本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中，抗菌肽改構(gòu)的多肽及其在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：基因治療是利用正常的基因來替代或填補(bǔ)基因疾病中某些病變或缺失基因的一種治療方法。它能夠廣泛地治療各類先天性和后天性疾病，通過調(diào)節(jié)控制生物活性蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)進(jìn)而達(dá)到抑制疾病惡化的效果，治療甚至治愈疾病，但由于缺乏安全高效的載體，其臨床應(yīng)用受到一定的限制。目前，基因載體主要分病毒型和非病毒型兩大類。病毒載體是目前基因治療的主要工具，但存在安全隱患和免疫原性，體內(nèi)不能反復(fù)應(yīng)用。非病毒載體是病毒載體的重要補(bǔ)充途徑，轉(zhuǎn)染效率較低，但一般比病毒載體安全，體內(nèi)可反復(fù)應(yīng)用?；诒磉_(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，目前人們努力改善非病毒載體。作為非病毒載體的陽離子多聚物有多聚賴氨酸、魚精蛋白、多聚精氨酸、聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)、殼聚糖等。1995年OtmanBoussif報(bào)道了PEI可作為非病毒載體，而后，其成為陽離子多聚物研究領(lǐng)域最快的物質(zhì)。然而，PEI/DNA復(fù)合物被細(xì)胞吞噬后不能有效從內(nèi)含體釋放是其轉(zhuǎn)染效率相對低下的主要原因。研究表明，蜂毒肽melittin能夠增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染，其原理是利用melittin對細(xì)胞膜的穿透作用(打孔)增加PEI/DNA從內(nèi)含體釋放及進(jìn)入細(xì)胞核的能力，進(jìn)而增加基因轉(zhuǎn)染效率，此后，melittin被用于交聯(lián)多種基因載體，促進(jìn)其從內(nèi)含體釋放及進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而增加基因轉(zhuǎn)染效率。然而melittin在中性pH條件下的細(xì)胞毒性較大，阻礙了其應(yīng)用。但是，此策略也存在矛盾：melittin的穿膜活性對促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染非常重要，但是也會(huì)產(chǎn)生很高的細(xì)胞毒性。因此，如何在增加轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，降低細(xì)胞毒性是一個(gè)急需解決的問題。本申請的發(fā)明人在前期的研究中發(fā)現(xiàn)來自塔氏蛙(Ranatagoi)的melittin相關(guān)肽AR-23和來自加州紅腿蛙(Ranadraytonii)的RV-23均有較強(qiáng)的抗菌作用，從溶血率曲線上看，與melittin相比，AR-23及RV-23細(xì)胞毒性明顯較低。AR-23和RV-23均由23個(gè)氨基酸殘基組成。其中，AR-23與melittin有78％的同源性，有與melittin完全一致的亮氨酸拉鏈的結(jié)構(gòu)，但其C端只有3個(gè)氨基酸。RV-23的亮氨酸和異亮氨酸數(shù)目與melittin完全一樣，不同的是它并不形成亮氨酸拉鏈的結(jié)構(gòu)。相比之下，RV-23其抗菌活性與melittin及AR-23相差不大，但毒性遠(yuǎn)低于melittin和AR-23。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何在不影響細(xì)胞活性的情況下提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的多肽。本發(fā)明所提供的多肽，為下述A1)或A2)：A1)將AR-23的第8位、第11位、第17位、第21位和第23位的氨基酸殘基經(jīng)過一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的多肽；A2)將RV-23的第1位、第8位、第11位、第17位、第21位和第22位的氨基酸殘基經(jīng)過一個(gè)或兩個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的多肽。上述多肽中，AR-23的氨基酸序列可為序列表中序列1。RV-23的氨基酸序列可為序列表中序列2。上述多肽中，A1)所述多肽可為將AR-23進(jìn)行下述M1-M5這五種中的五種、四種、三種、兩種或一種突變得到的衍生物：M1、將AR-23的第8位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu；M2、將AR-23的第11位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu；M3、將AR-23的第17位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu；M4、將AR-23的第21位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu；M5、將AR-23的第23位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu。A2)所述多肽可為將RV-23進(jìn)行下述N1-N6這六種中的六種、五種、四種、三種、兩種或一種突變得到的衍生物：N1、將RV-23的第1位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu；N2、將RV-23的第8位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu；N3、將RV-23的第11位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu；N4、將RV-23的第17位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu；N5、將RV-23的第21位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu；N6、將RV-23的第22位氨基酸殘基突變?yōu)镚lu。