本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00472表達(dá)量的引物、檢測(cè)試劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

口腔頜面部惡性腫瘤是常見(jiàn)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，容易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。研究表明，這種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，其中抑癌基因的失活與癌基因的激活發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。

長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200nt、缺少特異完整的開(kāi)放閱讀框、無(wú)或很少有蛋白編碼功能的RNAs分子。最近的研究表明，lncRNAs通過(guò)在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平廣泛調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，它們參與了生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老及死亡等重要生命活動(dòng)的調(diào)控。越來(lái)越多的研究表明lncRNAs的異常表達(dá)或功能缺失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一些lncRNAs分子在腫瘤的診斷和治療方面具有重要的意義，且可以作為腫瘤預(yù)后判斷新的分子標(biāo)記。目前，已經(jīng)克隆的人類(lèi)lncRNAs基因已超過(guò)4萬(wàn)多個(gè)，但絕大部分lncRNA的功能未知。

我們檢測(cè)了LINC00472在臨床離體腫瘤樣本中的表達(dá)水平，并分析了LINC00472表達(dá)水平與臨床病例資料的相關(guān)性。我們從口腔腫瘤及相對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照組織中抽提RNA后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)了LINC00472的表達(dá)情況，結(jié)果顯示LINC00472在口腔腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。我們隨后又利用原位雜交的方法，進(jìn)一步在存檔石蠟樣本驗(yàn)證了LINC00472在口腔腫瘤中表達(dá)顯著下調(diào)，因此針對(duì)LINC00472的檢測(cè)制劑可用于口腔腫瘤的輔助診斷，結(jié)合臨床回訪資料進(jìn)行生存曲線分析發(fā)現(xiàn)LINC00472表達(dá)低的患者其生存時(shí)間短于該lncRNA表達(dá)高的患者，因此針對(duì)該lncRNA的檢測(cè)制劑也可以用于口腔腫瘤的預(yù)后判斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)口腔腫瘤組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00472表達(dá)量的試劑的應(yīng)用，所述的試劑用于制備口腔腫瘤輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)制劑，該長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00472的序列見(jiàn)SEQ NO:1。

所述的口腔腫瘤輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)制劑是根據(jù)長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00472在口腔腫瘤中的表達(dá)情況來(lái)進(jìn)行輔助診斷和療效預(yù)測(cè)，口腔腫瘤組織中LINC00472表達(dá)顯著下調(diào)。

所述的口腔腫瘤輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)制劑為實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑。

所述的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑中包含

用于實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)LINC00472表達(dá)的引物序列：

正向引物：5’-GCATCTGTCAACGCTCCTCT-3’，

反向引物：5’-CCGCGTTCTTTGTGTGTCTC-3’。

所述的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)制劑包含：

內(nèi)參基因GAPDH特異性PCR引物：

正向引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

試劑中還含有：

(1)從口腔腫瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無(wú)酶水；

(2)以總RNA為模板將LncRNA LINC00472逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及隨機(jī)引物；

(3)將cDNA實(shí)時(shí)定量PCR所用試劑，包括實(shí)時(shí)熒光定量SYBR染料、無(wú)酶水。

我們從口腔腫瘤及正?？谇簧掀颖局谐樘酭NA后逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)了LINC00472的表達(dá)，結(jié)果顯示LINC00472在口腔腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。提示LINC00472可作為口腔腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志。本發(fā)明為口腔腫瘤的輔助診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工具，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)口腔腫瘤離體樣本中LINC00472的表達(dá)水平；

LINC00472在口腔腫瘤(T)中的表達(dá)比正常對(duì)照(N)樣本中顯著下調(diào)；

圖2原位雜交檢測(cè)LINC00472在口腔腫瘤及正常口腔粘膜中的表達(dá)；

左圖為正?？谇徽衬そM織，右圖為口腔腫瘤組織，(放大倍數(shù)：200×)，LINC00472在口腔腫瘤中表達(dá)水平較低；

圖3為口腔腫瘤中LINC00472的表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性；

LINC00472高表達(dá)的患者預(yù)后比LINC00472低表達(dá)或不表達(dá)者好，即LINC00472低表達(dá)或不表達(dá)的患者更快死亡。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

