從合成氣產(chǎn)生乙醇會(huì)在無(wú)乙酸產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生足夠用于細(xì)胞生長(zhǎng)的能量。然而，在某些條件下，楊氏梭菌主要從合成氣產(chǎn)生乙醇(klasson等人,fuel72:1673-1678(1993))，表明以下途徑的一些組合實(shí)際上不產(chǎn)生足以支持細(xì)胞生長(zhǎng)的能量。2co2+6h2→ch3ch2oh+3h2o6co+3h2o→ch3ch2oh+4co22co+4h2→ch3ch2oh+h2o例如深紅紅螺菌等產(chǎn)氫細(xì)菌也可從co和水轉(zhuǎn)化為氫氣的過(guò)程產(chǎn)生能量(參見(jiàn)圖3)(sipma等人,crit.rev.biotechnol.26:41-65(2006))。關(guān)鍵機(jī)制是能量轉(zhuǎn)換氫化酶(ech)和co脫氫酶的協(xié)同作用。co脫氫酶從co供應(yīng)電子，其隨后通過(guò)ech將質(zhì)子還原為h2，ech的活性與產(chǎn)生能量的質(zhì)子轉(zhuǎn)移偶聯(lián)。最終結(jié)果是經(jīng)由水煤氣變換反應(yīng)產(chǎn)生能量。合成氣發(fā)酵的產(chǎn)物概況是通過(guò)選擇有機(jī)體和實(shí)驗(yàn)條件來(lái)確定。舉例來(lái)說(shuō)，楊氏梭菌產(chǎn)生乙醇與乙酸的混合物(klasson等人,fuel72:1673-1678(1993)；gaddy和clausen,美國(guó)專利第5,173,429號(hào))，而嗜羧酸梭菌產(chǎn)生乙醇、乙酸、丁醇和丁酸的混合物(liou等人,int.j.syst.evol.microbiol.55(pt5):2085-2091(2005))。已經(jīng)在楊氏梭菌中報(bào)導(dǎo)了分別高達(dá)26.8g/l和12.4g/l的乙酸和生物質(zhì)濃度以及低于1g/l的乙醇濃度(gaddy,美國(guó)專利第5,807,722、6,136,5776,340,581號(hào))。然而，通過(guò)在梭菌中相對(duì)于酸產(chǎn)生而增加溶劑形成的傳統(tǒng)方法，例如限制營(yíng)養(yǎng)物、改變培養(yǎng)基、降低ph、添加還原劑等，所述產(chǎn)物反應(yīng)可朝向增加乙醇形成的方向移動(dòng)。已經(jīng)描述了產(chǎn)物曲線對(duì)許多條件的敏感性，例如泛酸鈣限制、鈷限制、h2供應(yīng)過(guò)多、co供應(yīng)過(guò)度、乙酸調(diào)節(jié)等(gaddy等人,美國(guó)專利第7,285,402號(hào))。在針對(duì)乙醇產(chǎn)生優(yōu)化的條件下，在無(wú)細(xì)胞再循環(huán)的情況下，在楊氏梭菌中展示了分別為33.0g/l、4.0g/l和2.7g/l的乙醇、乙酸和細(xì)胞濃度。最大乙醇生產(chǎn)率在21g/l/天(無(wú)細(xì)胞再循環(huán))到39g/l/天(存在細(xì)胞再循環(huán))的范圍內(nèi)。也可測(cè)定合成氣發(fā)酵對(duì)抑制劑的敏感性。為了產(chǎn)生特定產(chǎn)物而對(duì)嗜羧酸梭菌的發(fā)酵條件(liou等人,int.j.syst.evol.microbiol.55(pt5):2085-2091(2005))所作的優(yōu)化工作報(bào)導(dǎo)較少。然而，許多最新研究已經(jīng)集中于用合成氣抑制劑來(lái)抑制嗜羧酸梭菌生長(zhǎng)。特定來(lái)說(shuō)，生物質(zhì)所產(chǎn)生的發(fā)生爐氣體中存在的抑制劑終止嗜羧酸梭菌生長(zhǎng)和h2利用，但在引入僅由co、co2、n2和h2組成的“潔凈”瓶裝氣體時(shí)，生長(zhǎng)可得到恢復(fù)。氣體通過(guò)0.025μm濾器可以使其清潔到足以允許細(xì)胞生長(zhǎng)的程度，但h2利用仍被阻斷(ahmed等人,biomassbioenergy30:665-672(2006))。對(duì)濾器的掃描電子顯微鏡分析表明焦油微粒而非灰分是細(xì)胞休眠的可能原因。潛在的焦油物質(zhì)被鑒別為苯、甲苯、乙苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯和萘。在10-15天內(nèi)用0.2μm濾器處理后，細(xì)胞則能夠適應(yīng)所存在的焦油。無(wú)論濾器尺寸是多少，h2利用都會(huì)中斷，表明抑制氫化酶的組分無(wú)法被過(guò)濾。這種化合物隨后被鑒別為一氧化氮。no在≥60ppm的含量下會(huì)抑制氫化酶(ahmed和lewis,biotechnol.bioeng.97:1080-1086(2007))?？蓤?zhí)行類似研究以確定用于在特定有機(jī)體中利用合成氣以產(chǎn)生期望產(chǎn)物的適當(dāng)條件。在一示例性實(shí)施方案中，假設(shè)退出氣化爐的合成氣是通過(guò)旋風(fēng)分離器、冷凝塔、洗滌器和0.2μm濾器，類似于先前所述的用于柳枝稷氣化的系統(tǒng)(datar等人,biotechnol.bioeng.86:587-594(2004)；ahmed等人,biomassbioenergy30:665-672(2006))。如先前所建議，使用與吹空氣氣化相反的吹氧氣化，使得可獲得低于40ppm的no含量(ahmed和lewis,biotechnol.bioeng.97:1080-1086(2007))。此外，對(duì)楊氏梭菌的研究揭示了低于2.7％的h2s含量沒(méi)有抑制性(klasson等人,fuel72:1673-1678(1993))，甚至當(dāng)細(xì)胞預(yù)先未經(jīng)適應(yīng)處理時(shí)也是如此，且預(yù)期含量低于從生物質(zhì)乃至煤氣化獲得的合成氣中的含量。此外，可經(jīng)由進(jìn)化或適應(yīng)來(lái)產(chǎn)生對(duì)焦油微粒的耐受性(ahmed等人,biomassbioenergy30:665-67.(2006))。實(shí)施例ii設(shè)計(jì)和建模用于利用合成氣的微生物菌株本實(shí)施例描述用于從合成氣產(chǎn)生期望產(chǎn)物的示例性微生物菌株的設(shè)計(jì)。最初的研究是利用楊氏梭菌、嗜羧酸梭菌和深紅紅螺菌的基因組層面模型來(lái)設(shè)計(jì)能利用合成氣作為碳源的微生物菌株。使用代謝模型和模擬算法開(kāi)發(fā)利用合成氣的菌株。利用期望微生物的基因組序列以及密切相關(guān)物種的序列來(lái)構(gòu)建目標(biāo)有機(jī)體的基因組層面的代謝模型。為了推動(dòng)這種方法，genomatica已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一種綜合方法，以便基于與現(xiàn)有的人工創(chuàng)建的高質(zhì)量代謝模型的詳盡序列對(duì)比，自動(dòng)創(chuàng)建代謝網(wǎng)絡(luò)的初稿。接下來(lái)，人工核查自動(dòng)產(chǎn)生的基因-蛋白質(zhì)-反應(yīng)(gpr)指派(參見(jiàn)圖2)，且在genomatica的專利模型構(gòu)建和模擬平臺(tái)simphenytm內(nèi)分類詳細(xì)記錄以確保這些記錄盡可能的透明。為了產(chǎn)生作為示例性產(chǎn)物的丁醇，在不能天然產(chǎn)生丁醇的那些有機(jī)體(例如楊氏梭菌和深紅紅螺菌)中表達(dá)丁醇途徑中的酶。使用基于約束的建模方法詢問(wèn)代謝模型(schilling等人,biotechnol.prog.15:288-295(1999)；edwards等人,environ.microbiol.4:133-40(2002)；varmaandpalsson,biotechnol.12:994-998(1994)；patil等人,curr.opin.biotechnol.15:64-69(2004))。簡(jiǎn)言之，基于連續(xù)施加管理性物理化學(xué)約束，例如化學(xué)計(jì)量、熱力學(xué)、容量和調(diào)節(jié)約束，基于約束的方法縮窄有機(jī)體可顯示的可能表型的范圍，而不是試圖精確計(jì)算和預(yù)測(cè)有機(jī)體的表型(price等人,trendsbiotechnol.21:162-169(2003)；price等人,nat.rev.microbiol.2:886-897(2004))。因此，代之以計(jì)算精確表型“答案”，即有機(jī)體在指定基因和環(huán)境條件下如何表現(xiàn)，所述方法可確定有機(jī)體可運(yùn)作的表型答案的可行集合。一般來(lái)說(shuō)，基因組層面的基于約束的模型已經(jīng)顯示可用于預(yù)測(cè)若干種生理特性(例如生長(zhǎng)和副產(chǎn)物分泌模式)(edwards和palsson,proc.natl.acad.sci.usa97:5528-5533(2000)；varma等人,appl.environ.microbiol.59:2465-2473(1993)；varma和palsson,applenvironmicrobiol,60:3724-3731(1994)；edwards等人,nat.biotechnol.19:125-130(2001))，確定底物利用的范圍(edwards和palsson,上文,2000)，確定用于生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基(schilling等人,jbacteriol.184:4582-4593(2002))，預(yù)測(cè)適應(yīng)進(jìn)化的結(jié)果(ibarra等人,nature420:186-189(2002))，計(jì)算理論產(chǎn)物產(chǎn)率(varma等人,biotechnol.bioengineer.42:59-73(1993))，預(yù)測(cè)基因剔除表型(edwards和palsson,bmcbioinformatics1:1(2000)；segre等人,proc.natl.acad.sci.usa99:15112-15117(2002)；shlomi等人,proc.natl.acad.sci.usa102:7695-7700(2005))和比較不同有機(jī)體的代謝能力(forster等人,genomeres.13:244-253(2003))?；谶@些預(yù)測(cè)能力，所述模型可用于表征工業(yè)微生物在實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵條件下的代謝表現(xiàn)?；诩s束的方法在其通常用于定位旨在改進(jìn)菌株性能的成功基因操作的這一點(diǎn)上已經(jīng)很成熟(bro等人,metab.eng.8:102-111(2006)；alper等人,nat.biotechnol.23:612-616(2005)；alper等人,metab.eng.7:155-164(2005)；fong等人,biotechnol.bioeng.91:643-648(2005)；park等人,proc.natl.acad.sci.usa104:7797-7802(2007))。繼續(xù)監(jiān)測(cè)特征以便實(shí)施條件的進(jìn)一步優(yōu)化?？赏ㄟ^(guò)確定基因剔除以增強(qiáng)期望產(chǎn)物的產(chǎn)生，包括期望產(chǎn)物(例如丁醇)的生長(zhǎng)偶聯(lián)型生產(chǎn)，對(duì)有機(jī)體進(jìn)行額外優(yōu)化(參見(jiàn)實(shí)施例v)。楊氏梭菌目前可將co、co2和h2的混合物轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇，而嗜羧酸梭菌則產(chǎn)生乙酸、乙醇、丁酸和丁醇的混合物。深紅紅螺菌不會(huì)天然產(chǎn)生醇類，但已顯示可積累高含量的聚-β-羥基鏈烷酸(pha)。建模分析允許預(yù)測(cè)使生物催化劑有機(jī)體的代謝朝向更有效產(chǎn)生期望產(chǎn)物(例如丁醇)的方向移動(dòng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。建模也指向旨在驅(qū)動(dòng)通過(guò)期望產(chǎn)生途徑(例如丁醇產(chǎn)生)的代謝通量的代謝操作。一種建模方法是二層優(yōu)化方法optknock(burgard等人,biotechnol.bioengineer.84:647-657(2003))，其用于選擇共同導(dǎo)致期望產(chǎn)物(例如丁醇)的生長(zhǎng)偶聯(lián)型生產(chǎn)的基因剔除。由于網(wǎng)絡(luò)化學(xué)計(jì)量，迫使用基因剔除策略設(shè)計(jì)的菌株產(chǎn)生高含量的期望產(chǎn)物(例如丁醇)以供有效生長(zhǎng)，因?yàn)樗衅渌纳L(zhǎng)選擇都被移除了。所述菌株是自身優(yōu)化型且穩(wěn)定的。因此，即使在面對(duì)高生長(zhǎng)選擇壓力的情況下，所述菌株典型地仍然維持或改良生產(chǎn)水平，使得其適合于分批或連續(xù)生物工藝以及進(jìn)化工程。設(shè)計(jì)若干種候選菌株且對(duì)產(chǎn)生條件進(jìn)行優(yōu)化。與使用原始過(guò)程參數(shù)的對(duì)照發(fā)酵一起，一式三份測(cè)試發(fā)酵條件。使用來(lái)自測(cè)試發(fā)酵的數(shù)據(jù)，可執(zhí)行模擬以評(píng)定與預(yù)測(cè)結(jié)果相比，由過(guò)程變化所致的代謝變化。如果生產(chǎn)率顯著達(dá)不到預(yù)期值，那么使用這種新知識(shí)執(zhí)行進(jìn)一步模擬以供設(shè)計(jì)過(guò)程的二次迭代，以便優(yōu)化菌株。實(shí)施例iii開(kāi)發(fā)用于目標(biāo)有機(jī)體的基因工具本實(shí)施例描述用于目標(biāo)有機(jī)體的基因操作和工程的工具的開(kāi)發(fā)。在用于利用合成氣的候選菌株中開(kāi)發(fā)基因系統(tǒng)。具體地說(shuō)，開(kāi)發(fā)用于楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌的基因系統(tǒng)。也測(cè)試深紅紅螺菌中的基因轉(zhuǎn)化。測(cè)試抗生素抗性以確定用于篩選期望基因元件的潛在標(biāo)記。舉例來(lái)說(shuō)，許多梭菌對(duì)紅霉素和氯霉素敏感。使用熟知方法開(kāi)發(fā)dna轉(zhuǎn)移方法，所述熟知方法包括(但不限于)電穿孔、接合或超聲波轉(zhuǎn)化。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的若干種表達(dá)載體、尤其是丙酮丁醇梭菌中所用的載體執(zhí)行其它測(cè)試，以便測(cè)定其在楊氏梭菌和/或嗜羧酸梭菌中表達(dá)期望基因元件的有效性?？赏ㄟ^(guò)用天然楊氏梭菌或嗜羧酸梭菌啟動(dòng)子替換載體啟動(dòng)子來(lái)開(kāi)發(fā)其它載體。此外，測(cè)試用于基因操作的若干種自殺質(zhì)粒，包括丙酮丁醇梭菌和解纖維梭菌(c.cellulolyticum)的自殺質(zhì)粒。也測(cè)試針對(duì)其它梭菌開(kāi)發(fā)的反義rna抑制的基因剔除技術(shù)?？色@得用于嗜溫物種解纖維梭菌(clostridiumcellulolyticum)和丙酮丁醇梭菌的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和反義rna抑制工具。解纖維梭菌是纖維素降解的模型系統(tǒng)(desvaux,femsmicrobiolrev.741-764(2005))，而丙酮丁醇梭菌產(chǎn)生例如丁醇等溶劑的能力已得到充分表征(durre,biotechnol.j.2:1525-1534(2007))。值得注意的是，兩種物種都能產(chǎn)生乙醇和氫氣作為最終產(chǎn)物。因此，從這兩種菌株獲得的知識(shí)對(duì)于其它產(chǎn)乙醇和/或氫氣的梭菌物種具有指導(dǎo)意義。已經(jīng)開(kāi)始解纖維梭菌中的定點(diǎn)誘變研究，且其可類似地用于其它候選有機(jī)體。這些研究的結(jié)果允許所產(chǎn)生的突變體的表型表征以及楊氏梭菌和/或嗜羧酸梭菌的基因工程。根據(jù)需要進(jìn)行其它優(yōu)化，以用不同的方法、質(zhì)粒和條件開(kāi)發(fā)基因系統(tǒng)從而獲得最佳結(jié)果(lynd等人,microbiol.mol.biol.rev.66:506-577(2002))。更詳細(xì)地說(shuō)，表征楊氏梭菌和/或嗜羧酸梭菌的抗生素抗性能力?；蛳到y(tǒng)開(kāi)發(fā)中的重要步驟是確定目標(biāo)菌株的天然抗生素抗性特征。紅霉素和氯霉素是兩種抗生素，具有已顯示在丙酮丁醇梭菌和解纖維梭菌的質(zhì)粒上發(fā)揮功能的抗性標(biāo)記(kashket和cao,appl.environ.microbiol.59:4198-4202(1993)；green和bennett,biotechnol.bioeng.58:215-221(1998))。然而，其通常不可用于常見(jiàn)自殺質(zhì)粒，所述自殺質(zhì)粒通常含有氨芐西林、慶大霉素、利福平、卡那霉素和四環(huán)素的抗生素標(biāo)記。為了確定抗生素敏感性，使楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌在厭氧培養(yǎng)室內(nèi)在確定成分培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(ahmed和lewis,biotechnol.bioeng.97:1080-1086(2007)；younesi等人,bioresour.technol.6月18日,2007)。以1μg/ml到500μg/ml的梯度濃度添加上文所述的常規(guī)抗生素。使用例如typefp-1100-cbioscreenc機(jī)器(thermolabsystems；walthamma)等儀器控制生長(zhǎng)溫度在37℃且以不同間隔自動(dòng)測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)的光學(xué)密度。所有的生理研究是重復(fù)進(jìn)行，例如一式三份，以便可計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。此生長(zhǎng)數(shù)據(jù)表明楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌對(duì)所測(cè)試的抗生素具有敏感性。抑制菌株生長(zhǎng)的抗生素用于進(jìn)一步研究中。更詳細(xì)地說(shuō)，開(kāi)發(fā)dna轉(zhuǎn)移方法和基因表達(dá)系統(tǒng)以提供用于基因工程的簡(jiǎn)單且有效的dna傳遞方法。用于細(xì)菌dna轉(zhuǎn)移的方法包括接合、電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和超聲波轉(zhuǎn)化。其中，電穿孔和接合先前已在若干梭菌物種中得到證實(shí)(jennert等人,microbiol.146:3071-3080(2000)；tardif等人,j.ind.microbiol.biotechnol.27:271-274(2001)；tyurin等人,j.appl.microbiol.88:220-227(2000)；tyurin等人,appl.environ.microbiol.70:883-890(2004))。超聲波轉(zhuǎn)化是一種便利且有效的方法，其對(duì)革蘭氏陰性菌提供高轉(zhuǎn)化效率(>106cfu/μgdna)(song等人,nucl.acidsres.35:e129(2007))且同樣可在革蘭氏陽(yáng)性菌中測(cè)試。測(cè)試電穿孔、超聲波轉(zhuǎn)化和接合對(duì)楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌的轉(zhuǎn)化效率。測(cè)試來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌的具有不同復(fù)制子的各種質(zhì)粒(例如pip404、pamβ1和pim13)。根據(jù)需要，基于抗生素抗性測(cè)試，使用亞克隆以合適的抗生素抗性基因盒置換現(xiàn)有質(zhì)粒的抗生素抗性基因盒。使用標(biāo)準(zhǔn)分子亞克隆技術(shù)(包括限制性酶切、t4連接酶連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行工程改造(sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanualcoldspringharborlaboratorypress(1989))。根據(jù)許多其它梭菌物種的需要，這些質(zhì)粒在dna傳遞前經(jīng)甲基化以防止其被宿主細(xì)菌降解。對(duì)于電穿孔和接合，首先測(cè)試解纖維梭菌和丙酮丁醇梭菌的現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方案。變動(dòng)例如電穿孔設(shè)置、回收時(shí)間和電穿孔緩沖液中的ca2+和mg2+濃度等參數(shù)以便優(yōu)化轉(zhuǎn)化效率。