上述多肽中，A1)所述多肽可為A11)-A16)中的任一種：A11)序列表中序列6所示的多肽(將其命名為AE4)；A12)序列表中序列5所示的多肽(將其命名為AE3)；A13)序列表中序列7所示的多肽(將其命名為AE5)；A14)序列表中序列8所示的多肽(將其命名為AE6)；A15)序列表中序列4所示的多肽(將其命名為AE2)；A16)序列表中序列3所示的多肽(將其命名為AE1)；A2)所述多肽為序列表中序列9所示的多肽(將其命名為RE)。上述多肽可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與所述多肽相關(guān)的生物材料。本發(fā)明所提供的與所述多肽相關(guān)的生物材料，為下述B1)至B16)中的任一種：B1)編碼所述多肽的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；B4)含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物；B6)含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物；B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；B9)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系；B10)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系；B11)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系；B12)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系；B13)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；B14)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；B15)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；B16)含有B4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。上述生物材料中，所述核酸分子可為如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：1)編碼所述多肽的DNA分子；2)編碼所述多肽的cDNA分子3)與1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述多肽的cDNA分子或基因組DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述多肽的cDNA分子或基因組DNA分子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對本發(fā)明的編碼所述多肽的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明的所述多肽的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼所述多肽且具有抑菌作用，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的編碼所述多肽的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，B2)所述的含有編碼所述多肽的核酸分子的表達(dá)盒，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述多肽的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)所述多肽基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止所述多肽基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述多肽基因表達(dá)盒的重組載體。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，B5)-B8)所述的微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌。上述生物材料中，B9)-B16)所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系均不包括繁殖材料。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述多肽或所述生物材料的下述任一應(yīng)用：X1、在作為細(xì)胞轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑中的應(yīng)用；X2、在作為細(xì)胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)品中的應(yīng)用；X3、在制備細(xì)胞轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑中的應(yīng)用；X4、在制備細(xì)胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)品中的應(yīng)用；X5、在提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率中的應(yīng)用；X6、在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)染可為陽離子聚合物介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。所述陽離子聚合物可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。所述陽離子聚合物可為聚乙烯亞胺。