實(shí)施例1，實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)證實(shí)LINC00472在口腔腫瘤中表達(dá)下調(diào)

1.材料與方法：

9例正?？谇徽衬ず?例口腔腫瘤組織抽提總RNA，2μg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

正向引物：5’-GCATCTGTCAACGCTCCTCT-3’，

反向引物：5’-CCGCGTTCTTTGTGTGTCTC-3’。

用于對(duì)照的內(nèi)參看家基因GAPDH特異性PCR引物：

正向引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’

反向引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)步驟

反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，各基因的表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)CT值(threshold cycle values)、內(nèi)參基因(GAPDH)標(biāo)化后，采用group t-test檢驗(yàn)計(jì)算P值。

2.結(jié)果

LncRNA LINC00472在正常對(duì)照組織中表達(dá)較低，而在口腔腫瘤組織中低表達(dá)或者不表達(dá)P<0.001(圖1)

實(shí)施例2，原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LINC00472在口腔腫瘤中的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)

1.材料方法

1.1用于口腔腫瘤和正常對(duì)照組織原位雜交的寡核苷酸探針

根椐LINC00472基因序列分析設(shè)計(jì)出雜交參數(shù)最佳特異性最好的3條寡核苷酸探針，另外，以看家基因GAPDH為陽(yáng)性對(duì)照。

用于原位雜交檢測(cè)LINC00472表達(dá)的寡核苷酸探針：

LINC00472探針1：5’-CAAAACTAGGATTCTGTCTTTGAGGCAGAC-3’

LINC00472探針2：5’-AAGAATGGAAGTGGGAAGAGAGAAAGACTT-3’；

LINC00472探針3：5’-TAATTCAGGGGTATCCGTCTTAGTTTAGGC-3’。

陽(yáng)性對(duì)照探針(檢測(cè)看家基因GAPDH)：

GAPDH探針1：5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'

GAPDH探針2：5'-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'

GAPDH探針3：5’-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3’。

寡核苷酸探針采用化學(xué)合成方法合成

1.2寡核苷酸探針標(biāo)記試劑盒和原位雜交檢測(cè)試劑

Dig Oligonucleitide Tailing Kit(2^nd Generation)試劑盒(Roche公司)，抗地高辛-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物檢測(cè)試劑盒(Anti-Digoxigenin-POD，F(xiàn)ab fragments，Roche公司)。增強(qiáng)原位表達(dá)檢測(cè)信號(hào)的TSA信號(hào)放大系統(tǒng)(TSA^TM Biotin System，NEL700試劑盒，PerkinElmer公司)。DAB染色試劑盒(北京中山公司)。20×SSC，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去離子甲酰胺(Deionized Formamide)，多聚腺苷酸(polyadenylic acid，Poly A)，多聚脫氧腺苷酸(polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，變性剪切的蛙精DNA(denatured and sheared salmon spermDNA，ssDNA)，酵母轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(yeast t-RNA，tRNA)，DTT，50×Denhardts’s solution，PBSbuffer，胃蛋白酶K，BSA(牛血清清蛋白)，三乙醇胺(TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.5％Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCL，0.05％Tween 20)醋酸酐，阻斷試劑(Blocking reagent agent，Roche公司)。