對(duì)于超聲波轉(zhuǎn)化，在先前所述(song等人,上文,2007))的低頻超聲波(例如40khz)和長(zhǎng)回收時(shí)間條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一旦對(duì)某些質(zhì)粒確立了有效的dna轉(zhuǎn)移方案，就可對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行工程改造以并入天然楊氏梭菌或嗜羧酸梭菌啟動(dòng)子，隨后并入多克隆位點(diǎn)，從而產(chǎn)生表達(dá)載體。預(yù)期丙酮丁醇梭菌的現(xiàn)有表達(dá)載體，例如psos95和pimp1，很可能也在楊氏梭菌或嗜羧酸梭菌中工作而不需要改變啟動(dòng)子，因此這些質(zhì)?？捎糜诔跗跍y(cè)試。為了開(kāi)發(fā)基因破壞方法，根據(jù)自殺質(zhì)粒作為楊氏梭菌和/或嗜羧酸梭菌的自殺質(zhì)粒的適用性，篩檢出若干種自殺質(zhì)粒，例如pknock、pds3.0、pspuc和pbluescriptskii。如上文所討論，使用現(xiàn)有的抗生素抗性基因盒，或用合適的抗生素抗性基因盒將其替換。將選定靶基因的dna片段亞克隆到適當(dāng)?shù)淖詺①|(zhì)粒中。被選定用作初始靶標(biāo)的基因是編碼負(fù)責(zé)乙醇生產(chǎn)的醇脫氫酶的基因。之所以選擇這些基因是因?yàn)槠鋵?dǎo)致形成副產(chǎn)物，很可能被鑒別為產(chǎn)丁醇菌株的破壞靶標(biāo)，且提供通過(guò)分析發(fā)酵液中的乙醇進(jìn)行篩選的簡(jiǎn)單篩檢法。因?yàn)槭若人崴缶械拇济摎涿妇哂袑拸V的底物特異性，所以如果這些酶的缺失除了降低乙醇產(chǎn)量外還會(huì)降低丁醇產(chǎn)量，那么可與其它丁醇途徑基因一起克隆促進(jìn)丁醇形成超過(guò)乙醇形成的醇脫氫酶(例如丙酮丁醇梭菌的adhe2)(atsumi等人,metab.eng.sep14,2007)以構(gòu)建丁醇途徑。工程改造的自殺質(zhì)粒經(jīng)甲基化且轉(zhuǎn)移到楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌中。在含有適當(dāng)抗生素的固體培養(yǎng)基上篩選克隆。使用經(jīng)破壞基因組區(qū)域的pcr擴(kuò)增和隨后測(cè)序、southern印跡技術(shù)和生理學(xué)研究來(lái)校驗(yàn)基因組中被靶向基因的正確破壞。表達(dá)系統(tǒng)也可用作基因破壞的替代方案以表達(dá)靶基因的反義rna，其將抑制但不會(huì)完全終止靶基因的基因表達(dá)。因此，反義rna系統(tǒng)充當(dāng)期望基因的基因剔除的便利方法。實(shí)施例iv深紅紅螺菌的遺傳評(píng)定本實(shí)施例描述針對(duì)深紅紅螺菌開(kāi)發(fā)基因工具，深紅紅螺菌是利用合成氣的有機(jī)體。深紅紅螺菌是一種革蘭氏陰性的紫色非硫細(xì)菌，其在厭氧條件下氧化co(kerby等人,j.bacteriol.177:2241-2244(1995)；kerby等人,j.bacteriol.174:5284-5294(1992))。深紅紅螺菌具有ni-fe-sco脫氫酶(codh)，其催化co的氧化，這與氫氣形成相偶聯(lián)(ensign和ludden,j.biol.chem.1991.266:18395-18403(1991))。鑒于其co氧化能力和固定co2的能力，深紅紅螺菌能在黑暗中利用合成氣有效地生長(zhǎng)(do等人,biotechnol.bioeng.97:279-286(2007))。此外，已顯示在利用合成氣生長(zhǎng)的過(guò)程中，至多34％的總細(xì)胞碳以聚-β-羥基鏈烷酸(pha)的形式被儲(chǔ)存起來(lái)，所述pha主要由β-羥基丁酸(phb)組成。深紅紅螺菌能有效地引導(dǎo)細(xì)胞碳形成還原4碳化合物，這使其成為用于工程改造期望產(chǎn)物(例如1-丁醇)產(chǎn)生的有吸引力的平臺(tái)。此外，已確立了用于深紅紅螺菌的基因系統(tǒng)，且可使用包括寬宿主范圍rk2衍生物的多種克隆載體(saegesser等人,femsmicrobiol.lett.95:7-12(1992))。利用深紅紅螺菌的另一個(gè)有吸引力的方面在于，導(dǎo)致phb和1-丁醇合成的途徑有很大一部分的重疊(圖5)。因?yàn)橐呀?jīng)針對(duì)phb作為生物降解塑料的用途對(duì)phb合成進(jìn)行了研究，所以可獲得關(guān)于phb途徑調(diào)控和過(guò)度表達(dá)的大量信息(anderson和dawes,microbiol.rev.54:450-472(1990))。與創(chuàng)建如上文所討論操作梭菌菌株所必需的基因工具平行，開(kāi)發(fā)由丙酮丁醇梭菌的形成1-丁醇合成途徑的若干種基因組成的合成操縱子。因?yàn)樯罴t紅螺菌已被測(cè)序并具有易操作的基因系統(tǒng)(saegesser等人,femsmicrobiol.lett.95:7-12(1992))，所以預(yù)期可在選定基因座中進(jìn)行目標(biāo)缺失?？墒褂迷试S產(chǎn)生無(wú)標(biāo)記缺失的寬宿主范圍的位點(diǎn)特異性基因切除系統(tǒng)(hoang等人,gene212:77-86(1998))。因此，有可能在單一菌株中產(chǎn)生多重基因敲除而無(wú)需依賴于多重抗生素篩選。這種方法可通過(guò)缺失phb合成酶基因(其是phb合成的最終步驟)進(jìn)行測(cè)試(hustede等人,femsmicrobiol.lett.72:285-290(1992))。之所以選擇phb合成酶基因是因?yàn)閜hb合成很可能會(huì)與所提到的丁醇途徑競(jìng)爭(zhēng)4碳前體和還原當(dāng)量(圖5)。扭脫甲基桿菌(methylobacteriumextorquens)是一種已知可積累30重量％以上的phb的革蘭氏陰性菌，已報(bào)導(dǎo)其中phb合成酶基因的成功缺失并不會(huì)對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生有害影響(korotkova和lidstrom,j.bacteriol.183:1038-1046(2001))。實(shí)施例v工程改造微生物以從合成氣產(chǎn)生丁醇本實(shí)施例描述工程改造微生物以從合成氣產(chǎn)生丁醇。在最初研究中，使用梭菌菌株、尤其嗜羧酸梭菌針對(duì)丁醇的產(chǎn)生和耐受性來(lái)工程設(shè)計(jì)合成氣的利用。嗜羧酸梭菌已顯示可從合成氣產(chǎn)生丁醇(liou等人,int.j.syst.evol.microbiol.55(pt5):2085-2091(2005))。對(duì)嗜羧酸梭菌進(jìn)行工程改造以提高合成氣利用效率，提高從合成氣產(chǎn)生作為示例性期望產(chǎn)物的丁醇的效率，并且提高產(chǎn)物耐受性從而可獲得較高產(chǎn)率的期望產(chǎn)物。初步代謝網(wǎng)絡(luò)分析已經(jīng)揭示了來(lái)源于木質(zhì)纖維素的合成氣轉(zhuǎn)化為丁醇的理論轉(zhuǎn)化率有利地與糖發(fā)酵法相當(dāng)。合成氣到丁醇：12co+5h2o→8atp+8co2+1c4h10o4co+8h2→4atp+3h2o+1c4h10o4co2+12h2→2atp+7h2o+1c4h10o糖到丁醇：1c6h12o6→2atp+2co2+1h2o+c4h10o1.2c5h10o5→1.7atp+2co2+1h2o+c4h10o鑒于生物質(zhì)氣化可最佳提供1:1的co/h2比，因此產(chǎn)生1摩爾丁醇將需要12摩爾co+h2。重要的是，合成氣通過(guò)發(fā)酵轉(zhuǎn)化為丁醇是產(chǎn)能過(guò)程，因此支持高產(chǎn)物產(chǎn)率下的細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，初期計(jì)算揭示基質(zhì)成本低于等量糖所需的成本。如上文所討論，利用模型和基因工具來(lái)設(shè)計(jì)促進(jìn)丁醇或其它期望產(chǎn)物作為細(xì)胞生長(zhǎng)的專性產(chǎn)物產(chǎn)生的菌株。換言之，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行工程改造，使得丁醇成為利用co生長(zhǎng)的過(guò)程中必需的電子冷阱。構(gòu)建菌株，其可具有基因剔除與適當(dāng)酶的過(guò)度表達(dá)的組合，且可經(jīng)進(jìn)化以獲得改良的產(chǎn)生和生長(zhǎng)條件耐受性。為了構(gòu)建產(chǎn)生丁醇的梭菌菌株，使用上文所論述的基因組分析來(lái)鑒別實(shí)現(xiàn)和/或改進(jìn)楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌中的丁醇產(chǎn)生所必需的生物途徑?？赏ㄟ^(guò)增加合成氣利用途徑和/或丁醇產(chǎn)生途徑蛋白質(zhì)和酶的表達(dá)來(lái)獲得丁醇產(chǎn)生的額外改進(jìn)。為了表達(dá)被靶向生物途徑中的一種或多種基因，使用如上文所述開(kāi)發(fā)的基因表達(dá)載體。如果存在一種以上基因，那么將基因通過(guò)pcr擴(kuò)增且克隆到表達(dá)載體中作為合成操縱子。所得表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌中。使用northern印跡技術(shù)和/或?qū)崟r(shí)pcr或其它合適技術(shù)檢查轉(zhuǎn)錄水平下的基因表達(dá)。為了改進(jìn)丁醇產(chǎn)生，很可能使楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌的一種或多種內(nèi)源基因失活，從而使氧化還原電位朝向丁醇產(chǎn)生的方向前進(jìn)。為此，被靶向基因的內(nèi)部dna片段將通過(guò)pcr擴(kuò)增且克隆到自殺質(zhì)粒中。然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌中，從而導(dǎo)致單一交換組合對(duì)靶基因造成破壞。通過(guò)對(duì)從經(jīng)破壞基因組位點(diǎn)擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和/或southern印跡技術(shù)，或使用其它合適的分析技術(shù)來(lái)證實(shí)正確的破壞。如果存在一種以上被靶向基因，那么對(duì)自殺質(zhì)粒進(jìn)行工程改造以改變抗生素標(biāo)記，使得可在單一菌株中產(chǎn)生多重基因剔除。預(yù)期至多3到6個(gè)基因缺失可能有利于優(yōu)化丁醇產(chǎn)生。為了針對(duì)丁醇產(chǎn)生對(duì)深紅紅螺菌進(jìn)行基因工程，開(kāi)發(fā)由若干種形成丙酮丁醇梭菌中的丁醇合成途徑的基因組成的合成操縱子。允許大腸桿菌中產(chǎn)生丁醇的類似方法最近已有報(bào)導(dǎo)，證實(shí)了革蘭氏陰性有機(jī)體中所述途徑的異源表達(dá)的可能性(atsumi等人,metab.eng.9月14日,2007)。深紅紅螺菌的丁醇產(chǎn)生中的必需基因可在寬宿主范圍的表達(dá)載體上表達(dá)。表達(dá)可使用例如tac啟動(dòng)子等誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)控制。使用融合pcr技術(shù)構(gòu)建合成型4基因操縱子，且其包括負(fù)責(zé)巴豆酸酶、丁酰輔酶a脫氫酶、電子傳遞黃素蛋白和醛/醇脫氫酶活性的基因。已使用融合/裝配pcr技術(shù)構(gòu)建用于異源宿主中的表達(dá)的合成操縱子(craney等人,nucl.acidsres.35:e46(2007)；hill等人,mol.gen.genet.226:41-48(1991))。將丁醇操縱子轉(zhuǎn)化到野生型和phb合成缺陷型深紅紅螺菌菌株中，且如下所述進(jìn)行測(cè)試。也有可能必須靶向一種以上基因以便基于建模研究進(jìn)行移除。這些缺失可使用如上所述的無(wú)標(biāo)記方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)構(gòu)建中間菌株時(shí)，對(duì)其進(jìn)行生理學(xué)測(cè)試以評(píng)估朝向丁醇產(chǎn)生方向的進(jìn)展，以及維持穩(wěn)定生長(zhǎng)和降低的副產(chǎn)物形成的能力。最初在1ml微型反應(yīng)器(例如microreactortechnologies,inc.；mountainview,ca)中對(duì)生長(zhǎng)和丁醇產(chǎn)生執(zhí)行初始篩檢?？煽刂评?4孔板等配制的ph、溫度和氣體組成。作為下一步驟，在溫度和氣體組成受控的培養(yǎng)箱中劇烈振蕩血清瓶。這允許對(duì)氣體頂部空間以及液相進(jìn)行取樣和分析?？赏ㄟ^(guò)氣相色譜(gc/ms)或hplc，使用常規(guī)程序分析產(chǎn)物，例如丁醇、乙醇和有機(jī)酸。如先前所述(najafpour和younesi,enzymemicrob.technol.38:223-228(2006))，使用15％ar作為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)gc聯(lián)合熱導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)來(lái)分析頂部空間中的h2、co和co2。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用h2/co比為1/1的合成氣。氣體組成的影響在發(fā)酵優(yōu)化期間探查。最初，分析具有一種或多種缺失的菌株以相對(duì)于野生型細(xì)胞比較生長(zhǎng)和發(fā)酵概況。多重缺失菌株的生長(zhǎng)有可能很差，同時(shí)不存在丁醇途徑的增強(qiáng)表達(dá)。在野生型宿主中測(cè)試表達(dá)一種或多種丁醇途徑基因或通過(guò)代謝建模鑒別的其它靶標(biāo)的菌株，以評(píng)定增強(qiáng)通過(guò)丁醇途徑的通量并初步評(píng)定哪些步驟可能作為瓶頸的能力。測(cè)試不同的基因順序和(如果可能的話)交替的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)以優(yōu)化合成操縱子構(gòu)建體。將產(chǎn)生最積極結(jié)果的一種或多種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到含有規(guī)定基因缺失的宿主中，并如上所述進(jìn)行測(cè)試。將結(jié)果與模型預(yù)測(cè)比較，以評(píng)定哪里可能存在未預(yù)見(jiàn)到的限制和代謝瓶頸。在進(jìn)行基因工程操作后，可利用適應(yīng)進(jìn)化優(yōu)化期望菌株中的生產(chǎn)?；趯⒍〈籍a(chǎn)生與生長(zhǎng)偶聯(lián)的菌株設(shè)計(jì)，我們應(yīng)用有助于使細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和/或產(chǎn)率得到改良且導(dǎo)致較高丁醇產(chǎn)率的選擇壓力。因此執(zhí)行適應(yīng)進(jìn)化以改進(jìn)生長(zhǎng)和生產(chǎn)特征(fong和palsson,nat.genet.36:1056-1058(2004)；alper等人,science314:1565-1568(2006))?；谶@些結(jié)果，可利用隨后的多輪建模和基因工程進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)?？稍谧詣?dòng)維持細(xì)胞處于長(zhǎng)時(shí)間對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的裝置中執(zhí)行進(jìn)化工程步驟，所述維持是通過(guò)在達(dá)到穩(wěn)定期之前于新鮮培養(yǎng)基中連續(xù)傳代批次培養(yǎng)物來(lái)實(shí)現(xiàn)。特定來(lái)說(shuō)，當(dāng)達(dá)到某一細(xì)胞密度時(shí)，將具有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞的一部分培養(yǎng)基從一個(gè)區(qū)域轉(zhuǎn)移到鄰近區(qū)域，同時(shí)添加新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。通過(guò)自動(dòng)進(jìn)行光學(xué)密度測(cè)量和液體處理，可以高速率執(zhí)行連續(xù)轉(zhuǎn)移，因此接近恒化器用于發(fā)展細(xì)胞適應(yīng)性的效率(dykhuizen,methodsenzymol.224:613-631(1993))。然而，與恒化器將細(xì)胞維持在單一容器中相比，此程序消除了不利地選擇適合于壁生長(zhǎng)的細(xì)胞的可能性(chao和ramsdell,j.gen.microbiol.131:1229-1236(1985)；lynch等人,nat.methods4:87-93(2007))。此外，這種方法允許細(xì)胞維持在確保梭菌生長(zhǎng)所必需的嚴(yán)格厭氧條件的封閉系統(tǒng)中。適應(yīng)進(jìn)化可扮演的另一角色是發(fā)展更耐受丁醇和雜質(zhì)(例如nox和焦油)的菌株。楊氏梭菌和嗜羧酸梭菌的丁醇耐受含量已被公開(kāi)，且這是在用于確定耐受含量的野生型細(xì)胞中測(cè)量的。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)野生型丙酮丁醇梭菌具有約180mm(1.2％w/v)的耐受量(tomas等人,appl.environ.microbiol.69:4951-4965(2003))，且其已被工程改造以實(shí)現(xiàn)高達(dá)2.1％的耐受含量(ezeji等人,chem.rec.4:305-314(2004))。目前有兩種方法主要用于改進(jìn)梭菌的丁醇耐受能力。一種方法涉及經(jīng)由脂質(zhì)含量的合理基因修飾，或通過(guò)例如連續(xù)富集(soucaille等人,curr.microbiol.14:295-299(1987))或隨機(jī)誘變(jain等人,美國(guó)專利第5,192,6731993號(hào))等進(jìn)化方法改變膜的脂質(zhì)組成和流動(dòng)性。然而，耐受量是多種因素的復(fù)變函數(shù)且難以僅僅通過(guò)定向修飾獲得。此外，已有報(bào)導(dǎo)細(xì)胞會(huì)在高丁醇濃度下溶解(vanderwesthuizen等人,appl.environ.microbiol.44:1277-1281(1982))。因此，菌株的優(yōu)化是基于遺傳學(xué)、進(jìn)化和代謝建模的組合。野生型菌株可在連續(xù)增加的丁醇濃度存在下適應(yīng)性地進(jìn)化，以證實(shí)梭菌中的丁醇耐受性可經(jīng)由這個(gè)過(guò)程獲得提高。一個(gè)目標(biāo)是通過(guò)使細(xì)胞進(jìn)化以獲得丁醇耐受性(例如高達(dá)25g/l的濃度)來(lái)優(yōu)化細(xì)胞?？墒褂妙愃瞥绦蛟u(píng)估菌株對(duì)合成氣雜質(zhì)(例如no和焦油中普遍存在的芳香族化合物)的耐受性。用于優(yōu)化生產(chǎn)和/或雜質(zhì)耐受性的適應(yīng)進(jìn)化可依序或同時(shí)進(jìn)行。這種方法也可與丁醇耐受性和膜流動(dòng)性的相關(guān)基因的定向突變整合到一起，以便優(yōu)化適合于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的耐受含量。圖4a和圖4b說(shuō)明示例性合成氣制丁醇方法。圖4a說(shuō)明利用合成氣產(chǎn)生丁醇的方法的方塊流程圖。實(shí)施例vi開(kāi)發(fā)和優(yōu)化合成氣發(fā)酵方法本實(shí)施例描述合成氣發(fā)酵方法的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化。執(zhí)行使用真正合成氣的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模合成氣發(fā)酵，以顯示并優(yōu)化商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的目標(biāo)產(chǎn)率。合成氣發(fā)酵中重要的過(guò)程考慮因素有高生物質(zhì)濃度和良好的氣-液傳質(zhì)(bredwell等人,biotechnol.prog.15:834-844(1999))。co在水中的溶解度稍微小于氧在水中的溶解度。在控制發(fā)酵罐中執(zhí)行連續(xù)充氣發(fā)酵，其中通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法和周期液體取樣進(jìn)行恒定廢氣分析并通過(guò)gc和hplc進(jìn)行分析。液相可以分批模式運(yùn)行。丁醇和副產(chǎn)物形成是作為時(shí)間的函數(shù)來(lái)測(cè)量。雖然最終工業(yè)方法很可能具有連續(xù)液流，但仍可利用分批操作來(lái)研究表征和優(yōu)化的早期階段中的生理學(xué)。這些系統(tǒng)中的所有管道都是玻璃或金屬以便維持厭氧條件。用玻璃料執(zhí)行氣體鼓泡以降低氣泡尺寸并改進(jìn)質(zhì)量傳遞。測(cè)試在約0.1到1vvm(每分鐘的蒸氣體積)范圍內(nèi)的各種鼓泡速率。