上述應(yīng)用中，所述細(xì)胞可為m1或m2：m1、動(dòng)物細(xì)胞；m2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如HeLa細(xì)胞或HepG2細(xì)胞)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了細(xì)胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的細(xì)胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)品，包括下述Y1-Y4中的任一種：Y1、所述多肽；Y2、所述生物材料；Y3、所述多肽與可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的陽離子聚合物；Y4、所述生物材料與可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的陽離子聚合物。上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)品可僅以上述Y1-Y4中的任一種作為其活性成分，還可以將上述Y1-Y4中的任一種與其他物質(zhì)一起作為其活性成分。上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)品中，所述陽離子聚合物可為聚乙烯亞胺。上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)品中，所述細(xì)胞可為m1或m2：m1、動(dòng)物細(xì)胞；m2、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如HeLa細(xì)胞或HepG2細(xì)胞)。本發(fā)明提供了一組由抗菌肽改構(gòu)的得到的多肽。這些多肽與初始抗菌肽相比，在酸性環(huán)境的溶血能力顯著增強(qiáng)并且在中性環(huán)境的溶血能力降低，這些多肽還可以增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，但對其細(xì)胞活性影響不大。將AR-23經(jīng)改構(gòu)得到的衍生多肽——AE4、AE3、AE2、AE5與AE6均可以降低其細(xì)胞毒性：AE4、AE3與AE2在酸性條件下的溶血率均顯著高于相應(yīng)多肽在中性條件下的溶血率；AE5在酸性條件下的溶血率也具有高于相應(yīng)多肽在中性條件下的溶血率的趨勢；AE6在濃度為160μM時(shí)，其在酸性條件下的溶血率顯著高于在中性條件下的溶血率。將RV-23改構(gòu)得到的衍生多肽RE在酸性條件下的溶血率顯著高于其在中性條件下的溶血率。與PEI/DNA相比，將AR-23經(jīng)改構(gòu)得到的衍生多肽——AE1、AE2、AE3、AE4、AE5和AE6與PEI/DNA混合后，對Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較PEI/DNA復(fù)合物分別提高至6.4倍、11.9倍、51.9倍、32.0倍、30.8倍和24.0倍，對HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較PEI/DNA復(fù)合物分別提高至2.5倍、2.6倍、3.8倍、3.7倍、3.6倍和5.2倍，而AR-23與PEI/DNA混合后對Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別是PEI/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的0.2倍和1.4倍；與PEI/DNA相比，將RV-23改構(gòu)得到的衍生多肽RE與PEI/DNA混合后，對Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較PEI/DNA分別提高至42.0倍和8.3倍，而RV-23與PEI/DNA混合后對Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別是PEI/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的1.2倍和0.1倍，因此，AR-23和RV-23幾乎不增加PEI/DNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和HepG-2細(xì)胞的能力。本發(fā)明的多肽與可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的陽離子聚合物(如聚乙烯亞胺(PEI))連用能夠明顯增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率。表明，本發(fā)明的多肽可作為細(xì)胞轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑，提高陽離子聚合物介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率。附圖說明圖1為不同多肽在不同pH溶液中的溶血活性。圖2為不同多肽增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的對HeLa細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。圖3為不同多肽增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的對HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。圖4為多肽轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后對其細(xì)胞活性的影響。圖5為多肽轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后對其細(xì)胞活性的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中的HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞為國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)產(chǎn)品，HeLa細(xì)胞的資源編號為3111C0001CCC000011，HepG2細(xì)胞的資源編號為3111C0001CCC000035。