1.3其他主要試劑和材料

無(wú)水乙醇、90％酒精、70％酒精、50％酒精、松節(jié)油、雙蒸水、PBS緩沖液(pH7.2～7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/L)；3％甲醇-雙氧水溶液(80％甲醇和30％雙氧水配置)；0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(citrate buffer,CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M檸檬酸溶液和41ml 0.1M檸檬酸鈉溶液加入450ml蒸餾水中臨時(shí)配置后再校正工作液pH值)；0.1％胰蛋白酶；蘇木素；1％鹽酸酒精(1ml濃鹽酸+99ml 70％酒精配置)；組織微陣列專用封片膠(PTS Cure MountⅡ)；專用蓋玻片(480×240mm²)定制于鄭州玻璃儀器廠。Leica低熔點(diǎn)(58℃)石蠟，國(guó)產(chǎn)蜂蠟，無(wú)水酒精，二甲苯，10％中性多聚甲醛(0.01mol/L,pH7.4，DEPC雙蒸水和PBS緩沖液配制)，蘇木素，伊紅，中性封片樹(shù)膠，蓋玻片，載玻片。

1.4寡核苷酸探針的標(biāo)記

利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit進(jìn)行寡核苷酸探針標(biāo)記，反應(yīng)體系如下。

100pmol oligonucleotide+ddH2O＝9μl(control:control oligonucleutide 5μl+ddH₂O 4μl)

混勻，稍離心。37℃水浴反應(yīng)30min，加2ul EDTA(0.2M，pH 8.0)中止反應(yīng)。

1.5寡核苷酸探針標(biāo)記后純化

為了增加標(biāo)記探針的純度，需對(duì)已標(biāo)記的探針進(jìn)行純化，具體操作如下：

a)探針?lè)磻?yīng)混合物(22μl)+2.5μl 4M LiCL+75μl 100％冷乙醇(-20℃).

b)-70℃沉淀60min，or-20℃2h。

c)13.000×g 4℃離心15min。

d)棄上清，用50μl冰冷的70％(V/V)乙醇洗滌。

e)13.000xg 4℃，離心5min。

f)棄上清，真空4℃干燥。

g)用無(wú)菌雙蒸水重溶探針。

1.6組織切片雜交前處理

a)4℃保存的組織切片置于58℃烤片30min，熔化表面石蠟。

b)二甲苯依次脫蠟3×5min。

c)梯級(jí)酒精洗滌，100％酒精2×2min→95％酒精1×5min→70％酒精1×5min→50％酒精1×5min→DEPC水洗滌2×3min→DEPC-PBS洗滌2×5min。

d)滴加300μl胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37℃消化20min。

e)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗滌1min，中止反應(yīng)。

f)切片入0.2N HCL，于37℃反應(yīng)20-30min，增加組織的通透性。

g)切片用4％多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定10min，室溫。

h)為了增加組織陽(yáng)性雜交強(qiáng)度，對(duì)切片進(jìn)行乙酰化處理。切片入0.25％乙酸酐BufferⅠ(0.1M三乙醇胺)，室溫10min。

i)1M PBS洗滌2×5min。

1.7組織預(yù)雜交和雜交

a)預(yù)雜交：-20℃保存的預(yù)雜交液，先置于37℃孵育60min，預(yù)雜交液的用量為每平方厘米切片面積12.5μl，相應(yīng)大小的石蠟?zāi)じ采w切片，37℃濕盒中預(yù)雜交2小時(shí)。(預(yù)雜交液成份包括：2XSSC，10％Dextran sulphate，1X Denhardt’s solution，50mM Phosphate Buffer(PH 7.0)，50mM DTT，250μl，100μg/ml poly A，5μg/ml poly dA，250μg/ml yeast t-RNA，500μg/ml ssDNA，47％Deionized formamide)。

b)移去石蠟?zāi)?，甩掉預(yù)雜交液，切片置于2×SSC中5min。

c)雜交反應(yīng)：37℃雜交過(guò)夜(18-20h)。每一切片加入250μl雜交液并用石蠟?zāi)じ采w。預(yù)雜交液中加入相應(yīng)的探針就成為雜交液。雜交液在預(yù)雜交時(shí)配制，放置37℃孵育，使探針充分溶解于雜交液中，本實(shí)驗(yàn)用多條寡核苷酸探針混合，按每一探針500ng/ml濃度配制成探針雜交液。地高辛加尾標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針濃度計(jì)算依據(jù)：每一探針的濃度按其與陽(yáng)性定量探針時(shí)檢測(cè)反應(yīng)時(shí)顯色進(jìn)行比對(duì)和100pmol 30個(gè)堿基的裸探針標(biāo)記反應(yīng)理論探針產(chǎn)量為900ng兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合計(jì)算出標(biāo)記探針的濃度。

d)雜交后洗滌，切片浸入2×SSC，10min，揭去石蠟?zāi)?。依次于搖床上搖動(dòng)洗滌，2×SSC(0.5％SDS)，2×15min→0.25×SSC(0.5％SDS)，2×15min。