為了獲得氣體吸收率的精確測(cè)量，執(zhí)行暫時(shí)停止氣流的周期性挑戰(zhàn)，并將氣相組成作為時(shí)間的函數(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)。也開(kāi)發(fā)專門(mén)用于合成氣利用的發(fā)酵系統(tǒng)。雖然用經(jīng)工程改造的有機(jī)體測(cè)試設(shè)計(jì)，但發(fā)酵系統(tǒng)的測(cè)試仍可與菌株開(kāi)發(fā)平行進(jìn)行，其中首先使用野生型有機(jī)體。為了實(shí)現(xiàn)總體目標(biāo)生產(chǎn)率，使用細(xì)胞滯留或再循環(huán)方法。關(guān)于連續(xù)運(yùn)行的所述系統(tǒng)的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是細(xì)胞可能會(huì)進(jìn)化為非生產(chǎn)表型。因?yàn)橛袡C(jī)體是經(jīng)設(shè)計(jì)用于偶聯(lián)生長(zhǎng)來(lái)產(chǎn)生期望產(chǎn)物，所以有機(jī)體在遺傳上是穩(wěn)定的。一種增加微生物濃度的方法是經(jīng)由切向流膜(tangentialflowmembrane)從測(cè)流再循環(huán)細(xì)胞。也可使用重復(fù)分批培養(yǎng)，如先前關(guān)于穆?tīng)柺暇?moorella)的乙酸生產(chǎn)所述(sakais.,y.nakashimada,k.inokuma,m.kita,h.okada,和n.nishio,acetateandethanolproductionfromh2andco2bymoorellasp.usingarepeatedbatchculture.j.biosci.bioeng.99:252-258(2005))。也可使用各種其它方法(bredwell等人,biotechnol.prog.15:834-844(1999)；datar等人,biotechnol.bioeng.86:587-594(2004))。可測(cè)試其它優(yōu)化(例如1.5atm的超壓)以改進(jìn)質(zhì)量傳遞(najafpour和younesi,enzymemicrob.technol.38:223-228(2006))。一旦使用純h2/co作為進(jìn)料獲得了令人滿意的表現(xiàn)，則產(chǎn)生含有可能存在于商業(yè)合成氣中的抑制劑的合成氣混合物。舉例來(lái)說(shuō)，典型雜質(zhì)概況為4.5％ch4、0.1％c2h2、0.35％c2h6、1.4％c2h4和150ppm一氧化氮(datar等人,biotechnol.bioeng.86:587-594(2004))。由例如苯、甲苯、乙苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯和萘等化合物代表的焦油以ppm水平添加以測(cè)試對(duì)生產(chǎn)的任何影響。舉例來(lái)說(shuō)，已經(jīng)顯示40ppm的no對(duì)嗜羧酸梭菌具有抑制性(ahmed和lewis,biotechnol.bioeng.97:1080-1086(2007))。培養(yǎng)物在轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐之前以搖瓶培養(yǎng)法測(cè)試。還測(cè)試這些潛在抑制化合物的不同含量以便定量其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。所述知識(shí)用于制定合成氣純度的各種規(guī)格，這將用于規(guī)模化研究和生產(chǎn)中。如果發(fā)現(xiàn)有任何特定組分難以從用于規(guī)模化的合成氣中減少或移除，那么可如上所述利用適應(yīng)進(jìn)化程序，從而使細(xì)胞耐受一種或多種雜質(zhì)。實(shí)施例vii用于產(chǎn)生合成氣利用型微生物的最小基因集合本實(shí)施例描述如何確定用于產(chǎn)生合成氣利用型微生物的最小基因/蛋白質(zhì)集合，尤其是在無(wú)法天然利用合成氣產(chǎn)生期望產(chǎn)物的微生物中。一般來(lái)說(shuō)，微生物具有產(chǎn)生在生物合成中(例如在甲硫氨酸生產(chǎn)中)作為常見(jiàn)中間物的四氫葉酸和甲基-四氫葉酸(me-thf)的能力。因此，上文所述且在圖1中展示的甲基分支并不是利用合成氣的有機(jī)體的唯一特征。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)me-thf的產(chǎn)生所必需的酶在合成氣利用型有機(jī)體中的活性遠(yuǎn)高于其在不利用合成氣的有機(jī)體中的活性。事實(shí)上，來(lái)自產(chǎn)乙酸菌的四氫葉酸依賴性酶的活性是來(lái)自其它來(lái)源(例如大腸桿菌和真核生物)的所述酶的活性的50到100倍(morton等人,geneticsandmolecularbiologyofanaerobicbacteria,m.sebald編,第28章,第389-406頁(yè),springer-verlage,newyork,ny(1993))。確定基因/蛋白質(zhì)集合以供設(shè)計(jì)可利用合成氣的有機(jī)體的更適當(dāng)且唯一的方法是使用所述途徑的羰基分支(參見(jiàn)圖2)。此分支包含用于以下六種蛋白質(zhì)的基因：鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、一氧化碳脫氫酶(codh)、乙酰-coa合成酶(acs)、乙酰-coa合成酶二硫鍵還原酶和co耐受性氫化酶。因此，這六種基因/蛋白質(zhì)代表了用于賦予能產(chǎn)生乙酰-coa的合成氣利用途徑的一種或多種蛋白質(zhì)的集合。實(shí)施例viii用于產(chǎn)生合成氣利用型微生物的基因集合本實(shí)施例描述用于產(chǎn)生合成氣利用型微生物的示例性基因集合。甲酸脫氫酶.甲酸脫氫酶是一種有兩個(gè)亞單元的含硒代半胱氨酸的蛋白質(zhì)，其催化熱乙酸穆?tīng)柺暇衏o2并入甲酸中的過(guò)程(andreesen和ljungdahl,j.bacteriol.116:867-873(1973)；li等人,j.bacteriol.92:405-412(1966)；yamamoto等人,j.biol.chem.258:1826-1832(1983))?；蜃鵰oth_2312和moth_2313實(shí)際上是負(fù)責(zé)編碼甲酸脫氫酶的α亞單元的一個(gè)基因，而β亞單元?jiǎng)t由moth_2314編碼(pierce等人,environ.microbiol.(2008))。編碼容易發(fā)生co2還原的甲酸脫氫酶活性的另一組基因是由弗氏互營(yíng)桿菌中的sfum_2703到sfum_2706編碼(debok等人,eur.j.biochem.270:2476-2485(2003)；reda等人,proc.natl.acad.sci.us.a.105:10654-10658(2008))。與其熱乙酸穆?tīng)柺暇鷮?duì)應(yīng)物類似，sfum_2705和sfum_2706實(shí)際上也是一個(gè)基因。被假定執(zhí)行相同功能的類似基因集合是在生氫氧化碳嗜熱菌中由chy_0731、chy_0732和chy_0733編碼(wu等人,plosgenet.1:e65(2005))。蛋白genbankid有機(jī)體moth_2312yp_431142熱乙酸穆?tīng)柺暇鷐oth_2313yp_431143熱乙酸穆?tīng)柺暇鷐oth_2314yp_431144熱乙酸穆?tīng)柺暇鷖fum_2703yp_846816.1弗氏互營(yíng)桿菌sfum_2704yp_846817.1弗氏互營(yíng)桿菌sfum_2705yp_846818.1弗氏互營(yíng)桿菌sfum_2706yp_846819.1弗氏互營(yíng)桿菌chy_0731yp_359585.1生氫氧化碳嗜熱菌chy_0732yp_359586.1生氫氧化碳嗜熱菌chy_0733yp_359587.1生氫氧化碳嗜熱菌甲酰四氫葉酸合成酶.甲酰四氫葉酸合成酶消耗1個(gè)atp將甲酸連接到四氫葉酸上。這個(gè)反應(yīng)在熱乙酸穆?tīng)柺暇惺怯蒻oth_0109的基因產(chǎn)物(lovell等人,arch.microbiol149:280-285(1988)；lovell等人,biochemistry29:5687-5694(1990)；o'brien等人,experientia.suppl.26:249-262(1976))、在尿酸梭菌中是由fhs的基因產(chǎn)物(whitehead和rabinowitz,j.bacteriol.167:205-209(1986)；whitehead和rabinowitz,j.bacteriol.170:3255-3261(1988))且在生氫氧化碳嗜熱菌中是由chy_2385的基因產(chǎn)物(wu等人,plosgenet.1:e65(2005))催化。蛋白genbankid有機(jī)體moth_0109yp_428991.1熱乙酸穆?tīng)柺暇鷆hy_2385yp_361182.1生氫氧化碳嗜熱菌fhsp13419.1尿酸梭菌次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶.在熱乙酸穆?tīng)柺暇?、大腸桿菌和生氫氧化碳嗜熱菌中，次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶是由moth_1516、fold和chy_1878的雙功能基因產(chǎn)物分別產(chǎn)生(d'ari和rabinowitz,j.biol.chem.266:23953-23958(1991)；pierce等人,environ.microbiol(2008)；wu等人,plosgenet.1:e65(2005))。蛋白genbankid有機(jī)體moth_1516yp_430368.1熱乙酸穆?tīng)柺暇鷉oldnp_415062.1大腸桿菌chy_1878yp_360698.1生氫氧化碳嗜熱菌亞甲基四氫葉酸還原酶.wood-ljungdahl途徑的甲基分支的最后步驟是由亞甲基四氫葉酸還原酶催化。在熱乙酸穆?tīng)柺暇校雒笇?duì)氧敏感且含有鐵硫簇(clark和ljungdahl,jbiolchem.259:10845-10849(1984))。所述酶在大腸桿菌中是由metf編碼(sheppard等人,j.bacteriol.181:718-725(1999))，且在生氫氧化碳嗜熱菌中是由chy_1233編碼(wu等人,plosgenet.1:e65(2005))。熱乙酸穆?tīng)柺暇蚝推渖鷼溲趸际葻峋鷮?duì)應(yīng)物位于codh/acs基因簇附近，所述基因簇是由假定氫化酶和雜二硫鍵還原酶基因分隔。蛋白genbankid有機(jī)體metfnp_418376.1大腸桿菌chy_1233yp_360071.1生氫氧化碳嗜熱菌乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶(acs/codh)和相關(guān)蛋白.acs/codh是wood-ljungdahl途徑的羰基分支的中心酶。其催化二氧化碳到一氧化碳的可逆還原，以及從一氧化碳、輔酶a和來(lái)自甲基化類咕啉-鐵硫蛋白的甲基獲得乙酰-coa的合成。類咕啉-鐵硫蛋白是由甲基四氫葉酸經(jīng)由甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化。acs/codh在外來(lái)宿主中的表達(dá)涉及引入以下蛋白質(zhì)和其對(duì)應(yīng)活性中的多種，即便不是全部的話。甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(acse)類咕啉鐵硫蛋白(acsd)鎳蛋白裝配蛋白(acsf)鐵氧還蛋白(orf7)乙酰-coa合成酶(acsb和acsc)一氧化碳脫氫酶(acsa)鎳蛋白裝配蛋白(cooc)一氧化碳脫氫酶/乙酰-coa合成酶活性所必需的基因典型地駐留在可作為延伸操縱子的天然基因組的有限區(qū)域中(morton等人,j.biol.chem.266:23824-23828(1991)；ragsdale,crit.rev.biochem.mol.biol.39:165-195(2004)；roberts等人,proc.natl.acad.sci.usa86:32-36(1989))。來(lái)自產(chǎn)乙酸菌熱乙酸穆?tīng)柺暇拇瞬倏v子中的每種基因已在大腸桿菌中克隆并積極地表達(dá)(lu等人,j.biol.chem.268:5605-5614(1993)；morton等人,上文,1991；roberts等人,上文,1989)。這些基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。產(chǎn)氫細(xì)菌生氫氧化碳嗜熱菌可通過(guò)乙酰-coa合成酶利用一氧化碳作為生長(zhǎng)基質(zhì)(wu等人,plosgenet.1:e65.(2005))。在菌株z-2901中，乙酰-coa合成酶復(fù)合物因?yàn)橐拼a突變而缺乏一氧化碳脫氫酶(we等人,上文,2005)，而在菌株dsm6008中，已經(jīng)純化到這種蛋白質(zhì)的功能性未移碼全長(zhǎng)形式(svetlitchnyi等人,proc.natl.acad.sci.usa101:446-451(2004))。來(lái)自菌株z-2901的生氫氧化碳嗜熱菌基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。生氫氧化碳嗜熱菌dsm6008的序列目前無(wú)法從公眾可利用的數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，但可容易地確定所述序列可以獲得。產(chǎn)甲烷古細(xì)菌嗜乙酸甲烷八疊球菌也可利用一氧化氮生長(zhǎng)，展現(xiàn)乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶活性，且同時(shí)產(chǎn)生乙酸和甲酸(lessner等人,proc.natl.acad.sci.usa103:17921-17926(2006))。這種有機(jī)體含有兩組編碼acs/codh活性的基因(rother和metcalf,proc.natl.acad.sci.usa101:16929-16934(2004))。這兩組嗜乙酸甲烷八疊球菌基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。acsc、acsd、acsb、acseps和acsa蛋白通常被稱作產(chǎn)甲烷菌codh/acs的γ、δ、β、ε和α亞單元。例如熱乙酸穆?tīng)柺暇犬a(chǎn)乙酸菌或例如生氫氧化碳嗜熱菌等產(chǎn)氫細(xì)菌中并不存在ε編碼基因的同源物。嗜乙酸甲烷八疊球菌中存在兩種活性codh/acs操縱子的假設(shè)包括：催化性質(zhì)(即km、vmax、kcat)，其促進(jìn)一氧化碳營(yíng)養(yǎng)或解乙酸生長(zhǎng)；或差異基因調(diào)控，其啟動(dòng)各種刺激以誘發(fā)codh/acs表達(dá)(rother等人,arch.microbiol.188:463-472(2007))。在熱乙酸穆?tīng)柺暇蜕鷼溲趸际葻峋?，其它c(diǎn)odh編碼基因位于acs/codh操縱子外部。這些酶提供從一氧化碳到二氧化碳的轉(zhuǎn)化作用中提取電子或還原當(dāng)量的能力。還原當(dāng)量然后傳遞到受體，例如氧化鐵氧還蛋白、nadp+、水或過(guò)氧化氫，以分別形成還原鐵氧還蛋白、nadph、h2或水。在一些情況下，氫化酶編碼基因與codh鄰近。在深紅紅螺菌中，經(jīng)編碼的codh/氫化酶蛋白形成膜結(jié)合酶復(fù)合物，其被提議作為通過(guò)co轉(zhuǎn)化為co2和h2而產(chǎn)生質(zhì)子梯度形式的能量的位點(diǎn)(fox等人,j.bacteriol.178:6200-6208(1996))。生氫氧化碳嗜熱菌的codh-i和其相鄰基因已被提議基于其與深紅紅螺菌codh/氫化酶基因簇的類似性來(lái)催化類似的功能作用(wu等人,plosgenet.1:e65(2005))。也已顯示生氫氧化碳嗜熱菌codh-i在連接于電極時(shí)會(huì)展現(xiàn)強(qiáng)烈的co氧化和co2還原活性(parkin等人,j.am.chem.soc.129:10328-10329(2007))。對(duì)編碼生氫氧化碳嗜熱菌codh-ii和鄰近蛋白coof的基因進(jìn)行克隆和測(cè)序(gonzalez和robb,femsmicrobiol.lett.191:243-247(2000))。所得復(fù)合物是膜結(jié)合的，但codh-ii的細(xì)胞質(zhì)部分顯示可催化nadph的形成，這暗示合成代謝作用(svetlitchnyi等人,j.bacteriol.183:5134-5144(2001))。codh-ii的晶體結(jié)構(gòu)也可獲得(dobbek等人,science293:1281-1285(2001))。示例性codh和氫化酶基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。乙酰-coa合成酶二硫鍵還原酶.在熱乙酸穆?tīng)柺暇?，一組編碼雜二硫鍵還原酶的基因(moth_1194到moth_1196)直接位于上文所述的acs基因簇的下游。此外，與熱乙酸穆?tīng)柺暇粯樱鷼溲趸际葻峋幸唤M直接在acse下游的編碼雜二硫鍵還原酶的基因。氫化酶(hyd).不同于co和甲醇變?yōu)橐阴?coa或乙酸的氧化還原中性轉(zhuǎn)化，以最高的可能產(chǎn)率產(chǎn)生還原程度更高的產(chǎn)物(例如乙醇、丁醇、異丁醇、異丙醇、1,4-丁二醇、琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、4-羥基丁酸、3-羥基丙酸、乳酸、甲基丙烯酸、己二酸和丙烯酸)則需要從co和h2提取額外的還原當(dāng)量(例如參見(jiàn)圖7中的乙醇形成)。特定來(lái)說(shuō)，還原當(dāng)量(例如圖6中的2[h])是通過(guò)co和水經(jīng)由實(shí)施例ii中所述的一氧化碳脫氫酶轉(zhuǎn)化為co2來(lái)獲得，或者直接來(lái)自利用氫的氫化酶將電子從h2轉(zhuǎn)移到受體(例如鐵氧還蛋白、黃素氧還蛋白、fad+、nad+或nadp+)的活性。大腸桿菌和其它腸細(xì)菌天然具有編碼至多4種氫化酶的多種基因(sawers,antonievanleeuwenhoek66:57-88(1994)；sawers等人,j.bacteriol.164:1324-1331(1985)；sawers和boxer,eur.j.biochem.156:265-275(1986)；sawers等人,j.bacteriol.168:398-404(1986))。鑒于酶活性的多樣性，大腸桿菌或另一種宿主有機(jī)體有可能提供足夠的氫化酶活性以便分裂進(jìn)入的分子氫并還原對(duì)應(yīng)受體。大腸桿菌的內(nèi)源氫裂解酶包括氫化酶3、使用鐵氧還蛋白作為受體的膜結(jié)合酶復(fù)合物和也使用鐵氧還蛋白受體的氫化酶4。氫化酶3和4是由hyc和hyf基因簇分別編碼。大腸桿菌中的氫化酶活性也取決于hyp基因的表達(dá)，所述hyp基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)與氫化酶復(fù)合物的裝配有關(guān)(jacobi等人,arch.microbiol.158:444-451(1992)；rangarajan等人,j.bacteriol.190:1447-1458(2008))。如果生產(chǎn)宿主缺乏足夠的內(nèi)源氫化酶活性，那么熱乙酸穆?tīng)柺暇鷼浠甘呛线m的候選物。熱乙酸穆?tīng)柺暇梢詂o2作為獨(dú)有的碳源生長(zhǎng)，表明還原當(dāng)量是從h2提取以允許經(jīng)由wood-ljungdahl途徑的乙酰-coa合成(drake,j.bacteriol.150:702-709(1982)；drake和daniel,res.microbiol.155:869-883(2004)；kellum和drake,j.bacteriol.160:466-469(1984))(參見(jiàn)圖6)。熱乙酸穆?tīng)柺暇哂衼?lái)自大腸桿菌的若干hyp、hyc和hyf基因的同源物。這些基因所編碼的這些蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。此外，熱乙酸穆?tīng)柺暇写嬖谌舾煞N編碼氫化酶和/或雜二硫鍵還原酶功能的基因簇，且其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列也在下文提供。hyp裝配蛋白.熱乙酸穆?tīng)柺暇谢蚺c大腸桿菌hyp基因同源的蛋白質(zhì).氫化酶3.氫化酶4.熱乙酸穆?tīng)柺暇谢蚺c大腸桿菌hyc和/或hyf基因同源的蛋白質(zhì).熱乙酸穆?tīng)柺暇衅渌臍浠妇幋a基因簇.經(jīng)工程改造而具有這些能力且天然也具有回補(bǔ)能力的宿主有機(jī)體(例如大腸桿菌)可能在合適的外部電子受體(例如硝酸鹽)存在下，利用合成氣所產(chǎn)生的乙酰-coa更有效地生長(zhǎng)。這種電子受體是接受來(lái)自于經(jīng)由琥珀酸脫氫酶而形成的還原苯醌的電子所必需的。添加外部電子受體的另一優(yōu)點(diǎn)在于可從乙酰-coa的呼吸作用產(chǎn)生額外的能量用于細(xì)胞生長(zhǎng)、維持和產(chǎn)物形成。替代策略涉及將丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(pfor)工程改造到菌株中以允許在不存在外部電子受體的情況下合成生物質(zhì)前體。丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(pfor).