下述實(shí)施例中的熒光素梅質(zhì)粒(pGL3-ControlVectorpGL3)為Promega公司產(chǎn)品，貨號E1471；lipofectamine2000為ThermoFishSCIENTIFIC公司產(chǎn)品，貨號為11668027；聚乙烯亞胺(PEI)為SIGMA公司產(chǎn)品，貨號為408727。實(shí)施例1、抗菌肽AR-23和RV-23的衍生多肽在促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用本實(shí)施例所提供的多肽為AE1、AE2、AE3、AE4、AE5、AE6和RE。AE1為將抗菌肽AR-23(序列表中序列1)的第11位的賴氨酸殘基替換為谷氨酸殘基得到的衍生多肽；AE2為把AE1的第21位的賴氨酸殘基替換為谷氨酸殘基得到的衍生多肽；AE3為把AE2的第23位的精氨酸殘基替換為谷氨酸殘基得到的衍生多肽；AE4為把AE3的第8位的丙氨酸殘基替換為谷氨酸殘基得到的衍生多肽；AE5為把AE3的第17位的異亮氨酸殘基替換為谷氨酸殘基得到的衍生多肽；AE6為把AE5的第8位的丙氨酸殘基替換為谷氨酸殘基得到的衍生多肽；RE為把抗菌肽RV-23(序列表中序列2)的第1位和第8位的精氨酸殘基以及第11位、第17位、第21位和第22位的賴氨酸殘基分別替換為谷氨酸殘基得到的衍生多肽，人工合成各多肽，各多肽的氨基酸序列如表1所示。表1、多肽氨基酸序列一、多肽溶血能力測定按照如下方法分別測定AE1、AE2、AE3、AE4、AE5、AE6和RE的溶血能力，分別利用AR-23和RV-23作為對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次：首先配置pH5.0(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸，pH5.0)和pH7.4(150mM氯化鈉20mMHepespH7.4)的兩種緩沖液。將人新鮮檸檬酸鈉抗凝外周血用pH5.0的緩沖液洗三次，并用pH5.0的緩沖液配成1.25％壓積的紅細(xì)胞懸液，混勻，取160μl到96孔板中；用pH5.0的緩沖液溶解多肽配置多肽溶液，各多肽溶液的濃度均分別為800、400、200、100、50、25μM；取40μl多肽溶液加入到含有160μl紅細(xì)胞懸液的96孔板中，混勻，每孔含有40μl多肽溶液與160μl紅細(xì)胞懸液，每種濃度的多肽溶液一個(gè)孔，每孔均含有一種多肽，使得每孔中紅細(xì)胞壓積均為1％，每種多肽均有以下濃度：160、80、40、20、10、5μM；利用pH5.0的緩沖液替換多肽溶液的無多肽孔作為陰性對照；利用TritonX100替換多肽溶液的含有0.1％(v/v)TritonX100的孔作為陽性對照；均設(shè)三個(gè)復(fù)孔；37℃孵育30min，800×g離心5min，吸取100μl上清到新的96孔板，檢測OD450值。根據(jù)公式：溶血率＝(OD450實(shí)驗(yàn)-OD450陰性對照)/(OD450陽性對照-OD450陰性對照)×100％，計(jì)算各多肽在pH5.0的緩沖液中的溶血率(表2與圖1)。按照上述方法，將pH5.0的緩沖液替換為pH7.4的緩沖液，其他步驟均不變，計(jì)算各多肽在pH7.4的緩沖液中的溶血率(表3與圖1)。表2、多肽在pH5.0的緩沖液中的溶血作用表3、多肽在pH7.4的緩沖液中的溶血作用結(jié)果顯示，AR-23和AE1在酸性條件(pH5.0)下的溶血率均比在中性條件(pH7.4)下的溶血率低；AE4、AE3與AE2在酸性條件(pH5.0)下的溶血率均顯著高于相應(yīng)多肽在中性條件(pH7.4)下的溶血率；AE5在酸性條件(pH5.0)下的溶血率也具有高于相應(yīng)多肽在中性條件(pH7.4)下的溶血率的趨勢；AE6在濃度為160μM時(shí)，其在酸性條件(pH5.0)下的溶血率顯著高于在中性條件(pH7.4)下的溶血率，而在其他濃度下，AE6在酸性條件(pH5.0)下與在中性條件(pH7.4)下的溶血率無顯著差異。表明，將AR-23經(jīng)改構(gòu)得到的衍生多肽——AE4、AE3、AE2、AE5與AE6均可以降低其細(xì)胞毒性。RV-23在酸性條件(pH5.0)下的溶血率比在中性條件(pH7.4)下的溶血率低，而將RV-23改構(gòu)得到的衍生多肽RE在酸性條件(pH5.0)下的溶血率顯著高于其在中性條件(pH7.4)下的溶血率，表明，將RV-23改構(gòu)得到的衍生多肽RE可以降低其細(xì)胞毒性。二、多肽對聚乙烯亞胺(PEI)介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率影響按照如下方法分別測定AE1、AE2、AE3、AE4、AE5、AE6和RE在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的作用，分別利用AR-23和RV-23作為對照，轉(zhuǎn)染細(xì)胞為HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次：將PEI用無血清DMEM培養(yǎng)基配成5.335μg/ml的PEI溶液，將熒光素梅質(zhì)粒(pGL3-ControlVectorpGL3)用無血清DMEM培養(yǎng)基配成8μg/ml的質(zhì)粒溶液，將AR-23、RV-23和AE1分別利用無血清DMEM培養(yǎng)基配成濃度均為10μM的AR-23溶液、RV-23溶液和AE1溶液，將RE、AE2、AE3、AE4、AE5和AE6分別利用無血清DMEM培養(yǎng)基配成濃度均為40μMRE溶液、AE2溶液、AE3溶液、AE4溶液、AE5溶液和AE6溶液；將各多肽溶液分別與質(zhì)粒溶液等體積混勻，室溫孵育15min，得到含有不同多肽與質(zhì)粒的混合液，再將PEI溶液分別與上述各混合液等體積混勻，室溫孵育15min，得到含有不同多肽的多肽/PEI/DNA復(fù)合物溶液。將無血清DMEM培養(yǎng)基與質(zhì)粒等體積混合后室溫孵育15min得到液體1，再將PEI溶液與液體1等體積混勻，室溫孵育15min，得到不含多肽的PEI/DNA復(fù)合物溶液，作為對照。