1.8雜交后顯色檢測(cè)反應(yīng)

a)采用Anti-Digoxigenin-POD檢測(cè)地高辛探針與目的RNA結(jié)合復(fù)合物；TSA放大系統(tǒng)增強(qiáng)原位雜交反應(yīng)顯色反應(yīng)的陽(yáng)性信號(hào)，DAB顯色。

b)切片轉(zhuǎn)至TNT緩沖液中，3×5min。

c)滴加TNB阻斷緩沖液，300μl/TMAs，室溫，30min。

d)不洗，吸去多余阻斷劑，1:100稀釋的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1％TritonX-100+1％阻斷劑)，室溫4小時(shí)。

e)TNT Buffer(0.1M Tris-HCl,PH7.5,0.15M NaCL,0.05％Tween 20)洗3×5min。

f)切片上滴加信號(hào)放大試劑Biotinyl Tyamid，300μl/TMAs，(Biotinyl Tyramid貯存液：Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMSO，Biotinyl Tyramid工作液：1×稀釋液，1:50稀釋Biotinyl Tyramid貯存液)，室溫10分鐘。

g)TNT洗，3×5min。

h)切片滴加SA-HRP(鏈霉卵白素-辣根過(guò)氧化物酶)，300μl/TMAs，室溫30min。

i)TNT洗，3×5min。

j)蒸溜水洗滌，1×1min。

k)DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)。

l)蘇木素復(fù)染，

m)酒精梯級(jí)脫水，切片干燥。

n)滴加組織切片專用封片膠，相應(yīng)規(guī)格的蓋玻片蓋片，切片膠帶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)配備的紫外燈下交聯(lián)切片1min。

1.9結(jié)果判斷及標(biāo)準(zhǔn)

應(yīng)用光學(xué)顯微鏡分別在低倍和高倍鏡下進(jìn)行觀察，首先觀察目標(biāo)RNA的陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)在觀察目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的定位：位于細(xì)胞核、細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。

再分別以該檢測(cè)RNA表達(dá)部位陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)度和陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合評(píng)分，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：(1)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度判斷：a.細(xì)胞無(wú)染色，記0分；b.細(xì)胞染成淺棕色為弱陽(yáng)性，記1分；c.細(xì)胞染成棕色且無(wú)背景著色，或細(xì)胞染成深棕色并有淺棕色背景為中等陽(yáng)性，記2分；d.細(xì)胞染成深棕色且無(wú)背景著色為強(qiáng)陽(yáng)性，記3分。(2)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)計(jì)分：a.無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，記0分；b.陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≤25％，記1分；c.25％＜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜50％，記2分；d.陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≥50％，記3分。

為了盡量降低評(píng)分結(jié)果的主觀因素，由兩位病理學(xué)專家分別按上述標(biāo)準(zhǔn)之一各自進(jìn)行判斷和評(píng)分，再將兩者評(píng)分相乘，結(jié)果為：①0分者最終計(jì)為0分，認(rèn)為陰性表達(dá)；②1分和2分者最終計(jì)為1分，認(rèn)為弱陽(yáng)性表達(dá)；③3分和4分者最終計(jì)為2分，認(rèn)為中等陽(yáng)性表達(dá)；④6分到9分者最終計(jì)為3分，認(rèn)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

1.10分析和統(tǒng)計(jì)軟件

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用χ²test或Fisher exact test，相關(guān)性分析采用Spearmen correlation方法；P＜0.05即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存曲線分析采用Kaplan-Meier method及l(fā)og-rank test；多變量分析采用Cox’s proportional hazards model；P＜0.05即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