在不存在外部電子受體的情況下，利用合成氣和甲醇的厭氧生長(zhǎng)通過(guò)允許經(jīng)由丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(pfor)合成丙酮酸而賦予宿主有機(jī)體acs/codh活性。來(lái)自非洲脫硫弧菌的pfor已在大腸桿菌中克隆并表達(dá)，從而產(chǎn)生在氧存在下可穩(wěn)定數(shù)天的活性重組酶(pieulle等人,j.bacteriol.179:5684-5692(1997))。氧穩(wěn)定性在pfor中相對(duì)罕見(jiàn)，認(rèn)為其是由非洲脫硫弧菌酶的多肽鏈中的60個(gè)殘基的延伸引起的。熱乙酸穆?tīng)柺暇鷓for也已得到充分表征(menon和ragsdale,biochemistry36:8484-8494(1997))且顯示在自養(yǎng)生長(zhǎng)期間在丙酮酸合成的方向上具有高活性(furdui和ragsdale,j.biol.chem.275:28494-28499(2000))。此外，大腸桿菌具有未被表征的開(kāi)放閱讀框ydbk，其編碼與熱乙酸穆?tīng)柺暇鷓for具有51％同一性的蛋白質(zhì)。丙酮酸氧化還原酶活性的證據(jù)已有描述(blaschkowski等人,eur.j.biochem.123:563-569(1982))。這些示例性pfor酶的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。若干種其它的pfor酶已有描述(ragsdale,chem.rev.103:2333-2346(2003))。本實(shí)施例描述用于工程改造有機(jī)體以從包含co、co2和h2中的至少一種的氣體產(chǎn)生乙酰-coa的示例性基因集合。實(shí)施例ix將合成氣利用途徑工程改造到微生物中本實(shí)施例描述工程改造微生物以使其含有合成氣利用途徑。除了提高具有利用co和/或co2作為碳源的天然能力的微生物(例如梭菌物種)的效率外(實(shí)施例ii、iii和v)，不具有利用co和/或co2的天然能力的微生物也可被工程改造以表達(dá)一種或多種賦予co和/或co2利用途徑的蛋白質(zhì)或酶。一種示例性途徑是wood-ljungdahl途徑，其允許利用co和/或co2作為碳源，從而允許微生物利用合成氣或其它氣態(tài)碳源(參見(jiàn)實(shí)施例i和vii)。在初步研究中，無(wú)法天然利用合成氣的大腸桿菌被用作目標(biāo)有機(jī)體以便引入co和/或co2利用途徑，例如wood-ljungdahl途徑。wood-ljungdahl途徑涉及對(duì)氧敏感的膜結(jié)合蛋白質(zhì)以及在大腸桿菌中天然不存在的特異性輔因子。雖然已經(jīng)將若干種wood-ljungdahl途徑基因克隆到大腸桿菌中，但只有一種酶、即甲基轉(zhuǎn)移酶被發(fā)現(xiàn)可以活性形式表達(dá)(roberts等人,proc.natl.acad.sci.usa86:32-36(1989))。從熱乙酸梭菌純化出羰基分支(參見(jiàn)圖2)途徑基因，這揭示了甲基-四氫葉酸到乙酰-coa的活體外轉(zhuǎn)化研究所必需的最小酶集合(roberts等人,j.bacteriol.174:4667-4676(1992))。初步研究是針對(duì)將wood-ljungdahl途徑、尤其羰基分支(圖2)工程改造到大腸桿菌中，并測(cè)試生長(zhǎng)和從甲基-四氫葉酸和合成氣進(jìn)行的乙酸產(chǎn)生。大腸桿菌提供一種用于開(kāi)發(fā)能利用合成氣或其它氣態(tài)碳源的非天然存在的微生物的良好模型，因?yàn)槠淇蛇M(jìn)行基因操作且已知能夠在厭氧條件下從葡萄糖有效地產(chǎn)生各種產(chǎn)物，例如乙醇、乙酸和琥珀酸。為了產(chǎn)生經(jīng)工程改造而含有wood-ljungdahl途徑的大腸桿菌菌株，使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)(參見(jiàn)例如sambrook,上文,2001；ausubel上文,1999；roberts等人,上文,1989)在大腸桿菌中表達(dá)所述途徑的羰基分支所必需的蛋白質(zhì)和酶的編碼核酸(參見(jiàn)圖2和實(shí)施例vii)。如先前所述，熱乙酸梭菌的乙酰-coa合成中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的編碼基因簇已經(jīng)在大腸桿菌中克隆并表達(dá)(roberts等人,上文,1989)。為了確?；钚缘鞍踪|(zhì)的產(chǎn)生，需要特定地改變條件，例如培養(yǎng)基的金屬組成。鈷酰胺類咕啉/鐵硫蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、一氧化碳脫氫酶(codh)、乙酰-coa合成酶(acs)、乙酰-coa合成酶二硫鍵還原酶和co耐受性氫化酶的編碼基因在大腸桿菌中克隆并表達(dá)，以便引入wood-ljungdahl途徑的羰基分支(關(guān)于wood-ljungdahl途徑基因，也參見(jiàn)ragsdale,criticalrev.biochem.mol.biol.39:165-195(2004))。因?yàn)榇竽c桿菌不能正常地合成鈷胺素或鈷胺素樣輔因子，而這又是鈷酰胺-類咕啉/鐵硫蛋白活性所必需的，所以也可引入所述輔因子，或用于合成必需輔因子的蛋白質(zhì)和酶的編碼基因。可向培養(yǎng)基提供鈷胺素或鈷胺素樣輔因子，但成本可能會(huì)限制這種方法用于規(guī)?；蜕虡I(yè)制造。更好的替代方案是在大腸桿菌菌株中克隆和表達(dá)必需基因，從而表達(dá)鈷胺素必需蛋白質(zhì)。這已通過(guò)來(lái)自鼠傷寒沙門(mén)氏菌(salmonellatyphimurium)的含20個(gè)基因的鈷胺素操縱子轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中并在其中進(jìn)行功能性表達(dá)而得到證實(shí)(raux等人,j.bacteriol.178:753-767(1996))。使用用于確定所引入基因的表達(dá)的常規(guī)分析，例如northern印跡技術(shù)、mrna的pcr擴(kuò)增、免疫印跡技術(shù)，或其它用于確認(rèn)所引入基因的核酸和蛋白質(zhì)表達(dá)的熟知分析，測(cè)試wood-ljungdahl途徑基因的表達(dá)。經(jīng)表達(dá)的酶的酶活性可單獨(dú)測(cè)試，或根據(jù)例如乙酰-coa等產(chǎn)物的產(chǎn)量來(lái)測(cè)試(參見(jiàn)例如roberts等人,上文,1989)。經(jīng)工程改造的大腸桿菌菌株利用co和/或co2作為碳源以便產(chǎn)生乙酰-coa的能力可使用氣相色譜-質(zhì)譜法(gcms)或液相色譜-質(zhì)譜法(lcms)直接分析，或經(jīng)由使用代謝性的放射性或同位素標(biāo)記(例如放射性co或co2)并分析放射性標(biāo)記在乙酰-coa產(chǎn)物中的并入情況或同位素標(biāo)記的co或co2前體的并入情況，以及使用例如質(zhì)譜法(gcms或lcms)或核磁共振光譜法(nmr)等技術(shù)的分析來(lái)分析。在存在或不存在h2的情況下，僅使用co和/或co2作為唯一碳源的大腸桿菌的生長(zhǎng)是另一種針對(duì)全功能途徑的有用測(cè)試。一旦功能性wood-ljungdahl途徑被工程改造到大腸桿菌菌株中，菌株即被優(yōu)化以便有效利用所述途徑?？蓽y(cè)試經(jīng)工程改造的菌株以確定是否任何所引入的基因都以限制速率的水平表達(dá)。根據(jù)需要，可能限制途徑的通量的一種或多種蛋白質(zhì)或酶的增加表達(dá)可用于優(yōu)化途徑的利用以及乙酰-coa的產(chǎn)生。代謝建?？捎糜趦?yōu)化生長(zhǎng)條件(參見(jiàn)實(shí)施例ii)。也可用建模來(lái)設(shè)計(jì)基因剔除，其另外優(yōu)化途徑的利用(參見(jiàn)實(shí)施例ii、iv和v，以及例如美國(guó)專利公開(kāi)案us2002/0012939、us2003/0224363、us2004/0029149、us2004/0072723、us2003/0059792、us2002/0168654和us2004/0009466，和美國(guó)專利第7,127,379號(hào))。建模分析允許預(yù)測(cè)使代謝朝著更有效產(chǎn)生乙酰-coa或其它期望產(chǎn)物的方向移動(dòng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。一種建模方法是二層優(yōu)化方法optknock(burgard等人,biotechnol.bioengineer.84:647-657(2003))，其用于選擇共同導(dǎo)致乙酰-coa或其它期望產(chǎn)物的生長(zhǎng)偶聯(lián)型生產(chǎn)的基因剔除，如下文所論述。由于網(wǎng)絡(luò)化學(xué)計(jì)量，迫使用基因剔除策略設(shè)計(jì)的菌株產(chǎn)生高含量的期望產(chǎn)物以供有效生長(zhǎng)，因?yàn)樗衅渌纳L(zhǎng)選擇都被移除了。所述菌株是自身優(yōu)化型且穩(wěn)定的。因此，即使在面對(duì)高生長(zhǎng)選擇壓力的情況下，所述菌株典型地仍然維持或改良生產(chǎn)水平，使得其適合于分批或連續(xù)生物工藝以及進(jìn)化工程。適應(yīng)進(jìn)化可用于進(jìn)一步優(yōu)化乙酰-coa的生產(chǎn)(參見(jiàn)實(shí)施例v)。因此執(zhí)行適應(yīng)進(jìn)化以改進(jìn)生長(zhǎng)和生產(chǎn)特征(fong和palsson,nat.genet.36:1056-1058(2004)；alper等人,science314:1565-1568(2006))?；谶@些結(jié)果，隨后多輪的建模、基因工程和適應(yīng)進(jìn)化可用于進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)和酶對(duì)合成氣或合成氣中雜質(zhì)的耐受性。一旦經(jīng)工程改造的微生物菌株被優(yōu)化以便利用wood-ljungdahl途徑，就可使用熟知方法且如例如實(shí)施例vi中所述對(duì)發(fā)酵方法進(jìn)行優(yōu)化以增加產(chǎn)率。舉例來(lái)說(shuō)，在0.5g/l/h下從合成氣產(chǎn)生20g/l乙酸的生產(chǎn)力水平將代表理想的生產(chǎn)范圍，可針對(duì)所述生產(chǎn)范圍進(jìn)一步優(yōu)化菌株以有效地利用所述途徑以及優(yōu)化發(fā)酵條件，從而實(shí)現(xiàn)期望生產(chǎn)水平。雖然通過(guò)引入羰基分支以對(duì)經(jīng)工程改造的微生物菌株賦予利用co和/或co2的能力進(jìn)行例證，但也可使用類似方法向大腸桿菌引入用于產(chǎn)生甲基-四氫葉酸的酶。如上文實(shí)施例vii中所述，大腸桿菌具有產(chǎn)生甲基-四氫葉酸的能力，但來(lái)自產(chǎn)乙酸菌的thf依賴性酶具有特異性活性(morton等人,上文,1993)。使用上文所述的方法引入wood-ljungdahl途徑的羰基分支，同時(shí)使用類似技術(shù)將甲基分支酶引入到大腸桿菌中。引入編碼鐵氧還蛋白氧化還原酶、甲酸脫氫酶、甲酰四氫葉酸合成酶、次甲基四氫葉酸環(huán)化水解酶、亞甲基四氫葉酸脫氫酶和亞甲基四氫葉酸還原酶中的一種或多種的基因(參見(jiàn)圖1)。在這種情況下，引入所述基因是為了增加內(nèi)源酶活性和/或增加利用co和/或co2產(chǎn)生甲基-四氫葉酸的效率。如上文所述執(zhí)行途徑和發(fā)酵條件的優(yōu)化。此外，wood-ljungdahl途徑的羰基和甲基分支皆可引入到同一微生物中。在所述經(jīng)工程改造的有機(jī)體中，從co和/或co2產(chǎn)生甲基-四氫葉酸的產(chǎn)量增加可用于進(jìn)一步增加經(jīng)工程改造以便使用wood-ljungdahl途徑的羰基分支利用co和/或co2的有機(jī)體中的乙酰-coa產(chǎn)生(參見(jiàn)圖3和6)。乙酰-coa可用作其它期望產(chǎn)物的前體。一旦產(chǎn)生了產(chǎn)乙酰-coa微生物，則可向微生物中引入其它基因以利用乙酰-coa作為前體，從作為碳源的co和/或co2產(chǎn)生其它期望產(chǎn)物。舉例來(lái)說(shuō)，可引入用于產(chǎn)生丁醇的酶(參見(jiàn)圖3和實(shí)施例v)。用于從乙酰-coa開(kāi)始的丁醇途徑的代表性基因有：乙酰-coa酰基轉(zhuǎn)移酶atob；乙酰-coa硫解酶thl；3-羥基丁酰-coa脫氫酶hbd；巴豆酸酶crt；丁酰輔酶a脫氫酶bcd；電子傳遞黃素蛋白etf；醛/醇脫氫酶adhe2(參見(jiàn)atsumi等人,metabolicengineering,9月14日,2007)。美國(guó)申請(qǐng)案第11/891,602號(hào)(2007年8月10日申請(qǐng))和wo/2008/115840例如描述用于產(chǎn)生其它期望產(chǎn)物(包括檸檬酸、4-羥基丁酸和1,4-丁二醇)的代謝途徑，且可類似地引入用于所述途徑的酶，例如琥珀酰輔酶a連接酶、琥珀酰輔酶a:輔酶a轉(zhuǎn)移酶、琥珀酸半醛脫氫酶、4-羥基丁酸脫氫酶、谷氨酸:琥珀酸半醛轉(zhuǎn)氨酶、4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)移酶、輔酶a依賴性醛脫氫酶、醇脫氫酶等。乙酰-coa直接進(jìn)入所有細(xì)胞的tca循環(huán)，且琥珀酸是tca循環(huán)的中間物。因此，賦予能利用從co和/或co2產(chǎn)生的乙酰-coa的途徑的其它酶可如上所述經(jīng)工程改造和優(yōu)化，以從經(jīng)工程改造的微生物產(chǎn)生期望產(chǎn)物。實(shí)施例x用于從合成氣和甲醇產(chǎn)生乙酰-coa的途徑本實(shí)施例描述利用合成氣和甲醇產(chǎn)生乙酰-coa的示例性途徑。能夠從合成氣和甲醇產(chǎn)生乙酰-coa的有機(jī)體具有兩種關(guān)鍵能力，其描繪于圖7中。一種能力是功能性甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，其允許從甲醇和thf產(chǎn)生5-甲基-四氫葉酸(me-thf)。另一種能力是組合co、輔酶a和me-thf的甲基以形成乙酰-coa的能力。有機(jī)體能夠‘固定’來(lái)自外源co和/或co2和甲醇的碳，以合成乙酰-coa、細(xì)胞物質(zhì)和產(chǎn)物。與利用完全wood-ljungdahl途徑相比，用于從甲醇和合成氣形成乙酰-coa的這種途徑在能量方面具有優(yōu)勢(shì)。舉例來(lái)說(shuō)，合成氣直接轉(zhuǎn)化為乙酸是能量中性過(guò)程(參見(jiàn)圖6)。特定來(lái)說(shuō)，在通過(guò)甲?；?thf合成酶形成甲?；?thf的過(guò)程中消耗1個(gè)atp分子，而在經(jīng)由乙酸激酶產(chǎn)生乙酸的過(guò)程中則產(chǎn)生1個(gè)atp分子。卷入甲醇的這種新策略通過(guò)確保從甲醇而不是co2獲得甲基分支產(chǎn)物甲基-thf上的甲基來(lái)避免了atp消耗需求。這因此確保了乙酸形成具有正atp產(chǎn)出，從而幫助支持細(xì)胞生長(zhǎng)和維持。經(jīng)工程改造而具有這些能力且天然也具有回補(bǔ)能力的宿主有機(jī)體(例如大腸桿菌)可在合適的外部電子受體(例如硝酸鹽)存在下，利用甲醇和合成氣所產(chǎn)生的乙酰-coa生長(zhǎng)。這種電子受體是接受來(lái)自于經(jīng)由琥珀酸脫氫酶而形成的還原苯醌的電子。添加外部電子受體的另一優(yōu)點(diǎn)在于可從乙酰-coa的呼吸作用產(chǎn)生額外的能量用于細(xì)胞生長(zhǎng)、維持和產(chǎn)物形成。替代策略涉及將丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(pfor)工程改造到菌株中以允許在不存在外部電子受體的情況下合成生物質(zhì)前體。經(jīng)工程改造的有機(jī)體的另一特征是能夠從分子氫提取還原當(dāng)量。這允許高產(chǎn)率的還原產(chǎn)物，例如乙醇、丁醇、異丁醇、異丙醇、1,4-丁二醇、琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、4-羥基丁酸、3-羥基丙酸、乳酸、甲基丙烯酸、己二酸和丙烯酸。有機(jī)體可從以下來(lái)源產(chǎn)生乙酰-coa、細(xì)胞物質(zhì)和目標(biāo)化學(xué)物：1)甲醇和co，2)甲醇、co2和h2，3)甲醇、co、co2和h2，4)甲醇和包含co和h2的合成氣，和5)甲醇和包含co、co2和h2的合成氣。成功地將這種途徑工程改造到有機(jī)體中會(huì)涉及鑒別適當(dāng)?shù)拿讣?，將其?duì)應(yīng)基因克隆到生產(chǎn)宿主中，優(yōu)化這些基因的穩(wěn)定性和表達(dá)，優(yōu)化發(fā)酵條件，和分析發(fā)酵后的產(chǎn)物形成(參見(jiàn)實(shí)施例ii-iv)。下文描述催化合成氣和甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-coa所必需的途徑的每一步驟的多種酶。為了工程改造生產(chǎn)宿主以利用合成氣和甲醇，在微生物中表達(dá)一種或多種編碼必需酶的外源dna序列。本實(shí)施例描述從合成氣和甲醇產(chǎn)生乙酰-coa的示例性途徑。實(shí)施例xi用于產(chǎn)生利用甲醇和合成氣的微生物的基因集合本實(shí)施例描述用于產(chǎn)生利用甲醇和合成氣的微生物的示例性基因集合。甲醇-甲基轉(zhuǎn)移酶(mtr).經(jīng)修飾的wood-ljungdahl途徑在外來(lái)宿主中的表達(dá)(參見(jiàn)圖7)需要一組甲基轉(zhuǎn)移酶以便利用由甲醇提供的碳和氫以及由co和/或co2提供的碳。3種甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)(表示為mtaa、mtab和mtac)的復(fù)合物發(fā)揮期望的甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶活性(naidu和ragsdale,j.bacteriol.183:3276-3281(2001)；ragsdale,crit.rev.biochem.mol.biol.39:165-195(2004)；sauer等人,eur.j.biochem.243:670-677(1997)；tallant和krzycki,j.bacteriol.178:1295-1301(1996)；tallant和krzycki,j.bacteriol.179:6902-6911(1997)；tallant等人,j.biol.chem.276:4485-4493(2001))。甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶(mtab)和類咕啉蛋白(mtac).mtab是一種鋅蛋白，催化甲基從甲醇轉(zhuǎn)移到mtac、即類咕啉蛋白上?？稍诋a(chǎn)甲烷古細(xì)菌，例如巴氏甲烷八疊球菌(maeder等人,j.bacteriol.188:7922-7931(2006))和嗜乙酸甲烷八疊球菌(galagan等人,genomeres.12:532-542(2002))，以及產(chǎn)乙酸菌熱乙酸穆?tīng)柺暇?das等人,proteins67:167-176(2007))中發(fā)現(xiàn)編碼mtab和mtac的示例性基因。一般來(lái)說(shuō)，mtab和mtac在染色體上彼此相鄰，因?yàn)槠浠钚跃o密地相互依賴。巴氏甲烷八疊球菌、嗜乙酸甲烷八疊球菌和熱乙酸穆?tīng)柺暇?m.thermoaceticum)中的各種mtab和mtac編碼基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。將來(lái)自巴氏甲烷八疊球菌的mtab1和mtac1基因yp_304299和yp_304298克隆到大腸桿菌并測(cè)序(sauer等人,eur.j.biochem.243:670-677(1997))。也可獲得這種甲醇-鈷胺素甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(hagemeier等人,proc.natl.acad.sci.usa103:18917-18922(2006))。巴氏甲烷八疊球菌中的mtab基因yp_307082和yp_304612是通過(guò)與yp_304299的序列同源性鑒別。一般來(lái)說(shuō)，同源性搜索是鑒別甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶的有效方法，因?yàn)閙tab編碼基因與作用于替代底物(例如三甲胺、二甲胺、單甲胺或二甲硫醚)的甲基轉(zhuǎn)移酶顯示很小的相似性或不顯示相似性。mtac基因yp_307081和yp_304611是基于其與mtab基因的鄰近性以及其與yp_304298的同源性來(lái)鑒別。來(lái)自嗜乙酸甲烷八疊球菌的三組mtab和mtac基因已在遺傳學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)上得到表征(pritchett和metcalf,mol.microbiol.56:1183-1194(2005))。缺乏這三組基因中的兩組的突變菌株能利用甲醇生長(zhǎng)，而缺乏所有三組mtab和mtac基因的菌株則無(wú)法利用甲醇生長(zhǎng)。這暗示每一組基因都在甲醇利用方面起作用。