將HeLa細(xì)胞按1.2×104/孔接種于含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的無菌96孔板中，37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；吸去96孔板中培養(yǎng)基，將100μl不同的多肽/PEI/DNA復(fù)合物溶液分別加入96孔板中，每孔一種多肽/PEI/DNA復(fù)合物溶液，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔；利用lipofectamine2000作為陽性對照，利用PEI/DNA復(fù)合物溶液作為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，每孔加100μl含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，PBS輕柔洗三遍，用20μl細(xì)胞裂解液(Promega)裂解細(xì)胞，每孔取10μl用熒光檢測熒光值(所用試劑盒為PromegaE1501，所用儀器為PromegaGlomaxTM96microplateluminometer)。另取5μl用于測定每孔蛋白濃度(所用試劑盒為Thermo23227，所用儀器為SpectraMaxM5Molecular),計(jì)算轉(zhuǎn)染效率(表4和圖2)，轉(zhuǎn)染效率＝每孔的熒光值與每孔的蛋白含量比值。按照上述方法，將“將HeLa細(xì)胞按1.2×104/孔接種于無菌96孔板中”替換為“將HepG2細(xì)胞按1×104/孔接種于無菌96孔板中”，其他步驟均不變，計(jì)算多肽作用下的HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(表4和圖3)。表4、多肽作用下PEI介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(URL/mg蛋白)多肽HelaHepG2PEI/DNA+RV-236.90E+07±2.77E+075.34E+06±2.80E+06PEI/DNA+RE2.48E+09±2.65E+073.09E+08±7.25E+07PEI/DNA+AR-231.07E+07±4.34E+055.31E+07±1.24E+07PEI/DNA+AE13.78E+08±6.12E+079.31E+07±3.39E+07PEI/DNA+AE27.03E+08±4.12E+079.64E+07±1.26E+07PEI/DNA+AE33.06E+09±3.48E+081.40E+08±2.38E+07PEI/DNA+AE41.89E+09±9.89E+071.38E+08±2.21E+07PEI/DNA+AE51.82E+09±2.26E+081.35E+08±1.15E+07PEI/DNA+AE61.42E+09±7.19E+071.93E+08±1.78E+07PEI/DNA5.91E+07±1.16E+073.74E+07±9.27E+06Lipofectamine20008.35E+07±9.96E+064.08E+07±5.18E+06結(jié)果顯示，AE1、AE2、AE3、AE4、AE5、AE6和RE均能不同程度的增強(qiáng)PEI介導(dǎo)的對HeLa和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率：與PEI/DNA相比，將AR-23經(jīng)改構(gòu)得到的衍生多肽——AE1、AE2、AE3、AE4、AE5和AE6與PEI/DNA混合后，對Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較PEI/DNA復(fù)合物分別提高至6.4倍、11.9倍、51.9倍、32.0倍、30.8倍和24.0倍，對HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較PEI/DNA復(fù)合物分別提高至2.5倍、2.6倍、3.8倍、3.7倍、3.6倍和5.2倍，而AR-23與PEI/DNA混合后對Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別是PEI/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的0.2倍和1.4倍；與PEI/DNA相比，將RV-23改構(gòu)得到的衍生多肽RE與PEI/DNA混合后，對Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較PEI/DNA分別提高至42.0倍和8.3倍，而RV-23與PEI/DNA混合后對Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別是PEI/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的1.2倍和0.1倍。AR-23和RV-23幾乎不增加PEI/DNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和HepG-2細(xì)胞的能力，將AR-23經(jīng)改構(gòu)得到的衍生多肽——AE1、AE2、AE3、AE4、AE5和AE6和將RV-23改構(gòu)得到的衍生多肽RE均能顯著提高PEI介導(dǎo)的對HeLa和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率：與AR-23相比，AE1、AE2、AE3、AE4、AE5和AE6作用下Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別提高至35.3倍、65.7倍、286.0倍、176.6倍、170.1倍和132.7倍，HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別提高至1.8倍、1.8倍、2.6倍、2.6倍、2.5倍和3.6倍；與RV-23相比，RE作用下Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別提高至35.9倍和57.9倍。