1)lncRNA LINC00472在口腔腫瘤及正常對(duì)照組織中的表達(dá)

LINC00472在正常對(duì)照組織中均有表達(dá)(圖2左)，而在大部分口腔腫瘤組織中表達(dá)較低或不表達(dá)(圖2右)，兩者之間具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2)Kaplan-Meier生存分析

我們對(duì)所有69例口腔腫瘤患者進(jìn)行了電話隨訪，詳細(xì)詢問(wèn)了他們的首發(fā)時(shí)間、治療情況、有無(wú)復(fù)發(fā)、有無(wú)再患其他疾病、復(fù)發(fā)及死亡時(shí)間等，并登記了生存時(shí)間和狀態(tài)，并對(duì)口腔腫瘤組織中LINC00472的表達(dá)與病人的生存時(shí)間和狀態(tài)進(jìn)行的生存分析，發(fā)現(xiàn)LINC00472高表達(dá)的患者生存時(shí)間較LINC00472表達(dá)低或者不表達(dá)的患者要長(zhǎng)(圖3)。說(shuō)明LINC00472是一個(gè)與口腔腫瘤預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記，該lncRNA表達(dá)低，病人預(yù)后差。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大學(xué)

<120> 檢測(cè)口腔腫瘤組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00472表達(dá)量的試劑的應(yīng)用

<130> 無(wú)