熱乙酸穆?tīng)柺暇鷐tab基因是基于其與產(chǎn)甲烷菌mtab基因的同源性以及其與甲醇引起的類咕啉蛋白mtac的相鄰染色體鄰近性來(lái)鑒別，mtac已被結(jié)晶(zhou等人,actacrystallogr.sect.fstruct.biol.cryst.commun.61:537-540(2005))且通過(guò)northern雜交和western印跡技術(shù)進(jìn)一步表征(das等人,proteins67:167-176(2007))。甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(mtaa).mtaa是一種鋅蛋白，催化甲基在產(chǎn)甲烷菌中從mtac轉(zhuǎn)移到輔酶m上或在產(chǎn)乙酸菌中從mtac轉(zhuǎn)移到四氫葉酸上。mtaa還可利用甲基鈷胺素作為甲基供體?？稍诋a(chǎn)甲烷古細(xì)菌，例如巴氏甲烷八疊球菌(maeder等人,j.bacteriol.188:7922-7931(2006))和嗜乙酸甲烷八疊球菌(galagan等人,genomeres.12:532-542(2002))，以及產(chǎn)乙酸菌熱乙酸穆?tīng)柺暇?das等人,proteins67:167-176(2007))中發(fā)現(xiàn)編碼mtaa的示例性基因。一般來(lái)說(shuō)，催化甲基從ch3-mtac轉(zhuǎn)移的mtaa蛋白難以在生物信息學(xué)上鑒別，因?yàn)槠渑c其它類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶具有相似性且在染色體上與mtab和mtac基因相鄰定向。然而，許多mtaa編碼基因已經(jīng)得到表征。巴氏甲烷八疊球菌和嗜乙酸甲烷八疊球菌中的這些基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。克隆來(lái)自巴氏甲烷八疊球菌的mtaa基因yp_304602，對(duì)其測(cè)序并在大腸桿菌中功能性地過(guò)度表達(dá)(harms和thauer,eur.j.biochem.235:653-659(1996))。在嗜乙酸甲烷八疊球菌中，mtaa1是利用甲醇生長(zhǎng)所必需的，而mtaa2則是不必要的，即便在mtaa2突變株中從甲醇產(chǎn)生甲烷被削弱了(bose等人,j.bacteriol.190:4017-4026(2008))。同樣需要注意的是，在巴氏甲烷八疊球菌和嗜乙酸甲烷八疊球菌中還有多種尚未表征的其它mtaa同源物，但其也會(huì)催化類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性。熱乙酸穆?tīng)柺暇械募俣╩taa編碼基因是通過(guò)其與已表征的產(chǎn)甲烷菌mtaa基因的序列相似性來(lái)鑒別。特定來(lái)說(shuō)，三種熱乙酸穆?tīng)柺暇蚺c來(lái)自巴氏甲烷八疊球菌的yp_304602顯示高度同源性(>30％序列同一性)。不同于天然催化甲基從ch3-mtac轉(zhuǎn)移到輔酶m的產(chǎn)甲烷菌mtaa蛋白，鑒于四氫葉酸和輔酶m在產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)乙酸菌中的類似角色，熱乙酸穆?tīng)柺暇鷐taa很可能將甲基轉(zhuǎn)移到四氫葉酸。來(lái)自熱乙酸穆?tīng)柺暇募俣╩taa編碼基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶(acs/codh).acs/codh是wood-ljungdahl途徑的羰基分支的中心酶。其催化二氧化碳到一氧化碳的可逆還原，以及從一氧化碳、輔酶a和來(lái)自甲基化類咕啉鐵硫蛋白的甲基獲得乙酰-coa的合成。類咕啉-鐵硫蛋白是由甲基四氫葉酸經(jīng)由甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化。acs/codh在外來(lái)宿主中的表達(dá)涉及引入以下蛋白質(zhì)和其對(duì)應(yīng)活性中的多種，即便不是全部的話。甲基四氫葉酸:類咕啉蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(acse)類咕啉鐵硫蛋白(acsd)鎳蛋白裝配蛋白(acsf)鐵氧還蛋白(orf7)乙酰-coa合成酶(acsb和acsc)一氧化碳脫氫酶(acsa)鎳蛋白裝配蛋白(cooc)一氧化碳脫氫酶/乙酰-coa合成酶活性所必需的基因典型地駐留在可作為延伸操縱子的天然基因組的有限區(qū)域中(morton等人,j.biol.chem.266:23824-23828(1991)；ragsdale,crit.rev.biochem.mol.biol.39:165-195(2004)；roberts等人,proc.natl.acad.sci.usa86:32-36(1989))。來(lái)自產(chǎn)乙酸菌熱乙酸穆?tīng)柺暇拇瞬倏v子中的每種基因已在大腸桿菌中克隆并積極地表達(dá)(lu等人,j.biol.chem.268:5605-5614(1993)；morton等人,上文,1991；roberts等人,上文,(1989))。這些基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。產(chǎn)氫細(xì)菌生氫氧化碳嗜熱菌可通過(guò)乙酰-coa合成酶利用一氧化碳作為生長(zhǎng)基質(zhì)(wu等人,plosgenet.1:e65.(2005))。在菌株z-2901中，乙酰-coa合成酶復(fù)合物因?yàn)橐拼a突變而缺乏一氧化碳脫氫酶(we等人,上文,2005)，而在菌株dsm6008中，已經(jīng)純化到這種蛋白質(zhì)的功能性未移碼全長(zhǎng)形式(svetlitchnyi等人,proc.natl.acad.sci.usa101:446-451(2004))。來(lái)自菌株z-2901的生氫氧化碳嗜熱菌基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。生氫氧化碳嗜熱菌dsm6008的序列目前無(wú)法從公眾可利用的數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，但可容易地確定所述序列可以獲得。產(chǎn)甲烷古細(xì)菌嗜乙酸甲烷八疊球菌也可利用一氧化氮生長(zhǎng)，展現(xiàn)乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶活性，且同時(shí)產(chǎn)生乙酸和甲酸(lessner等人,proc.natl.acad.sci.usa103:17921-17926(2006))。這種有機(jī)體含有兩組編碼acs/codh活性的基因(rother和metcalf,proc.natl.acad.sci.usa101:16929-16934(2004))。這兩組嗜乙酸甲烷八疊球菌基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。acsc、acsd、acsb、acseps和acsa蛋白通常被稱作產(chǎn)甲烷菌codh/acs的γ、δ、β、ε和α亞單元。例如熱乙酸穆?tīng)柺暇犬a(chǎn)乙酸菌或例如生氫氧化碳嗜熱菌等產(chǎn)氫細(xì)菌中并不存在ε編碼基因的同源物。嗜乙酸甲烷八疊球菌中存在兩種活性codh/acs操縱子的假設(shè)包括：催化性質(zhì)(即km、vmax、kcat)，其促進(jìn)一氧化碳營(yíng)養(yǎng)或解乙酸生長(zhǎng)；或差異基因調(diào)控，其啟動(dòng)各種刺激以誘發(fā)codh/acs表達(dá)(rother等人,arch.microbiol.188:463-472(2007))。在熱乙酸穆?tīng)柺暇蜕鷼溲趸际葻峋?，其它c(diǎn)odh編碼基因位于acs/codh操縱子外部。這些酶提供從一氧化碳到二氧化碳的轉(zhuǎn)化作用中提取電子(或還原當(dāng)量)的方式。還原當(dāng)量然后傳遞到受體，例如氧化鐵氧還蛋白、nadp+、水或過(guò)氧化氫，以分別形成還原鐵氧還蛋白、nadph、h2或水。在一些情況下，氫化酶編碼基因與codh鄰近。在深紅紅螺菌中，經(jīng)編碼的codh/氫化酶蛋白形成膜結(jié)合酶復(fù)合物，其被提議作為通過(guò)co轉(zhuǎn)化為co2和h2而產(chǎn)生質(zhì)子梯度形式的能量的位點(diǎn)(fox等人,j.bacteriol.178:6200-6208(1996))。生氫氧化碳嗜熱菌的codh-i和其相鄰基因已被提議基于其與深紅紅螺菌codh/氫化酶基因簇的類似性來(lái)催化類似的功能角色(wu等人,plosgenet.1:e65(2005))。也已顯示生氫氧化碳嗜熱菌codh-i在連接于電極時(shí)會(huì)展現(xiàn)強(qiáng)烈的co氧化和co2還原活性(parkin等人,j.am.chem.soc.129:10328-10329(2007))。對(duì)編碼生氫氧化碳嗜熱菌codh-ii和鄰近蛋白coof的基因進(jìn)行克隆和測(cè)序(gonzalez和robb,femsmicrobiol.lett.191:243-247(2000))。所得復(fù)合物是膜結(jié)合的，但codh-ii的細(xì)胞質(zhì)部分顯示可催化nadph的形成，這暗示合成代謝作用(svetlitchnyi等人,j.bacteriol.183:5134-5144(2001))。codh-ii的晶體結(jié)構(gòu)也可獲得(dobbek等人,science293:1281-1285(2001))。示例性codh和氫化酶基因的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(pfor).在不存在外部電子受體的情況下，利用合成氣和甲醇的厭氧生長(zhǎng)通過(guò)允許經(jīng)由丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶(pfor)合成丙酮酸而賦予宿主有機(jī)體acs/codh活性。來(lái)自非洲脫硫弧菌的pfor已在大腸桿菌中克隆并表達(dá)，從而產(chǎn)生在氧存在下可穩(wěn)定數(shù)天的活性重組酶(pieulle等人,j.bacteriol.179:5684-5692(1997))。氧穩(wěn)定性在pfor中相對(duì)罕見(jiàn)，認(rèn)為其是由非洲脫硫弧菌酶的多肽鏈中的60個(gè)殘基的延伸引起的。熱乙酸穆?tīng)柺暇鷓for也已得到充分表征(menon和ragsdale,biochemistry36:8484-8494(1997))且顯示在自養(yǎng)生長(zhǎng)期間在丙酮酸合成的方向上具有高活性(furdui和ragsdale,j.biol.chem.275:28494-28499(2000))。此外，大腸桿菌具有未被表征的開(kāi)放閱讀框ydbk，其編碼與熱乙酸穆?tīng)柺暇鷓for具有51％同一性的蛋白質(zhì)。丙酮酸氧化還原酶活性的證據(jù)已有描述(blaschkowski等人,eur.j.biochem.123:563-569(1982))。這些示例性pfor酶的蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。若干種其它的pfor酶已有描述(ragsdale,chem.rev.103:2333-2346(2003))。氫化酶(hyd).不同于co和甲醇到乙酰-coa或乙酸的氧化還原中性轉(zhuǎn)化，以最高的可能產(chǎn)率產(chǎn)生還原程度更高的產(chǎn)物(例如乙醇、丁醇、異丁醇、異丙醇、1,4-丁二醇、丁二酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、4-羥基丁酸、3-羥基丙酸、乳酸、甲基丙烯酸、己二酸和丙烯酸)則需要從co和h2提取額外的還原當(dāng)量(例如參見(jiàn)圖7中的乙醇形成)。特定來(lái)說(shuō)，還原當(dāng)量(例如圖6中的2[h])是通過(guò)co和水經(jīng)由實(shí)施例ii中所述的一氧化碳脫氫酶轉(zhuǎn)化為co2來(lái)獲得，或者直接來(lái)自利用氫的氫化酶將電子從h2轉(zhuǎn)移到受體(例如鐵氧還蛋白、黃素氧還蛋白、fad+、nad+或nadp+)的活性。大腸桿菌和其它腸細(xì)菌天然具有編碼至多4種氫化酶的多種基因(sawers,antonievanleeuwenhoek66:57-88(1994)；sawers等人,j.bacteriol.164:1324-1331(1985)；sawers和boxer,eur.j.biochem.156:265-275(1986)；sawers等人,j.bacteriol.168:398-404(1986))。鑒于酶活性的多樣性，大腸桿菌或另一種宿主有機(jī)體有可能提供足夠的氫化酶活性以便分裂進(jìn)入的分子氫并還原對(duì)應(yīng)受體。大腸桿菌的內(nèi)源氫裂解酶包括氫化酶3、使用鐵氧還蛋白作為受體的膜結(jié)合酶復(fù)合物和也使用鐵氧還蛋白受體的氫化酶4。氫化酶3和4是由hyc和hyf基因簇分別編碼。大腸桿菌中的氫化酶活性也取決于hyp基因的表達(dá)，所述hyp基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)與氫化酶復(fù)合物的裝配有關(guān)(jacobi等人,arch.microbiol.158:444-451(1992)；rangarajan等人,j.bacteriol.190:1447-1458(2008))。如果生產(chǎn)宿主缺乏足夠的內(nèi)源氫化酶活性，那么熱乙酸穆?tīng)柺暇鷼浠甘呛线m的候選物。熱乙酸穆?tīng)柺暇梢詂o2作為獨(dú)有的碳源生長(zhǎng)，表明還原當(dāng)量是從h2提取以允許經(jīng)由wood-ljungdahl途徑的乙酰-coa合成(drake,j.bacteriol.150:702-709(1982)；drake和daniel,res.microbiol.155:869-883(2004)；kellum和drake,j.bacteriol.160:466-469(1984))(參見(jiàn)圖6)。熱乙酸穆?tīng)柺暇哂衼?lái)自大腸桿菌的若干hyp、hyc和hyf基因的同源物。這些基因所編碼的這些蛋白質(zhì)序列可由以下genbank登記號(hào)標(biāo)識(shí)。此外，熱乙酸穆?tīng)柺暇写嬖谌舾煞N編碼氫化酶和/或雜二硫鍵還原酶功能的基因簇，且其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列也在下文提供。hyp裝配蛋白.熱乙酸穆?tīng)柺暇谢蚺c大腸桿菌hyp基因同源的蛋白質(zhì).氫化酶3.氫化酶4.熱乙酸穆?tīng)柺暇谢蚺c大腸桿菌hyc和/或hyf基因同源的蛋白質(zhì).熱乙酸穆?tīng)柺暇衅渌臍浠妇幋a基因簇.本實(shí)施例描述用于工程改造有機(jī)體以從合成氣和甲醇產(chǎn)生乙酰-coa的示例性基因集合。實(shí)施例xii用于工程改造有機(jī)體以從合成氣和甲醇產(chǎn)生乙酰-coa的基因和所編碼酶的克隆、表達(dá)和活性分析本實(shí)施例描述提供可利用合成氣和甲醇的有機(jī)體的酶的編碼基因的克隆和表達(dá)。甲醇-甲基轉(zhuǎn)移酶(mtr).在大腸桿菌中克隆并表達(dá)用于從甲醇產(chǎn)生me-thf的至少最小基因集合，例如mtaa、mtab和mtac。經(jīng)由校對(duì)pcr(proof-readingpcr)克隆這些基因，并將其連接到一起以供在阻抑型pa1-laco1啟動(dòng)子的控制下，在高拷貝數(shù)的載體(例如pze22-s)中表達(dá)(lutz和bujard,nucleicacidsres.25:1203-1210(1997))。將輔酶b12添加到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，因?yàn)檫@些甲基轉(zhuǎn)移酶活性需要鈷胺素作為輔因子。通過(guò)pcr和/或限制性酶圖譜驗(yàn)證克隆的基因以證實(shí)3-基因集合的構(gòu)建和其被插入表達(dá)載體中。對(duì)假定克隆進(jìn)行dna測(cè)序以證實(shí)每種基因的預(yù)期序列。一旦得到確認(rèn)，就通過(guò)添加最終濃度介于0.05mm與1mm之間的異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)而在大腸桿菌k-12(mg1655)細(xì)胞中表達(dá)最終構(gòu)建體。使用全細(xì)胞提取物的sds-page來(lái)監(jiān)測(cè)經(jīng)克隆的基因的表達(dá)。為了確定mtaabc蛋白的表達(dá)是否賦予大腸桿菌將甲基從甲醇轉(zhuǎn)移到四氫葉酸(thf)的能力，向重組菌株饋送不同濃度的甲醇，且與甲基-thf合成一起監(jiān)測(cè)甲醇吸收。如針對(duì)熱乙酸穆?tīng)柺暇凶鳛榧谆吹南悴菟?naiduandragsdale,j.bacteriol.183:3276-3281(2001))或巴氏甲烷八疊球菌甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶(sauer等人,eur.j.biochem.243:670-677(1997)；tallant和krzycki.j.bacteriol.178:1295-1301(1996)；tallant和krzycki.j.bacteriol.179:6902-6911(1997)；tallant等人,j.biol.chem.276:4485-4493(2001))所述，在厭氧條件下分析甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的活性。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，平行培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞，并監(jiān)測(cè)內(nèi)源甲基轉(zhuǎn)移酶活性。證實(shí)了活性取決于所添加的外源輔酶b12，這確認(rèn)了甲醇:類咕啉甲基轉(zhuǎn)移酶活性在大腸桿菌中的表達(dá)。乙酰-coa合成酶/一氧化碳脫氫酶(acs/codh).使用標(biāo)準(zhǔn)pcr方法，將編碼熱乙酸穆?tīng)柺暇?、生氫氧化碳嗜熱菌和嗜乙酸甲烷八疊球菌的acs/codh活性所必需的基因的完全操縱子裝配到低或中等拷貝數(shù)的載體中，例如pza33-s(基于p15a)或pzs13-s(基于psc101)。如針對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶所描述，確認(rèn)經(jīng)克隆的基因的結(jié)構(gòu)和序列。經(jīng)由對(duì)在具有必需金屬(ni、zn、fe)和輔酶b12的嚴(yán)格厭氧條件下生長(zhǎng)的全細(xì)胞溶解物進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳來(lái)監(jiān)測(cè)表達(dá)。必要時(shí)，通過(guò)鑒別任何明顯的終止子并將其移除，并引入從已知在大腸桿菌中有效的位點(diǎn)中選擇的一致性核糖體結(jié)合位點(diǎn)，借此對(duì)基因簇進(jìn)行修飾以供大腸桿菌表達(dá)(barrick等人,nucleicacidsres.22:1287-1295(1994)；ringquist等人,mol.microbiol.6:1219-1229(1992))。然而，每種基因簇是以與其天然結(jié)構(gòu)和表達(dá)平行的方式克隆和表達(dá)。這有助于確保大部分彼此相互作用的各種基因產(chǎn)物之間的期望化學(xué)計(jì)量。一旦在厭氧條件下獲得了令人滿意的codh/acs基因簇表達(dá)，則分析表達(dá)這些基因的細(xì)胞將co和/或co2固定到細(xì)胞碳中的能力。初始條件利用以外源葡萄糖作為碳源和能源，經(jīng)由底物水平的磷酸化或以硝酸鹽作為電子受體的厭氧呼吸，嚴(yán)格厭氧生長(zhǎng)的細(xì)胞。此外，將外源提供的ch3-thf添加到培養(yǎng)基中。分析組合的mtr和acs/codh途徑的活性.如實(shí)施例ii中所述將acs/codh基因克隆，同樣如實(shí)施例ii中所述在也表達(dá)甲醇-甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的細(xì)胞中表達(dá)。這是通過(guò)將表達(dá)acs/codh的相容質(zhì)粒引入到mtr表達(dá)細(xì)胞中來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了獲得附加的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，acs/codh和mtr基因也可整合到染色體中。在獲得能夠利用甲醇產(chǎn)生me-thf并表達(dá)活性codh/acs基因的大腸桿菌菌株之后，分析其利用甲醇和合成氣以便并入到細(xì)胞物質(zhì)和乙酸中的能力。初始條件是利用在嚴(yán)格厭氧條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞，其以外源提供的葡萄糖作為碳源和能源?；蛘撸虺咸烟且酝猓跛猁}可添加到發(fā)酵液中以用作電子受體和生長(zhǎng)引發(fā)劑。已經(jīng)證實(shí)大腸桿菌在硝酸鹽存在下可利用脂肪酸進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)，所述脂肪酸最終代謝為乙酰-coa(campbell等人,mol.microbiol.47:793-805(2003))?？