三、多肽在細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)對細(xì)胞活性的影響按照如下方法分別測定AE1、AE2、AE3、AE4、AE5、AE6和RE在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中對細(xì)胞活性的影響，分別利用AR-23和RV-23作為對照，轉(zhuǎn)染細(xì)胞為HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次：將HeLa細(xì)胞按1.2×104/孔接種于含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的無菌96孔板中，37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；吸去96孔板中培養(yǎng)基，將100μl不同的多肽/PEI/DNA復(fù)合物溶液分別加入96孔板中，每孔一種多肽/PEI/DNA復(fù)合物溶液，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔；lipofectamine2000和PEI/DNA復(fù)合物溶液作為對照，只含有無血清DMEM培養(yǎng)基作為調(diào)零孔組作為空白對照，只含有無血清DMEM培養(yǎng)基和細(xì)胞作為陽性對照，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，每孔加100μl含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，每孔加20μl5mg/ml的MTT，孵育4小時(shí)，棄上清，向每孔中加入150μlDMSO，震蕩后檢測OD490，根據(jù)公式計(jì)算各孔的細(xì)胞活性：細(xì)胞活性＝(OD490實(shí)驗(yàn)-OD490陰性對照)/(OD490陽性對照-OD490陰性對照)×100％，結(jié)果如下表5和圖4。按照上述方法，將“將HeLa細(xì)胞按1.2×104/孔接種于無菌96孔板中”替換為“將HepG2細(xì)胞按1×104/孔接種于無菌96孔板中”，其他步驟均不變，計(jì)算各孔的細(xì)胞活性(表5和圖5)。表5、多肽在細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)HeLa細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性(％)結(jié)果顯示，AE1、AE2、AE3、AE4、AE5、AE6和RE在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的細(xì)胞活性均高于Lipofectamine2000處理的細(xì)胞活性，且與PEI/DNA復(fù)合物處理的細(xì)胞活性差異不大，表明，AE1、AE2、AE3、AE4、AE5、AE6和RE可以提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，但對細(xì)胞活性的影響不大。<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所<120>抗菌肽改構(gòu)的多肽及其在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用<160>9<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>1AlaIleGlySerIleLeuGlyAlaLeuAlaLysGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleLysAsnArg20<210>2<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2ArgIleGlyValLeuLeuAlaArgLeuProLysLeuPheSerLeuPhe151015LysLeuMetGlyLysLysVal20<210>3<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>3AlaIleGlySerIleLeuGlyAlaLeuAlaGluGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleLysAsnArg20<210>4<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>4AlaIleGlySerIleLeuGlyAlaLeuAlaGluGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleGluAsnArg20<210>5<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>5AlaIleGlySerIleLeuGlyAlaLeuAlaGluGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleGluAsnGlu20<210>6<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>6AlaIleGlySerIleLeuGlyGluLeuAlaGluGlyLeuProThrLeu151015IleSerTrpIleGluAsnGlu20<210>7<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>7AlaIleGlySerIleLeuGlyAlaLeuAlaGluGlyLeuProThrLeu151015GluSerTrpIleGluAsnGlu20<210>8<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>8AlaIleGlySerIleLeuGlyGluLeuAlaGluGlyLeuProThrLeu151015GluSerTrpIleGluAsnGlu20<210>9<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>9GluIleGlyValLeuLeuAlaGluLeuProGluLeuPheSerLeuPhe151015GluLeuMetGlyGluGluVal20當(dāng)前第1頁1 2 3