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9515

<212> RNA

<213> 長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00472的序列

<400> 1

augcgaggcu ggggccgguu gccuaccggc cgcuucucgc cgaggcaguc cagacuuuuc 60

ccccggcggu gcccgcucca agacagcauc ugucaacgcu ccucuucucc ccuccuccuc 120

cugccgggcc gggcuccgcc ggcugcggcc gagaggacgc gggacccggc gcggugagcc 180

caucagcugu caggcgagcg gcgaagcggc uggagggcgg cgagagacac acaaagaacg 240

cggugggcgg cggcggcgaa aggggacggc aacuccuccc cgcgcccgcc ggugccaccg 300

ccggccgugc uuguuccgag gccgcgcaga caaugcggcc gggcucgucc ccgcgugccc 360

cagagugcgg agcgcccgcg cucccccgac cccaacuuga ccgucucccg gcucgcccag 420

cccccucccg ggguaggggc gcccccuccc uccgguggcc ggcgaaggaa gucgguccgc 480

ggccgcagau cccggcaacu ugcgaaccgg gaaaaguuug cggcgccucc gcggggcggc 540

gcgacgcggc ccgccccucg cguccgcggu caucgcgggu gacuuucucg acucgucguc 600

agccggggcc gcagcgcggc cgguggggac ugcggggcgg gccggagucc guccgagggc 660

ucccgcaccu cgggcugcgg auuucaggua cuccacuggg cauuuucucu ucauggagcu 720

uauagcaaca aaaguguuuu acaaaacacc agacauguug gcaucaucuc uuaguugggc 780

cauguggcca gggaacccuu caugaaacca ccucugcagu ccuggagagu ugcuguagaa 840

gaaggaaaag agaggaagac aacacaacac aggaggggau aaguaccucu ggacacaaug 900

gaaguaguag uuguugagca gagggaaagg gauaggagaa ggauguggac ugcagugcug 960

cagugccagg uaauaacuuu gaucauguac cuccuuggcu caggugcugu cucuucuacu 1020

cuccuccuua cuuguacuac cuuauuuagc acuuaauuau auacuuucuu gacucacuuu 1080

gagacacacu gauuaugugg ucugccucaa agacagaauc cuaguuuugg auuuuagcau 1140

uacugaucua uagccuugca ggggcuuaag gauggcagcu gucucucucc cuugggaucu 1200

agcuuuugca aauauugaag ggaagagauu ucuuugaucu uauaggaaua gauccacagu 1260

uccucuccag auuugcuuuu auagagaagu gugugucacc aaaacaaugg agauacgguc 1320

agagaggccc cuacccccag aauuuuaaua uaauuuuacu uucuggggca uuuauucuug 1380

acaaauacuu ucucuccuau cagcucacuu guuccucaca aaaacccuau aagauauuaa 1440

uauuauuaaa cagaccccua ugaagcaccu caagucuuuc ucucuuccca cuuccauucu 1500

ugcacaccuu uugcuagacu agucucugcg uucaucacau cagguuucua aaauaaaagu 1560

ccccuaauaa cuuucuauuu guucucucau cauauugaac cuuuuuugcc uggcuuauaa 1620

gguggccuua aaaccccauu uuccucuaaa cauugucucu guaguucagg aauauggcag 1680

gcucaacacu augcuugagc ccauauugcu ucccucauua gugaugccuc cucucagacc 1740

acccagauuc uacucauucu ucaauuucca gcuucuccuu ggagccuucc cagaucauua 1800

gcuucuuaaa aaucccagcu uucucugaau ucugauggua gcccccguua uuuggacaau 1860

uauguccugg ucuuaaaguc cuaaugggaa aaaaaaguac augauggacu ucauguagag 1920

aagaaagcac uggacugagu uuuaagacag cugcuaagga gcugugugag ccaaaccagg 1980

uuacuuuacc ucucuggauc uauauuugcu gaucuguuaa guggagacaa uugggucaga 2040

uaaucuuggu ggucuuugcu uauucugagg uucuuggaca acuuggccua guucacgugg 2100

gaugggauug aagaucuuac ugaguucuug gauggaaaug ucaguaaugg gcacuuagug 2160

ccuucaggac uuguucuaua cuaucccaga aauuucugau gcuaaacuug gcaauuuuua 2220

aaugucauau uccuuuucuc caaacucuuu aaccacaaga auucagggaa gguuaugggg 2280

ggugacuuag uuaucuggau aauacauauu guggacaaua uagcauuauc cuugggaaug 2340

auuucauauu guugaauaaa uaggaucaac uucuugauaa accuuagucc caagcauuuc 2400

aucuucauug gauaguguua cauaguaaua uauuuauguu uucuuuuaau cauuucauaa 2460

cuuggaaaau acuaacauag ucaaaacucu aggguaggug auacaugagu uucuguagua 2520

aucugguugg agacauguug uaauucugua uauauaugua cauuuauccc augcauguua 2580

ugccuaaacu aagacggaua ccccugaauu aagaggugcu guuauacauu gaccaggcuu 2640