赏ㄟ^(guò)在例如硝酸鹽等電子受體存在下培養(yǎng)微生物有機(jī)體來(lái)利用類似條件。也可提供氧，只要其細(xì)胞內(nèi)含量被維持在經(jīng)工程改造的酶的任何限制閾值以下即可。與甲醇一起使用具有適合于這些實(shí)驗(yàn)的組成的“合成氣”。向細(xì)胞提供13c標(biāo)記的甲醇或13c標(biāo)記的co，并使用分析質(zhì)譜法測(cè)量經(jīng)標(biāo)記的碳在乙酸和細(xì)胞物質(zhì)(例如蛋白氨基酸)中的并入量。丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶.克隆來(lái)自熱乙酸穆?tīng)柺暇⒎侵廾摿蚧【痛竽c桿菌的丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶基因，并在展現(xiàn)mtr和acs/codh活性的菌株中表達(dá)。條件、啟動(dòng)子等在上文已有描述。鑒于pfor基因的大尺寸和對(duì)應(yīng)酶的氧敏感性，使用低拷貝或單拷貝質(zhì)粒載體或單拷貝染色體整合法進(jìn)行測(cè)試。應(yīng)用活性分析(如furdui和ragsdale,j.biol.chem.275:28494-28499(2000)中所述)來(lái)證實(shí)活性。此外，證實(shí)了菌株在不存在外部電子受體的情況下可利用氣態(tài)碳源和甲醇生長(zhǎng)，這提供了活體內(nèi)pfor活性的另一證據(jù)。氫化酶.通過(guò)在存在和不存在氫的情況下如上所述培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)測(cè)試宿主有機(jī)體利用氫的內(nèi)源氫化酶活性。如果在發(fā)酵期間觀察到形成更多的還原產(chǎn)物(例如相比乙酸，乙醇增多)，那么這表明內(nèi)源氫化酶的活性足夠高。在這種情況下，沒(méi)有異源氫化酶被克隆和表達(dá)。如果天然酶不具有足夠活性或減少必需的受體，那么克隆編碼個(gè)別氫化酶復(fù)合物的基因并在展現(xiàn)mtr、acs/codh和pfor活性的菌株中表達(dá)。條件、啟動(dòng)子等在上文已有描述。本實(shí)施例描述賦予合成氣和甲醇利用途徑的基因的克隆和表達(dá)，以及對(duì)適當(dāng)活性的分析。實(shí)施例xiii開(kāi)發(fā)和優(yōu)化從經(jīng)工程改造以利用合成氣和甲醇的有機(jī)體產(chǎn)生乙酰-coa的發(fā)酵方法本實(shí)施例描述用于合成氣和甲醇利用型有機(jī)體的發(fā)酵條件的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化。合成氣發(fā)酵中重要的過(guò)程考慮因素有高生物質(zhì)濃度和良好的氣-液傳質(zhì)(bredwell等人,biotechnol.prog.15:834-844(1999))。co在水中的溶解度稍微小于氧在水中的溶解度。在控制發(fā)酵罐中執(zhí)行連續(xù)充氣發(fā)酵，其中通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定法和周期液體取樣進(jìn)行恒定廢氣分析并通過(guò)gc和hplc進(jìn)行分析。液相可以分批模式運(yùn)行。例如醇、有機(jī)酸和殘余葡萄糖以及殘余甲醇等發(fā)酵產(chǎn)物是通過(guò)hplc(shimadzu,columbiamd)定量，其中例如使用hplc柱的系列(例如hpx-87系列)(biorad,herculesca)，對(duì)于葡萄糖和醇使用折射率檢測(cè)器，且對(duì)于有機(jī)酸使用uv檢測(cè)器。通過(guò)使用分光光度計(jì)(600nm)測(cè)量光學(xué)密度來(lái)確定生長(zhǎng)速率。這些系統(tǒng)中的所有管道都是玻璃或金屬以便維持厭氧條件。用玻璃料執(zhí)行氣體鼓泡以降低氣泡尺寸并改進(jìn)質(zhì)量傳遞。測(cè)試在約0.1到1vvm(每分鐘的蒸氣體積)范圍內(nèi)的各種鼓泡速率。為了獲得氣體吸收率的精確測(cè)量，執(zhí)行暫時(shí)停止氣流的周期性挑戰(zhàn)，并將氣相組成作為時(shí)間的函數(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)總體目標(biāo)生產(chǎn)率，使用細(xì)胞滯留或再循環(huán)方法。一種增加微生物濃度的方法是經(jīng)由切向流膜(tangentialflowmembrane)從測(cè)流再循環(huán)細(xì)胞。也可使用重復(fù)分批培養(yǎng)，如先前針對(duì)穆?tīng)柺暇囊宜嵘a(chǎn)所述(sakai等人,j.biosci.bioeng.99:252-258(2005))。也可使用各種其它方法(bredwell等人,biotechnol.prog.15:834-844(1999)；datar等人,biotechnol.bioeng.86:587-594(2004))?？蓽y(cè)試其它優(yōu)化(例如1.5atm的超壓)以改進(jìn)質(zhì)量傳遞(najafpour和younesi,enzymeandmicrobialtechnology38:223-228(2006))。一旦使用純h2/co作為進(jìn)料獲得了令人滿意的表現(xiàn)，則產(chǎn)生含有可能存在于商業(yè)合成氣中的抑制劑的合成氣混合物。舉例來(lái)說(shuō)，典型雜質(zhì)概況為4.5％ch4、0.1％c2h2、0.35％c2h6、1.4％c2h4和150ppm一氧化氮(datar等人,biotechnol.bioeng.86:587-594(2004))。由例如苯、甲苯、乙苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯和萘等化合物代表的焦油以ppm水平添加以測(cè)試對(duì)生產(chǎn)的任何影響。舉例來(lái)說(shuō)，已經(jīng)顯示40ppm的no對(duì)嗜羧酸梭菌具有抑制性(ahmed和lewis,biotechnol.bioeng.97:1080-1086(2007))。培養(yǎng)物在轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐之前以搖瓶培養(yǎng)法測(cè)試。還測(cè)試這些潛在抑制化合物的不同含量以便定量其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。所述知識(shí)用于開(kāi)發(fā)合成氣純度的規(guī)格，其用于按比例增大的研究和生產(chǎn)中。如果發(fā)現(xiàn)有任何特定組分難以從用于規(guī)?；暮铣蓺庵袦p少或移除，那么可利用適應(yīng)進(jìn)化程序使細(xì)胞耐受一種或多種雜質(zhì)。本實(shí)施例描述用于合成氣和甲醇利用型有機(jī)體的發(fā)酵條件的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化。實(shí)施例xiv用于處理co和厭氧培養(yǎng)物的方法本實(shí)施例描述用于處理co和厭氧培養(yǎng)物的方法。處理少量co以用于分析和小規(guī)模培養(yǎng).co是一種無(wú)嗅、無(wú)色且無(wú)味的有毒氣體。因此，需要對(duì)利用co的培養(yǎng)和分析作特別處理。若干種分析(包括co氧化、乙酰-coa合成、使用肌紅蛋白的co濃度和小批次培養(yǎng)物中的co耐受/利用)要求co氣體的數(shù)量很小，從而可在通風(fēng)柜中分配和處理。生物化學(xué)分析要求先用co飽和極小量(<2ml)的生物化學(xué)分析培養(yǎng)基或緩沖液，然后進(jìn)行所述分析。所有的co處理步驟都是在通風(fēng)柜中執(zhí)行，其中調(diào)節(jié)門(mén)設(shè)定在適當(dāng)高度且排風(fēng)機(jī)開(kāi)啟；co是從壓縮氣體鋼瓶和連接于希萊克管線的調(diào)節(jié)器分配得到。調(diào)節(jié)器確保等濃度的co被分配到若干個(gè)可能的試管或小瓶中的每一個(gè)中。希萊克管線被設(shè)置為在輸入側(cè)具有氧洗滌器，且在另一側(cè)具有油壓釋放鼓泡器和排氣口?；蛘咭部墒褂美溱?。分析試管是無(wú)氧的，但含有co。因此，分析試管用橡膠塞完全密封，且試劑的添加或移除是使用氣密性進(jìn)樣針頭和注射器進(jìn)行。其次，在密封塞好的血清瓶中，使小規(guī)模(約50ml)培養(yǎng)物在飽和co下生長(zhǎng)。和生物化學(xué)分析一樣，使用希萊克管線配置，在通風(fēng)柜中平衡co飽和的微生物培養(yǎng)物。生物化學(xué)分析和微生物培養(yǎng)都是在便攜式密封容器中以小體積進(jìn)行，這有助于通風(fēng)柜外部的安全處理。壓縮co儲(chǔ)罐與通風(fēng)柜緊鄰。典型地使用希萊克管線將co分配到試管，其各自通風(fēng)。用19或20號(hào)一次性注射器針頭刺穿試管上的橡膠塞并通過(guò)所述針頭通風(fēng)。油鼓泡器與co儲(chǔ)罐和氧洗滌器一起使用。分光光度計(jì)的玻璃或石英管在頂部具有圓孔，其中安裝有kontes止動(dòng)套筒sz7774250-0007。co檢測(cè)器單元緊鄰?fù)L(fēng)柜安置。供給到大規(guī)模培養(yǎng)的較大量co的處理.對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)物供給co或co和h2的混合物，以模擬合成氣或在發(fā)酵生產(chǎn)中作為原料的合成氣。因此，1升到幾升范圍內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量可包括添加co氣體以增加co在培養(yǎng)基中的溶解濃度。在這些情況下，將向培養(yǎng)基中添加相當(dāng)大數(shù)量的連續(xù)給予的co氣體。在不同點(diǎn)收集培養(yǎng)物或移出樣品?；蛘?，可用作為發(fā)酵罐一部分的整合式連續(xù)流離心機(jī)收集細(xì)胞。發(fā)酵過(guò)程一般在厭氧條件下進(jìn)行。在一些情況下，為了確保足夠的氧飽和度以便提供呼吸環(huán)境，將氧氣或空氣泵入發(fā)酵罐中是不經(jīng)濟(jì)的。此外，厭氧發(fā)酵期間產(chǎn)生的還原力很可能是產(chǎn)物形成而不是呼吸所必需的。此外，被認(rèn)為用于多種途徑的許多酶具有不同程度的氧敏感性。例如熱乙酸穆?tīng)柺暇冉?jīng)典產(chǎn)乙酸菌是專性嫌氣微生物，且wood-ljungdahl途徑中的酶非常容易由分子氧引起不可逆的失活。雖然存在耐氧產(chǎn)乙酸菌，但wood-ljungdahl途徑中的全部酶很可能在氧存在下都具有問(wèn)題，因?yàn)榇蠖鄶?shù)是鐵氧還蛋白的關(guān)鍵組分、即金屬酶，且調(diào)控可使代謝從wood-ljungdahl途徑偏離，從而最大化能量獲得。同時(shí)，培養(yǎng)物中的細(xì)胞充當(dāng)氧清除劑，其緩和在大規(guī)模細(xì)胞生長(zhǎng)的存在下對(duì)極端措施的需求。厭氧培養(yǎng)室和條件.示例性厭氧培養(yǎng)室可從市面購(gòu)得(參見(jiàn)例如vacuumatmospherescompany,hawthorneca；mbraun,newburyportma)。示例性條件包括1ppm或以下的o2濃度和1atm純n2。在一個(gè)實(shí)施例中，可使用3個(gè)氧洗滌器/催化劑再生器，且培養(yǎng)室可包含1個(gè)o2電極(例如teledyne；cityofindustryca)。在打開(kāi)內(nèi)部室門(mén)之前，幾乎所有的物品和試劑都在培養(yǎng)室的氣閘中循環(huán)4次。體積大于5ml的試劑在引入培養(yǎng)室之前經(jīng)純n2鼓泡。手套每年更換約2次，且催化劑容器在培養(yǎng)室對(duì)氧含量改變所作出的反應(yīng)日益緩慢時(shí)被定期再生。培養(yǎng)室的壓力通過(guò)由螺線管啟動(dòng)的單向閥控制。這種特征非常便利，因?yàn)槠湓试S將培養(yǎng)室壓力設(shè)定在高于環(huán)境的水平，以便能經(jīng)由放氣閥轉(zhuǎn)移非常小的試管。厭氧培養(yǎng)室可實(shí)現(xiàn)始終很低且為對(duì)氧氣高度敏感的厭氧條件所必需的o2水平。然而，細(xì)胞的生長(zhǎng)和處理通常不需要所述預(yù)防措施。在一替代性厭氧培養(yǎng)室配置中，鉑或鈀可用作催化劑，其需要混合物中存在一些氫氣。代之以使用電磁閥，壓力釋放可由鼓泡器控制。代之以使用基于儀器的o2監(jiān)測(cè)，可使用測(cè)試條(teststrip)。為了改良厭氧條件，可在我們的系統(tǒng)里進(jìn)行一些相對(duì)簡(jiǎn)單的改變；其中一些已經(jīng)在進(jìn)行中。厭氧微生物學(xué).如上文對(duì)于co處理所述，處理小規(guī)模培養(yǎng)物。特定來(lái)說(shuō)，用厚橡膠塞裝備血清或培養(yǎng)基瓶，并使用鋁制封皮密封瓶子。以傳統(tǒng)方式制備例如極品肉湯(terrificbroth)等培養(yǎng)基，并將其分配到適當(dāng)大小的血清瓶中。用氮?dú)獬涮钇孔?，維持約30分鐘的中等起泡。這將從培養(yǎng)基中移除大部分的氧氣，且在此步驟之后，每個(gè)瓶子都用橡膠塞(例如bellco20mm隔膜塞；bellco,vineland,nj)蓋好并用封皮密封(bellco20mm)。然后使用緩慢(液體)排氣循環(huán)用高壓鍋蒸煮培養(yǎng)基瓶。在蒸煮期間至少時(shí)不時(shí)地可用針頭戳穿塞子以提供排氣；所述針頭需要在瓶子從高壓鍋移除之后立即移除。經(jīng)由注射器和針頭向無(wú)菌培養(yǎng)基中添加其余的培養(yǎng)基組分，例如緩沖液或抗生素。在添加還原劑之前，用氮?dú)?或co，這取決于用途)將瓶子平衡30-60分鐘。可添加例如100x150mm硫化鈉、200mm鹽酸半胱氨酸等還原劑。這可通過(guò)以下步驟完成：將硫化鈉稱重到干燥燒杯中并將半胱氨酸稱重到血清瓶中，將兩者放到厭氧培養(yǎng)室中，在無(wú)氧水中溶解硫化鈉，然后將其添加到血清瓶的半胱氨酸中。血清瓶應(yīng)立即塞好，因?yàn)榱蚧c溶解會(huì)在接觸半胱氨酸之后產(chǎn)生硫化氫氣體。當(dāng)注射入培養(yǎng)物時(shí)，使用針頭過(guò)濾器來(lái)滅菌溶液。其它組分可經(jīng)由注射器針頭添加，例如b12(10μm氰鈷胺素)、氯化鎳(nicl2，20μm最終濃度，在培養(yǎng)室中在無(wú)氧水中從40mm儲(chǔ)備液制備，并通過(guò)高壓鍋蒸煮或通過(guò)在注射入培養(yǎng)物之后使用針頭過(guò)濾器滅菌)和硫酸亞鐵銨(最終濃度必需為100μm，在培養(yǎng)室中在無(wú)氧水中作為100-1000x儲(chǔ)備溶液制備，并通過(guò)高壓鍋蒸煮或通過(guò)在注射入培養(yǎng)物之后使用針頭過(guò)濾器滅菌)。為了促進(jìn)在厭氧條件下更快地生長(zhǎng)，用50ml厭氧生長(zhǎng)的預(yù)培養(yǎng)物接種1l瓶子。通過(guò)添加最終濃度為0.2mm的異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)來(lái)在載體中誘導(dǎo)pa1-laco1啟動(dòng)子，且所述過(guò)程進(jìn)行約3小時(shí)。在鼓泡的同時(shí)使用連續(xù)氣體添加，大規(guī)模培養(yǎng)物可在較大瓶子中生長(zhǎng)。具有金屬鼓泡器的橡膠塞在培養(yǎng)基添加后放置于瓶子中，并在裝配瓶子的剩余部分之前用氮?dú)夤呐?0分鐘或以上。將每個(gè)瓶子裝配到一起，使得無(wú)菌過(guò)濾器可對(duì)鼓入的氣體滅菌，且瓶子上的軟管可用小c型夾鉗壓縮。用磁力攪拌棒攪拌培養(yǎng)基和細(xì)胞。一旦添加完所有的培養(yǎng)基組分和細(xì)胞，則可將瓶子在恒溫箱中在室內(nèi)空氣中，同時(shí)向瓶子連續(xù)鼓泡氮?dú)獾那闆r下培養(yǎng)。本實(shí)施例描述co和厭氧培養(yǎng)物的處理。實(shí)施例xvco氧化(codh)分析本實(shí)施例描述用于測(cè)量co氧化(co脫氫酶；codh)的分析方法。將熱乙酸穆?tīng)柺暇?基因codh/acs操縱子克隆到大腸桿菌表達(dá)載體中?？寺⊥暾募s10kbpdna片段，此區(qū)域中的一些基因可能從其自身的內(nèi)源啟動(dòng)子表達(dá)且所有基因都含有內(nèi)源核糖體結(jié)合位點(diǎn)。熱乙酸穆?tīng)柺暇歉锾m氏陽(yáng)性菌，且預(yù)期核糖體結(jié)合位點(diǎn)元件可在大腸桿菌中良好工作。使用定量測(cè)量codh活性的分析，對(duì)這些克隆的co氧化進(jìn)行分析。熱乙酸穆?tīng)柺暇虍a(chǎn)物的抗血清用于western印跡技術(shù)以估算比活度。所述活性將在下文更詳細(xì)地描述，其被估算為熱乙酸穆?tīng)柺暇然疃鹊募s1/50。因?yàn)闊嵋宜崮聽(tīng)柺暇妇哂屑s55℃的最佳溫度，所以這可能會(huì)限制重組大腸桿菌細(xì)胞的codh活性。因此，嗜溫codh/acs途徑可能是有利的，例如嗜溫且不具有表觀完整的codh/acs操縱子和wood-ljungdahl途徑的穆?tīng)柺暇慕H物種、即哈氏脫亞硫酸菌。作為潛在宿主有機(jī)體的產(chǎn)乙酸菌包括(但不限于)深紅紅螺菌、熱乙酸穆?tīng)柺暇凸厦搧喠蛩峋?。co氧化在codh/acs分析中是最靈敏的也是最可靠的?；诖竽c桿菌的合成氣利用系統(tǒng)最終可能需要像梭菌(即穆?tīng)柺暇?系統(tǒng)一樣厭氧，特別是對(duì)于最大活性來(lái)說(shuō)。對(duì)codh的改進(jìn)是可能的，但最終會(huì)受co氣體的水溶性限制。起初將每種基因單獨(dú)地克隆到表達(dá)載體中。產(chǎn)生用于每個(gè)復(fù)合物中多個(gè)亞單元的組合表達(dá)單元。測(cè)定大腸桿菌中蛋白質(zhì)水平下的表達(dá)。獲得組合的熱乙酸穆?tīng)柺暇鷆odh/acs操縱子和單獨(dú)表達(dá)克隆。co氧化分析.所述分析是一種用于wood-ljungdahl途徑內(nèi)的酶活性的更簡(jiǎn)單、可靠且更通用的分析法，并且用于測(cè)試codh(seravalli等人,biochemistry43:3944-3955(2004))。熱乙酸穆?tīng)柺暇鷆odh比活度的典型活性在55℃下是500u或在25℃下是約60u。所述分析利用在co存在下甲基紫精的還原作用。這是在578nm下在塞緊的無(wú)氧玻璃試管中進(jìn)行測(cè)量。更詳細(xì)地說(shuō)，用橡膠塞塞緊的玻璃試管是在用去離子水洗滌試管4次并用丙酮洗滌試管1次之后制備。將少量的真空潤(rùn)滑脂涂抹在橡膠墊圈的頂部。試管用co充氣，并用22號(hào)針頭和排氣針頭干燥10分鐘。使用22號(hào)針頭添加體積0.98ml的反應(yīng)緩沖液(50mmhepes，ph8.5；2mm二硫蘇糖醇(dtt))，其中排氣針頭開(kāi)啟并存在100％co。甲基紫精(ch3紫精)儲(chǔ)備液為1m水溶液。每個(gè)分析使用20微升，最終濃度為20mm。當(dāng)添加甲基紫精時(shí)，使用18號(hào)針頭(部分)作為夾套，以利于使用hamilton注射器抽出ch3紫精。抽出4-5個(gè)試樣并丟棄，以對(duì)注射器進(jìn)行洗滌和氣體平衡。在制備ch3紫精儲(chǔ)備液時(shí)添加少量的連二亞硫酸鈉(0.1m儲(chǔ)備液)以稍微還原ch3紫精。溫度在被加熱的olis分光光度計(jì)(bogartga)中平衡到55℃?？瞻追磻?yīng)(ch3紫精+緩沖液)首先進(jìn)行以測(cè)量ch3紫精還原作用的基準(zhǔn)速率。acs90和acs91(分別具有和不具有第一個(gè)cooc的熱乙酸穆?tīng)柺暇腸odh-acs操縱子)的粗制大腸桿菌細(xì)胞提取物。每次添加10微升提取物，混合并分析。被還原的ch3紫精變成紫色。分析結(jié)果展示于表x中。表2.粗制提取物的co氧化活性.mta98/mta99是表達(dá)來(lái)自熱乙酸穆?tīng)柺暇募状技谆D(zhuǎn)移酶基因的大腸桿菌mg1655菌株，且因此是含有熱乙酸穆?tīng)柺暇鷆odh操縱子的acs90acs91大腸桿菌菌株的陰性對(duì)照。如果約1％的細(xì)胞蛋白是codh，那么這些數(shù)字將是純熱乙酸穆?tīng)柺暇鷆odh的500u/mg活性的大約1/100?；趙estern印跡技術(shù)的實(shí)際估算值是0.5％的細(xì)胞蛋白，因此活性是熱乙酸穆?tīng)柺暇鷆odh的約1/50。然而，在陰性對(duì)照中的活性非常小的情況下，所述實(shí)驗(yàn)并未明確證實(shí)重組大腸桿菌中的co氧化活性。在陰性對(duì)照中觀察到的少量co氧化(ch3紫精還原)表明大腸桿菌可能具有還原ch3紫精的有限能力。為了估算codh和mtr蛋白的最終濃度，對(duì)用于co氧化、acs、甲基轉(zhuǎn)移酶和類咕啉fe-s分析中的相同細(xì)胞提取物相繼執(zhí)行sds-page和western印跡分析。所用抗血清是純化的熱乙酸穆?tīng)柺暇鷆odh-acs和mtr蛋白的多克隆，并使用堿性磷酸酶連接的山羊抗兔二抗顯現(xiàn)出來(lái)。執(zhí)行western印跡分析且結(jié)果展示于圖9中。通過(guò)與對(duì)照泳道對(duì)比，估算acs90和acs91中的codh量為50ng。經(jīng)由western印跡分析確認(rèn)了包含2個(gè)codh亞單元的codh-acs操縱子基因的表達(dá)和甲基轉(zhuǎn)移酶。因此，重組大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)7基因操縱子的多個(gè)組分。此外，甲基轉(zhuǎn)移酶和類咕啉鐵硫蛋白在相同的大腸桿菌細(xì)胞中皆具有活性。這些蛋白質(zhì)是克隆到相同細(xì)胞中的相同操縱子的部分。使用熱乙酸穆?tīng)柺暇?xì)胞的提取物，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照重復(fù)co氧化分析。雖然大腸桿菌acs90和acs91中的codh活性可以測(cè)量到，但其只有熱乙酸穆?tīng)柺暇鷮?duì)照的約1/130-1/150。分析結(jié)果展示于圖10中。簡(jiǎn)言之，培養(yǎng)細(xì)胞(具有codh/acs操縱子的熱乙酸穆?tīng)柺暇虼竽c桿菌；acs90或acs91或空白載體pza33s)且如上文所述制備提取物。如上所述在55℃在提取物制備當(dāng)天的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)執(zhí)行分析。歷經(jīng)120秒的時(shí)間，在578nm下跟蹤甲基紫精的還原。這些結(jié)果描述co氧化(codh)分析和結(jié)果。重組大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)co氧化活性，其是通過(guò)甲基紫精還原分析來(lái)測(cè)量。實(shí)施例xvi乙酰-coa合成酶(acs)活性分析(co交換分析)本實(shí)施例描述acs分析方法。所述分析測(cè)量乙酰-coa的羰基與co的acs催化型交換(raybuck等人,biochemistry27:7698-7702(1988))。將acs(以純化的酶或細(xì)胞提取物的部分的形式)與羰基碳經(jīng)14c標(biāo)記的乙酰-coa在co氣氛下培養(yǎng)。在活性acs存在下，反應(yīng)的液相中的放射性按指數(shù)規(guī)律降低，直到達(dá)到由經(jīng)14c標(biāo)記的乙酰-coa的含量與經(jīng)14c標(biāo)記的co的含量之間的平衡所決定的最小值為止。通過(guò)這種方法來(lái)分析其它分析中所用的表達(dá)acs90和acs91的大腸桿菌mg1655的相同細(xì)胞提取物，以及對(duì)照提取物。更詳細(xì)地說(shuō)，在小分析瓶中于標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下，制得0.2mm乙酰-coa、0.1mm甲基紫精和2mm檸檬酸鈦(iii)于0.3mmes緩沖液(ph6.0)中的溶液。添加完所有組分后的總反應(yīng)體積為500μl。小瓶用橡膠塞(bellco)和鋁制鉗口封皮(bellco)密封，以創(chuàng)建氣密性反應(yīng)氣氛。每個(gè)小瓶用100％co充填數(shù)分鐘，時(shí)間應(yīng)足夠長(zhǎng)以便完全交換小瓶的氣氛，并放入?yún)捬跖囵B(yǎng)室中。分析瓶放置于55℃砂浴中，并在所述溫度下使其達(dá)到平衡。制備具有40μl的1mhcl的總計(jì)10個(gè)閃爍瓶以用于每個(gè)分析瓶。使用氣密性hamilton注射器向分析瓶中添加acs，并培養(yǎng)約2-3分鐘以使反應(yīng)達(dá)到平衡。使用氣密性hamilton注射器添加1μl(0.36納摩爾)14c-乙酰-coa以開(kāi)始分析(時(shí)間＝0min)。時(shí)間點(diǎn)從開(kāi)始分析時(shí)取起。用氣密性hamilton注射器從分析瓶中移出樣品(40μl)。每個(gè)樣品都添加到所制備的閃爍瓶中的40μlhcl中以中止反應(yīng)。因?yàn)閍cs酶將14c標(biāo)記從乙酰-coa轉(zhuǎn)移到co上，所以同位素濃度按對(duì)數(shù)規(guī)律降低。因此，在早期時(shí)間點(diǎn)對(duì)分析頻繁地取樣。記錄下每個(gè)樣品的精確時(shí)間點(diǎn)。反應(yīng)的精確步調(diào)取決于acs酶，但一些樣品一般是立即獲取且初始?xì)v經(jīng)10-15分鐘取樣。繼續(xù)獲取樣品達(dá)1-2小時(shí)。在一特定示例性分析中，使用4種分析條件：空白(無(wú)acs)、12μl經(jīng)純化的表達(dá)熱乙酸穆?tīng)柺暇鷄cs的大腸桿菌菌株、4μl經(jīng)純化的大腸桿菌acs和3.7μl熱乙酸穆?tīng)柺暇鷆odh/acs。在另一特定示例性分析中，使用4種分析條件：108μgcodh/acs、1mgmta99細(xì)胞提取物、1mgacs90細(xì)胞提取物和1mgacs91細(xì)胞提取物。酶作為100μl溶液(50mmkpi，0.1mnacl，ph7.6)添加?？捎糜诖蠖鄶?shù)codh-acs活性的更靈敏的分析是下文所述的合成分析。本實(shí)施例描述用于測(cè)量acs活性的分析條件。實(shí)施例xvii乙酰-coa合成和甲基轉(zhuǎn)移酶分析本實(shí)施例描述乙酰-coa合成和甲基轉(zhuǎn)移酶分析。合成分析.所述分析是使用codh/acs、甲基轉(zhuǎn)移酶(metr)和類咕啉fe-s蛋白從甲基-四氫葉酸、co和輔酶a合成乙酰-coa的活體外反應(yīng)(raybuck等人,biochemistry27:7698-7702(1988))。通過(guò)添加或省略所涉及的每種酶，所述分析可用于多種實(shí)驗(yàn)中，包括測(cè)試一種或多種純酶或細(xì)胞提取物的活性，和在各種條件下或用限制量的底物或酶測(cè)定反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲取的反應(yīng)樣品用從乙酰-coa終產(chǎn)物釋放乙酸的1mhcl中止反應(yīng)。在用dowex柱純化之后，可通過(guò)色譜法、質(zhì)譜法或通過(guò)測(cè)量放射性來(lái)分析乙酸。確切方法將由反應(yīng)中所用的特異性底物來(lái)決定。利用14c標(biāo)記的甲基-thf，并測(cè)量所分離的乙酸樣品的放射性。主要目的是測(cè)試cfesp亞單元。所述分析還包含+/-純化的甲基轉(zhuǎn)移酶。分析以下6種不同條件：(1)純化的codh/acs、metr和cfesp，作為陽(yáng)性對(duì)照；(2)純化的codh/acs與acs90細(xì)胞提取物；(3)純化的codh/acs與acs91細(xì)胞提取物；(4)純化的codh/acs、metr與acs90細(xì)胞提取物；(5)純化的codh/acs、metr與acs91細(xì)胞提取物；(6)純化的codh/acs、metr與盡可能多的acs91細(xì)胞提取物(排除mes緩沖液)。反應(yīng)是在厭氧培養(yǎng)室中于充滿co的分析瓶中裝配?？偡磻?yīng)體積小于小瓶體積，因此試劑可在用co填充小瓶之前或之后添加，只要使用氣密性hamilton注射器并維持試劑無(wú)氧即可。反應(yīng)(總計(jì)約60μl)是由細(xì)胞提取物(除了分析1)、輔酶a、檸檬酸鈦(iii)、mes(除了分析6)、純化的codh/acs、14c-甲基-四氫葉酸、甲基-紫精和鐵氧還蛋白組成。此外，將純化的metr添加到分析1和4-6中，并將純化的cfesp添加到分析1中。反應(yīng)在厭氧培養(yǎng)室中在55℃的砂浴中進(jìn)行。最后添加的試劑是14c-甲基-四氫葉酸，其啟動(dòng)反應(yīng)(t＝0s)。立即獲取初始樣品，隨后在30分鐘、1小時(shí)和2小時(shí)時(shí)獲取樣品。這些時(shí)間點(diǎn)并不精確，因?yàn)?種條件是同時(shí)運(yùn)行(因?yàn)檫@個(gè)實(shí)驗(yàn)主要是定性實(shí)驗(yàn))。將15μl樣品添加到閃爍瓶中的15μl1mhcl中。對(duì)于最后一個(gè)樣品，如果反應(yīng)中留下的量小于15μl，那么用15μlhcl沖洗分析瓶以獲取反應(yīng)的剩余部分。10μl體積的細(xì)胞提取物用于分析2-5，且26.4μl細(xì)胞提取物用于分析6。打算用于分析中的純酶的典型量如下：codh/acs＝ˉ0.2納摩爾；metr＝0.2納摩爾；cfesp＝0.05納摩爾。所用的典型分析濃度如下：codh/acs＝1μm；me-cfesp＝0.4μm；metr＝1μm；鐵氧還蛋白＝3μm；coa＝0.26mm；14c-甲基-thf＝0.4mm；甲基紫精＝0.1mm；和檸檬酸鈦(iii)＝3mm。在對(duì)反應(yīng)混合物計(jì)數(shù)之后，確定了acs90提取物中的類咕啉fe-s蛋白具有活性，總活性接近陽(yáng)性對(duì)照的約1/5且顯著高于陰性對(duì)照(無(wú)提取物)。也可使用非放射性合成分析。任選的非放射性分析條件如下：分析條件1：100mmmes，ph6.0；1mmcoa；1mmme-thf；0.33mm檸檬酸鈦(iii)，體積為950μl，+50μl提取物；在co氣氛(對(duì)照為ar)下在55℃培養(yǎng)。這些反應(yīng)將在黑暗中進(jìn)行，因?yàn)轭惞具谆d體對(duì)光敏感。分析條件2：100mmmes，ph6.0；1mmcoa；1mmme-thf；1mm甲基紫精；體積為950μl，+50μl提取物；在co氣氛下，在55℃，在黑暗中培養(yǎng)。用10μl的10％甲酸中止反應(yīng)，其中在1hr、3hr和6.5hr時(shí)獲取樣品并儲(chǔ)存在-20℃下。分析條件3：100mmtris，ph7.6；5mmcoa；7.5mmme-thf；1mm甲基紫精；體積為90μl，+10μl提取物；在co或ar下，在55℃在黑暗中培養(yǎng)1hr，用10μl10％甲酸中止反應(yīng)，并儲(chǔ)存在-20℃下。在lu等人(j.biol.chem.265:3124-3133.(1990))中，發(fā)現(xiàn)合成反應(yīng)的最佳ph介于7.2-7.5之間。lu等人還發(fā)現(xiàn)高于10mm的輔酶a濃度具有抑制性。lu等人描述了使用碘代甲烷代替me-thf作為甲基供體，并使用了5-7.5mm濃度。lu等人還確定了dtt或其它還原劑不是必要的，但他們使用了鐵氧還蛋白作為電子載體。甲基紫精在上述反應(yīng)中被替代。此外，maynard等人(j.biol.inorg.chem.9:316-322(2004))確定了電子載體不是嚴(yán)格意義上必需的，但如果缺乏電子載體則會(huì)導(dǎo)致合成的延時(shí)。在使用電子載體時(shí)，maynard等人使用1mm甲基紫精作為電子載體。甲基轉(zhuǎn)移酶分析.催化ch3從甲基-四氫葉酸轉(zhuǎn)移到acs復(fù)合物而作為乙酰-coa合成的一部分的必需甲基轉(zhuǎn)移酶活性是在codh-acs操縱子內(nèi)編碼。這是甲基和羰基途徑結(jié)合到一起的步驟。在熱乙酸穆?tīng)柺暇牟倏v子內(nèi)，mtr編碼基因是moth_1197且跟在主要codh和acs亞單元后面。因此，mtr活性將構(gòu)成更鄰近基因可被表達(dá)的間接證據(jù)。通過(guò)光譜法分析mtr活性。特定來(lái)說(shuō)，含有co(iii)的甲基化cfesp在約450nm下具有小吸收峰，而含有co(i)的未甲基化cfesp在約390nm下具有大峰。這種光譜的形成是因?yàn)殁捄丸F-硫簇發(fā)色團(tuán)。此外，cfesp可自發(fā)地氧化為co(ii)，其在約470nm下產(chǎn)生寬吸收峰(seravalli等人,biochemistry38:5728-5735(1999))。使用大腸桿菌細(xì)胞提取物、從熱乙酸穆?tīng)柺暇兓腸fesp和甲基-四氫葉酸測(cè)試重組甲基轉(zhuǎn)移酶。類咕啉蛋白的甲基化是根據(jù)以下現(xiàn)象觀測(cè)到：390nm下吸收的減少，450nm下吸收的同時(shí)增加，以及470nm下不存在主峰。同時(shí)也在開(kāi)發(fā)使用13c-甲醇的非放射性分析。這應(yīng)當(dāng)轉(zhuǎn)移到四氫葉酸上且產(chǎn)生分子質(zhì)量+1的mthf?；蛘撸J(rèn)為甲基轉(zhuǎn)移酶也通過(guò)將甲醇的甲基轉(zhuǎn)移到高半胱氨酸以形成甲硫氨酸來(lái)工作。所述分析對(duì)其同樣適用，因?yàn)榧琢虬彼?1質(zhì)量比mthf+1或其它的一些可能性更容易進(jìn)行檢測(cè)。除了使用13c以外，也可使用氘作為示蹤劑，這兩者都可用質(zhì)譜法測(cè)量。這些示蹤劑也可用于活體內(nèi)標(biāo)記研究中。還可使用其它分析方法確定各種中間物或產(chǎn)物，包括例如電子順磁共振(epr)、穆斯堡爾光譜法(mossbauerspectroscopy)、電子-核雙共振(endor)、紅外、磁圓二色性(mcd)、結(jié)晶學(xué)、x射線吸收，以及動(dòng)力學(xué)方法，包括停流和快速反應(yīng)epr(stoppedflowandfreeze-quenchepr)。圖8說(shuō)明甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶如何裝配到codh/acs(‘合成氣’)途徑中?；旧希状嫉募谆?jīng)由鈷胺素依賴性過(guò)程轉(zhuǎn)移到四氫葉酸，然后轉(zhuǎn)移到codh/acs的類咕啉-fes蛋白(也是一種鈷胺素蛋白)，其接著對(duì)acs反應(yīng)供應(yīng)甲基，從而合成乙酸。甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物是由三種基因產(chǎn)物組成；其中的兩種是mtab和mtac(moth_1209和moth_1208)，彼此相鄰且容易克隆。第三種基因產(chǎn)物mtaa可由三種不同的基因(moth_2100、moth_2102和moth_2346)編碼，且所有三種基因是否都是必需的或這三種基因的子集是否可發(fā)揮作用尚不明了。大腸桿菌中的所有克隆都是使用lutz-bujard載體進(jìn)行(lutz和bujard,nucleicacidsres.25:1203-1210(1997))。以下分析可用于確定編碼甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶基因產(chǎn)物的mtab的活性。甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶的陽(yáng)性對(duì)照可用香草酸o-去甲基作用來(lái)執(zhí)行。甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng).先前已描述了示例性甲醇甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)(sauer和thauer,eur.j.biochem.249:280-285(1997)；naidu和ragsdale,j.bacteriol.183:3276-3281(2001))。反應(yīng)條件如下：50mmmops/koh，ph7.0；10mmmgcl2；4mm檸檬酸鈦(iii)；0.2％十二烷基麥芽糖苷(替換sds，參見(jiàn)sauer和thauer,eur.j.biochem.253:698-705(1998))；25μm羥基鈷胺素；1％meoh或1mm香草酸(取決于甲基轉(zhuǎn)移酶形式)。通過(guò)37℃或55℃下在黑暗中的光譜儀讀數(shù)來(lái)測(cè)量這些反應(yīng)。所述分析測(cè)試mtab或mtvb分別將甲基從甲醇或香草酸轉(zhuǎn)移到鈷胺素的能力。實(shí)施例xviii大腸桿菌co耐受實(shí)驗(yàn)和co濃度分析(肌紅蛋白分析)本實(shí)施例描述大腸桿菌對(duì)于高濃度co的耐受性。為了測(cè)試大腸桿菌是否可在飽和量的co存在下厭氧生長(zhǎng)，培養(yǎng)是如上文關(guān)于厭氧微生物學(xué)所述，以小體積在具有50ml極品肉湯培養(yǎng)基(加上還原溶液、nicl2、fe(ii)nh4so4、氰基鈷胺素、iptg和氯霉素)的120ml血清瓶中進(jìn)行。這些瓶子的一半用氮?dú)馄胶?0分鐘，另一半則用co氣體平衡30分鐘。使用空白載體(pza33)作為對(duì)照，并用n2和co測(cè)試含有pza33空白載體以及acs90和acs91的培養(yǎng)物。接種所有培養(yǎng)物并在37℃于振蕩(250rpm)下培養(yǎng)36小時(shí)。在36小時(shí)結(jié)束時(shí)，檢查燒瓶，發(fā)現(xiàn)總共有大量的生長(zhǎng)。觀察到的生長(zhǎng)在過(guò)夜后整體會(huì)發(fā)生較長(zhǎng)延遲。鑒于所有培養(yǎng)物似乎在co存在下都良好生長(zhǎng)，因此確認(rèn)了最終co濃度。這是通過(guò)分析肌紅蛋白在暴露于co后的光譜移位來(lái)進(jìn)行的。經(jīng)連二亞硫酸鈉還原的肌紅蛋白在435nm下具有吸收峰；這個(gè)峰在使用co的情況下則移動(dòng)到423nm。因?yàn)椴ㄩL(zhǎng)很低并且需要記錄從300nm向上的全波譜，所以必須使用石英管。針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量co濃度，且其取決于在20℃和1atm下的最大水溶性＝970微摩爾濃度的co的亨利定律(henry’slaw)常數(shù)。為了測(cè)試肌紅蛋白的co濃度，將試管用水洗滌10次，用丙酮洗滌1次，然后與codh分析一樣用塞子塞緊。向試管中吹入n2，持續(xù)約10分鐘。用hamilton注射器向空白(未經(jīng)co平衡)中添加體積1ml的厭氧緩沖液(hepes，ph8.0，2mmdtt)。添加體積10微升的肌紅蛋白(約1mm，可變化，只不過(guò)需要相當(dāng)大的量)和1微升連二亞硫酸鹽(20mm儲(chǔ)備液)。co標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用以1微升的增量添加的co飽和緩沖液獲得。記錄每個(gè)增量的峰高和峰位移。測(cè)試的培養(yǎng)物是pza33/co、acs90/co和acs91/co。這些培養(yǎng)物各自是以1微升的增量添加到同一試管中。在實(shí)驗(yàn)中途設(shè)置第二試管并加以使用。結(jié)果展示于表3中。表3.一氧化碳濃度，36小時(shí).表3所示的結(jié)果表明，無(wú)論菌株是否在co存在下培養(yǎng)，培養(yǎng)物都可生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明大腸桿菌可耐受厭氧條件下對(duì)co的暴露，并且表達(dá)codh-acs操縱子的大腸桿菌細(xì)胞可代謝部分co。這些結(jié)果證實(shí)大腸桿菌細(xì)胞無(wú)論是否表達(dá)codh/acs，都能在飽和量的co存在下生長(zhǎng)。此外，這些細(xì)胞與用氮?dú)馓鎿Qco的對(duì)照組生長(zhǎng)的一樣好。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株對(duì)在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下執(zhí)行的合成氣計(jì)劃中可實(shí)現(xiàn)的水平的co不敏感。此外，初步實(shí)驗(yàn)表明表達(dá)codh/acs的重組大腸桿菌細(xì)胞實(shí)際上消耗一些co，很可能是通過(guò)氧化為二氧化碳。實(shí)施例ixx用于產(chǎn)生4-羥基丁酸和1,4-丁二醇的示例性途徑本實(shí)施例描述用于從乙酰-coa產(chǎn)生4-羥基丁酸和1,4-丁二醇的示例性途徑。如本文所公開(kāi)，組合(1)用于將合成氣連同和不連同甲醇轉(zhuǎn)化為乙酰-coa的途徑與(2)用于將乙酰-coa轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸或1,4-丁二醇的途徑。因此，本發(fā)明提供生產(chǎn)有機(jī)體和轉(zhuǎn)化途徑，其與經(jīng)工程改造以從碳水化合物原料產(chǎn)生4-羥基丁酸或1,4-丁二醇的有機(jī)體相比具有固有的產(chǎn)率優(yōu)勢(shì)。舉例來(lái)說(shuō)，使用本文所述的從乙酰-coa開(kāi)始進(jìn)行的代謝途徑，從葡萄糖產(chǎn)生4-羥基丁酸和1,4-丁二醇的最大理論產(chǎn)率是每摩爾葡萄糖得到1摩爾產(chǎn)物。特定來(lái)說(shuō)，經(jīng)由糖酵解每摩爾葡萄糖可產(chǎn)生2摩爾乙酰-coa，且每摩爾4-羥基丁酸或1,4-丁二醇需要2摩爾乙酰-coa。通過(guò)以下化學(xué)計(jì)量等式描述凈轉(zhuǎn)化：4-羥基丁酸:c6h12o6+1.5o2→c4h8o3+2co2+2h2o1,4-丁二醇:c6h12o6→c4h10o2+ch2o2+co2另一方面，葡萄糖氣化為其更簡(jiǎn)單的組分co和h2，隨后使用本文所述的途徑轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸和1,4-丁二醇，這會(huì)產(chǎn)生以下最大理論產(chǎn)率：4-羥基丁酸:6co+6h2→1.333c4h8o3+0.667co2+0.667h2o1,4-丁二醇:6co+6h2→1.091c4h10o2+1.636co2+0.545h2o應(yīng)注意葡萄糖的氣化最多可提供6摩爾co和6摩爾h2。從合成氣產(chǎn)生4-羥基丁酸和1,4-丁二醇的最大理論產(chǎn)率可通過(guò)如下文所述添加甲醇而得到進(jìn)一步提高。4-羥基丁酸:ch4o+6co+6h2→1.667c4h8o3+0.333co2+1.333h2o1,4-丁二醇:ch4o+6co+6h2→1.364c4h10o2+1.545co2+1.182h2o4-羥基丁酸:2ch4o+6co+6h2→2c4h8o3+2h2o1,4-丁二醇:2ch4o+6co+6h2→1.636c4h10o2+1.455co2+1.818h2o因此，本文所述的有機(jī)體和轉(zhuǎn)化途徑顯然可提供將碳水化合物轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸或1,4-丁二醇的有效方法。乙酰乙酰-coa硫解酶將2分子的乙酰-coa轉(zhuǎn)化為1分子的乙酰乙酰-coa和1分子的輔酶a。示例性乙酰乙酰-coa硫解酶包括以下基因的基因產(chǎn)物：來(lái)自大腸桿菌的atob(martin等人,nat.biotechnol21:796-802(2003))、來(lái)自丙酮丁醇梭菌的thla和thlb(hanai等人,applenvironmicrobiol73:7814-7818(2007)；winzer等人,j.mol.microbiolbiotechnol2:531-541(2000))和來(lái)自釀酒酵母的erg10(hiser等人,j.biol.chem.269:31383-31389(1994))。蛋白genbankid有機(jī)體atobnp_416728大腸桿菌thlanp_349476.1丙酮丁醇梭菌thlbnp_149242.1丙酮丁醇梭菌erg10np_015297釀酒酵母將乙酰乙酰-coa轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酰-coa的示例性3-羥基?；摎涿赴▉?lái)自丙酮丁醇梭菌的hbd(boynton等人,journalofbacteriology178:3015-3024(1996))、來(lái)自拜氏梭菌(c.beijerinckii)的hbd(colby和chen等人,applenviron.microbiol58:3297-3302(1992))和來(lái)自勤奮金屬球菌(metallosphaerasedula)的許多類似酶(berg等人,2007science318:1782-1786(2007))。蛋白genbankid有機(jī)體hbdnp_349314.1丙酮丁醇梭菌hbdaam14586.1拜氏梭菌msed_1423yp_001191505勤奮金屬球菌msed_0399yp_001190500勤奮金屬球菌msed_0389yp_001190490勤奮金屬球菌msed_1993yp_001192057勤奮金屬球菌來(lái)自丙酮丁醇梭菌的crt的基因產(chǎn)物催化3-羥基丁酰-coa脫水生成巴豆酰-coa(atsumi等人,metabeng(2007)；boynton等人,journalofbacteriology178:3015-3024(1996))。此外，烯脂酰輔酶a水合酶是可逆的酶且因此是催化3-羥基丁酰-coa脫水生成巴豆酰-coa的合適候選物。惡臭假單胞菌的烯脂酰輔酶a水合酶phaa和phab被認(rèn)為在苯基乙酸分解代謝期間對(duì)雙鍵執(zhí)行羥基化作用(olivera等人,procnatacadsciu.s.a.95:6419-6424(1998))。熒光假單胞菌的paaa和paab催化類似的轉(zhuǎn)化(olivera等人,procnatacadsciu.s.a.95:6419-6424(1998))。最后，許多大腸桿菌基因已經(jīng)顯示可展現(xiàn)烯脂酰輔酶a水合酶功能性，包括maoc、paaf和paag(ismail等人,europeanjournalofbiochemistry270:3047-3054(2003)；park和lee,jbacteriol.185:5391-5397(2003)；park和lee,applbiochem.biotechnol113-116:335-346(2004)；park和yup,biotechnolbioeng86:681-686(2004))。蛋白genbankid有機(jī)體crtnp_349318.1丙酮丁醇梭菌paaanp_745427.1惡臭假單胞菌paabnp_745426.1惡臭假單胞菌phaaabf82233.1熒光假單胞菌phababf82234.1熒光假單胞菌maocnp_415905.1大腸桿菌paafnp_415911.1大腸桿菌paagnp_415912.1大腸桿菌已經(jīng)在許多物種中鑒別出了活體內(nèi)天然催化逆反應(yīng)(即4-羥基丁酰-coa脫水生成巴豆酰-coa)的若干種酶。所述轉(zhuǎn)化用于氨基丁酸梭菌(clostridiumaminobutyricum)的4-氨基丁酸發(fā)酵(scherf和buckel,eur.jbiochem.215:421-429(1993))和克氏梭菌(clostridiumkluyveri)的琥珀酸-乙醇發(fā)酵(scherf等人,arch.microbiol161:239-245(1994))。所述轉(zhuǎn)化也是例如勤奮金屬球菌等古細(xì)菌中的一個(gè)步驟，作為3-羥基丙酸/4-羥基丁酸自養(yǎng)二氧化碳同化途徑的一部分(berg等人,science318:1782-1786(2007))。此途徑利用巴豆酰-coa的水合以形成4-羥基丁酰-coa。4-羥基丁酰-coa脫水酶的可逆性已有詳細(xì)記錄(friedrich等人,angew.chem.int.ed.engl.47:3254-3257(2008)；muh等人,eur.j.biochem.248:380-384(1997)；muh等人,biochemistry35:11710-11718(1996))，且平衡常數(shù)已被報(bào)導(dǎo)為約4，位于巴豆酰-coa一側(cè)(scherf和buckel,eur.jbiochem.215:421-429(1993))。這表明下游4-羥基丁酰-coa脫氫酶保持4-羥基丁酰-coa濃度很低，以致不能在巴豆酰-coa處產(chǎn)生熱力學(xué)瓶頸。蛋白genbankid有機(jī)體abfdcab60035氨基丁酸梭菌abfdyp_001396399克氏梭菌msed_1321yp_001191403勤奮金屬球菌msed_1220yp_001191305勤奮金屬球菌4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)移酶將輔酶a部分從4-羥基丁酰輔酶轉(zhuǎn)移到乙酸，于是形成4-羥基丁酸和乙酰-coa。一種示例性4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)移酶是由克氏梭菌的cat2基因編碼(seedorf等人,proc.natl.acad.sci.us.a.105:2128-2133(2008)；sohling和gottschalk,jbacteriol.178:871-880(1996))。也顯示牙齦卟啉菌(porphyromonasgingivalis)的abft-2基因當(dāng)作為產(chǎn)生4-羥基丁酸和1,4-丁二醇的途徑的一部分實(shí)施時(shí)可展現(xiàn)4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)移酶活性(burk等人,wo/2008/115840(2008))?？赏ㄟ^(guò)序列同源性推斷由牙齦卟啉菌的abft-1編碼的另一種候選酶。另一種4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)移酶是由氨基丁酸梭菌的abft的基因產(chǎn)物編碼(gerhardt等人,arch.microbiol174:189-199(2000))。蛋白genbankid有機(jī)體cat2yp_001396397克氏梭菌abft-2np_906037牙齦卟啉菌abft-1np_904965.1牙齦卟啉菌abftcab60036氨基丁酸梭菌示例性磷酸轉(zhuǎn)移性?；D(zhuǎn)移酶包括由pta編碼的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和由ptb編碼的磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶。來(lái)自大腸桿菌的pta基因編碼可將乙酰-coa轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸且反之亦然的酶(suzuki,t.1969biochim.biophys.acta191:559-569(1969))。所述酶也可利用丙酰輔酶a代替乙酰-coa，從而在過(guò)程中形成丙酸(hesslinger等人,mol.microbiol27:477-492(1998))。類似地，來(lái)自丙酮丁醇梭菌的ptb基因編碼可將丁酰輔酶a轉(zhuǎn)化為丁酰磷酸的酶(huang等人,j.mol.microbiolbiotechnol2:33-38(2000)；walter等人,gene134:107-111(1993))。這種酶顯示在作為產(chǎn)生1,4-丁二醇的途徑的一部分實(shí)施時(shí)可對(duì)4-羥基丁酰-coa具有活性(wo/2008/115840(2008))。其它ptb基因可在產(chǎn)丁酸菌l2-50(ljungdahl和andreesen,methodsenzymol.53:360-372(1978))和解磷細(xì)菌(bacillusmegaterium)(vazquez等人,curr.microbiol42:345-349(2001))中發(fā)現(xiàn)。蛋白genbankid有機(jī)體ptanp_416800.1大腸桿菌ptbnp_349676丙酮丁醇梭菌ptbaar19757.1產(chǎn)丁酸菌l2-50ptbcac07932.1解磷細(xì)菌示例性激酶包括大腸桿菌乙酸激酶，由acka編碼(skarstedt和silverstein,j.biol.chem.251:6775-6783(1976))；丙酮丁醇梭菌丁酸激酶，由buk1和buk2編碼(huang等人,2000j.mol.microbiolbiotechnol2:33-38(2000)；walter等人,gene134:107-111(1993))；和大腸桿菌γ-谷氨酸激酶，由prob編碼(smith等人,j.bacteriol.157:545-551(1984))。這些酶分別磷酸化乙酸、丁酸和谷氨酸。大腸桿菌的acka基因產(chǎn)物也磷酸化丙酸(hesslinger等人,mol.microbiol27:477-492(1998))。burk等人,wo/2008/115840(2008)顯示丙酮丁醇梭菌的buk1基因產(chǎn)物當(dāng)作為產(chǎn)生1,4-丁二醇的途徑的一部分實(shí)施時(shí)對(duì)4-羥基丁酰-coa具有活性。蛋白genbankid有機(jī)體ackanp_416799.1大腸桿菌buk1np_349675丙酮丁醇梭菌buk2q97ii1丙酮丁醇梭菌probnp_414777.1大腸桿菌醇形成型4-羥基丁酰-coa還原酶催化從4-羥基丁酰-coa形成1,4-丁二醇所必需的2個(gè)還原步驟。將?；o酶a轉(zhuǎn)化為醇的示例性2步氧化還原酶包括那些將例如乙酰-coa等底物轉(zhuǎn)化為乙醇(例如大腸桿菌的adhe)(kessler等人,febs.lett.281:59-63(1991))和將丁酰輔酶a轉(zhuǎn)化為丁醇(例如丙酮丁醇梭菌的adhe2)(fontaine等人,j.bacteriol.184:821-830(2002))的氧化還原酶。參考文獻(xiàn)burk等人,wo/2008/115840(2008)具體地顯示了丙酮丁醇梭菌的adhe2酶可用于從4-羥基丁酰-coa產(chǎn)生bdo。除了將乙酰-coa還原為乙醇外，腸膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)的adhe所編碼的酶已顯示可將支鏈化合物異丁醛氧化為異丁酰輔酶a(kazahaya等人,j.gen.appl.microbiol.18:43-55(1972)；koo等人,biotechnollett.27:505-510(2005))。另一種示例性酶可將丙二酰輔酶a轉(zhuǎn)化為3-hp。具有此活性的nadph依賴性酶已在橙色綠屈撓菌(chloroflexusaurantiacus)中得到表征，其中所述酶參與3-羥基丙酸循環(huán)(hugler等人,j.bacteriol.184:2404-2410(2000)；strauss和fuchs,eur.j.biochem.215:633-643(1993))。所述酶的質(zhì)量為300kda，其具有高度的底物特異性且與其它已知的氧化還原酶顯示很小的序列相似性(hugler等人,j.bacteriol.184:2404-2410(2002))。沒(méi)有顯示其它有機(jī)體中的酶可催化所述特異性反應(yīng)；然而，存在生物信息學(xué)證據(jù)證明其它有機(jī)體可能具有類似的途徑(klatt等人,environ.microbiol.9:2067-2078(2007))。可通過(guò)序列相似性推斷包括卡氏玫瑰彎菌(roseiflexuscastenholzii)、赤細(xì)菌屬(erythrobacter)nap1和海洋γ變形桿菌(marinegammaproteobacterium)htcc2080的其它有機(jī)體中的候選酶。蛋白genbankid有機(jī)體mcraas20429.1橙色綠屈撓菌rcas_2929yp_001433009.1卡氏玫瑰彎菌nap1_02720zp_01039179.1赤細(xì)菌屬nap1mgp2080_00535zp_01626393.1海洋γ變形桿菌htcc2080從4-羥基丁酰-coa產(chǎn)生bdo的替代途徑涉及首先將所述化合物還原為4-羥基丁醛。若干種?；o酶a脫氫酶能夠?qū)Ⅴ；o酶a還原為其對(duì)應(yīng)的醛。編碼所述酶的示例性基因包括：醋酸鈣不動(dòng)桿菌(acinetobactercalcoaceticus)acr1，其編碼脂肪酰輔酶a還原酶(reiser和somerville,journalofbacteriology179:2969-2975(1997))；不動(dòng)桿菌屬(acinetobactersp.)m-1脂肪酰輔酶a還原酶(ishige等人,appl.environ.microbiol.68:1192-1195(2002))；和克氏梭菌sucd基因，其編碼輔酶a-和nadp-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶(sohling和gottschalk,jbacteriol.178:871-880(1996))。牙齦卟啉菌的sucd是另一種琥珀酸半醛脫氫酶(takahashi等人,j.bacteriol.182:4704-4710(2000))。參考文獻(xiàn)burk等人,wo/2008/115840(2008)具體地顯示了這些琥珀酸半醛脫氫酶可作為產(chǎn)生1,4-丁二醇的途徑的一部分而將4-羥基丁酰-coa轉(zhuǎn)化為4-羥基丁醛。假單胞菌屬中由bphg編碼的使乙醛脫氫酶?；拿甘橇硪环N有用的酶，因?yàn)槠湟驯蛔C實(shí)可氧化乙醛、丙醛、丁醛、異丁醛和甲醛并使其?；?powlowski等人,jbacteriol.175:377-385(1993))。將?；o酶a轉(zhuǎn)化為其對(duì)應(yīng)醛的另一種類型的酶是丙二酰輔酶a還原酶，其將丙二酰輔酶a轉(zhuǎn)化為丙二酸半醛。丙二酰輔酶a還原酶是嗜熱嗜酸古菌中經(jīng)由3-羥基丙酸循環(huán)的自養(yǎng)碳固定中的關(guān)鍵酶(berg等人,science318:1782-1786(2007)；thauer,r.k.science318:1732-1733(2007))。所述酶利用nadph作為輔因子且已在金屬球菌和硫化葉菌(sulfolobusspp)中得到表征(alber等人,j.bacteriol.188:8551-8559(2006)；hugler等人,j.bacteriol.184:2404-2410(2002))。所述酶在勤奮金屬球菌中是由msed_0709編碼(alber等人,j.bacteriol.188:8551-8559(2006)；berg等人,science318:1782-1786(2007))。將來(lái)自托氏硫化葉菌(sulfolobustokodaii)的編碼丙二酰輔酶a還原酶的基因在大腸桿菌中克隆并異源表達(dá)(alber等人,j.bacteriol.188:8551-8559(2006))。雖然這些酶的醛脫氫酶功能類似于來(lái)自橙色綠屈撓菌的雙功能脫氫酶，但是其序列相似性卻很小。這兩種丙二酰輔酶a還原酶候選物與天門(mén)冬氨酸半醛脫氫酶具有高度的序列相似性，天門(mén)冬氨酸半醛脫氫酶是一種催化天冬氨酰-4-磷酸還原且同時(shí)脫磷酸成天門(mén)冬氨酸半醛的酶?？稍诎蚧堑V硫化葉菌(sulfolobussolfataricus)和嗜酸熱硫化葉菌(sulfolobusacidocaldarius)的其它有機(jī)體中通過(guò)與蛋白質(zhì)的序列同源性來(lái)發(fā)現(xiàn)其它候選基因。蛋白genbankid有機(jī)體msed_0709yp_001190808.1勤奮金屬球菌mcrnp_378167.1托氏硫化葉菌asd-2np_343563.1硫磺礦硫化葉菌saci_2370yp_256941.1嗜酸熱硫化葉菌展現(xiàn)1,4-丁二醇脫氫酶活性的酶能夠從4-羥基丁醛形成1,4-丁二醇。催化醛轉(zhuǎn)化為醇的酶(即醇脫氫酶，或等同地稱作醛還原酶)的示例性編碼基因包括：編碼c2-c14的中鏈醇脫氫酶的alra(tani等人,appl.environ.microbiol.66:5231-5235(2000))；來(lái)自釀酒酵母的adh2(atsumi等人,nature451:86-89(2008))；來(lái)自大腸桿菌的yqhd，其偏好長(zhǎng)于c(3)的分子(sulzenbacher等人,journalofmolecularbiology342:489-502(2004))；和來(lái)自丙酮丁醇梭菌的bdhi和bdhii，其將丁醛轉(zhuǎn)化為丁醇(walter等人,journalofbacteriology174:7149-7158(1992))。蛋白genbankid有機(jī)體alrabab12273.1不動(dòng)桿菌菌株m-1adh2np_014032.1釀酒酵母yqhdnp_417484.1大腸桿菌bdhinp_349892.1丙酮丁醇梭菌bdhiinp_349891.1丙酮丁醇梭菌展現(xiàn)4-羥基丁酸脫氫酶活性的酶(ec1.1.1.61)也屬于此范疇。所述酶已在真氧產(chǎn)堿桿菌(ralstoniaeutropha)(bravo等人,j.forensicsci.49:379-387(2004))、克氏梭菌(wolff和kenealy,proteinexpr.purif.6:206-212(1995))和擬南芥(arabidopsisthaliana)(breitkreuz等人,j.biol.chem.278:41552-41556(2003))中得到表征。蛋白genbankid有機(jī)體4hbdyp_726053.1真氧產(chǎn)堿桿菌h164hbdl21902.1克氏梭菌dsm5554hbdq94b07擬南芥如先前所述，在表達(dá)質(zhì)粒上克隆4-羥基丁酸合成所必需的非天然基因。宿主菌株也表達(dá)甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶活性、codh/acs活性和可能的pfor和氫化酶活性。此處，將這些(codh/acs等)基因整合到基因組中，并從可組成性使用或與誘導(dǎo)子(即pa1-laco1可在含laci的細(xì)胞中誘導(dǎo)，或者在其它方面是組成性的)一起使用的啟動(dòng)子開(kāi)始表達(dá)。一旦4-羥基丁酸的表達(dá)和產(chǎn)率得到優(yōu)化，即可通過(guò)在中性位點(diǎn)整合單拷貝的這些基因來(lái)進(jìn)一步修飾基礎(chǔ)菌株。鑒于基因的數(shù)量相對(duì)有限(最少5種且最多6種)，可構(gòu)建編碼所需基因的人工操縱子。使用整合質(zhì)粒引入所述操縱子，并將其與例如桿菌sacb基因所允許的反選擇方法偶聯(lián)(link等人,jbacteriol.179:6228-6237(1997))。如此可在大腸桿菌染色體的任何位置產(chǎn)生無(wú)標(biāo)記且無(wú)痕的插入。優(yōu)化涉及改變基因次序以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)和啟動(dòng)子。如先前所述，在表達(dá)質(zhì)粒上克隆1,4-丁二醇合成所必需的非天然基因。宿主菌株也表達(dá)甲醇甲基轉(zhuǎn)移酶活性、codh/acs活性和可能的pfor和氫化酶活性。此處，將這些(codh/acs等)基因整合到基因組中，并從可組成性使用或與誘導(dǎo)子(即pa1-laco1可在含laci的細(xì)胞中誘導(dǎo)，或者在其它方面是組成性的)一起使用的啟動(dòng)子開(kāi)始表達(dá)。一旦1,4-丁二醇的表達(dá)和產(chǎn)率得到優(yōu)化，即可通過(guò)在中性位點(diǎn)整合單拷貝的這些基因來(lái)進(jìn)一步修飾基礎(chǔ)菌株。鑒于基因的數(shù)量相對(duì)有限(最少5種且最多6種)，可構(gòu)建編碼所需基因的人工操縱子。使用整合質(zhì)粒引入所述操縱子，并將其與例如桿菌sacb基因所允許的反選擇方法偶聯(lián)(link等人,jbacteriol.179:6228-6237(1997))。如此可在大腸桿菌染色體的任何位置產(chǎn)生無(wú)標(biāo)記且無(wú)痕的插入。優(yōu)化涉及改變基因次序以及核糖體結(jié)合位點(diǎn)和啟動(dòng)子。本申請(qǐng)案通篇引用了各種公開(kāi)案。這些公開(kāi)案的公開(kāi)內(nèi)容是以引用的方式全部并入到本申請(qǐng)案中，以便更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的發(fā)展水平。雖然已經(jīng)參考上文提供的實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是應(yīng)了解在不脫離本發(fā)明精神的情況下可進(jìn)行各種修改。當(dāng)前第1頁(yè)12