aagaauaucu cuuuaaagug ugucgacauu uaauugaccu uuggaaguuc auucuguuaa 2700

ucauacucaa agugcuaaag cuaugguuga cugcucuggu guuuuuauau ucauucgugc 2760

uuuagcauau aaauucuuca gcauaauugc uacuuauuua gcaagaguuu ccuuuauuug 2820

aaaaugugag uugugcuugu auuuuugugu cuuucuuucu uucuuucuuu uuuuaaacuu 2880

ugcuucaggc uggguagugg uagagguuug aauuaaaaug uuuuccuguc aguaguugua 2940

ugaggugugg cuucuuaauc uagaaguaau ggaaauuucu ugcuuaaaug aagugcacuu 3000

uucuuccugc agaaguuaga acucuuuuag acaagcuuaa cacuucaaaa cuguauaucu 3060

uuaacagaaa cuuuuggaaa uuuuuaaauu ccauuugugu agauuaaaaa uaucaaugcu 3120

aauacuuucu auuaaauaag gauuuaucua uuuucauaaa accucuaauu auauuccuug 3180

aauugcuaug aguagaauuu uguuguaaac acaauauuuu uaaaaaguca aauauauuuu 3240

aaaaaucuua acauuauauu acuauaacuu agagaacagg uguuuacaug uuuaaaauuu 3300

ucuaggccuu aaauuuguga aaucagucuu ucagaaguua uuuuuaauau aguuaucugu 3360

guuacagguu uauaaguuga cauuucaauu uaaaauuuuu ucaauuuaua uuucaaugac 3420

caggaaaaaa uaguuaaacu uauuccuaaa uuuuaauaga aaaauaaaaa accacauagu 3480

uguuaauuuc ugguaauuua ucuugagacu ccaggcaugu uuuuagaaca uuuuuaccuu 3540

aaaagcaauu uugaaauagg gaaauuaaag uuuaaagcag aguuuucacu uuaaugaggu 3600

aauuuuauac uucccagaua gguaggccca uauucaagaa cacucugauc ucuguuuaua 3660

guaaguuuug augccauuau aucauuuacu uauucacgca uuauaagcau aguagauagc 3720

cccauuguca cgaagcuggc auuauuuucu ugucugucau ucaauauugu ccccuuuuuu 3780

uuuucuguuu ucaucauagc cguccuuuuc auuuuauugu agcccugacu cgaaaugaaa 3840

guaaguuuga acucuuaaaa aagaguuccu caaacucuuu uuuaagaaua uacagugaaa 3900

ugucuuaaau aauauuaucu aaauaauacc uaaagaaugc aaaugacuug caaugcugaa 3960

uagucagaca caggauguuc caugcuaagg guagacucau auuuccacuu uauaaaaugu 4020

gguuucagaa aacaaauaga uguguuucuu ccuuaauaau uaguguuuca ggaccaaagu 4080

ugacuaaaua uggaaguuua agauaaaacc cgguuucuua gggaaucuuu cucaguccuu 4140

aguaauucug uagaauugau gauagagugg caacuucaau acacucagua uucuuuucug 4200

uuugaagucu guuuugccau uggaaaaaac uuauuguugu uugaauuugg guauauguau 4260

ucacagaugg uuuacuuuau uuuuauuuug uuuaaacaaa uacuuucaug ucccaaacac 4320

ugagacaugu uucauguccu aaacacuuua uaaauauuag aauauuuaau ccccuuaacu 4380

cuguaguuau aauuaucuuc auuuuacaau ugagaaaacu aagauacgac guuuuauuua 4440

augguaacgc cuuaaguaag gggagaguga uaaguguaag cagaguggaa aacuuaguag 4500

ugcuaaggag caacagaagu augugcaaga guuugggaag augugucugc uuggaaagga 4560

ucagggacuc agcugggauc agucuuaaag agcaacaugu ccucauuccu caauuuuaag 4620

ccuuugggcu cuagaaguaa agggcaaacu uagaggaggc acuccucagg uuucagcugc 4680

cuguuccggc cuggugaggu ggcuguacug gcucaugugu uucucauagg gcuacaugag 4740

ccuuuauguc uuaccuccuc cucauuucuu ggcugacucc ugcuuuuuug gaggguuuaa 4800

cuucucucuc agcuagaagg uuaggcauug caaauaccag uggauaauuu uuuucuuagc 4860

uuuaacccca gcccauuuca acccccucuu ugcccuuugu auauucuuuu gaaaauauga 4920

uccaguagug uuuaugaaug uguguugugu aaaauuuaga gauugauguu aaacaacaga 4980

auuaaaggac aaagcugucu uuuuuguugg aauuggggau gggagagcag cucaaagugg 5040

gaaauaugga gaaaggagag acauugugga aaagaagaga uaaauugagg ggaaaaaaag 5100

aggaugaaaa aaugaagaga gagaauuacu gaugugcuuc acacccacac cuccucucca 5160

acuucacagu aacagaggca augucacuau cuuuuaccug acaagugcuu uaccagggag 5220

uugugccugg caucguggga guggaaaauu uuucccuuuu gcauuuugag acuugggugu 5280

gcugcuuuaa gaugccacug guaucuaagu aauguuuguu uauacuggau auuuuucucu 5340

guagccuuug uggauuggac uuauaauaua aacaauauug uuagcagaac ugcagguacu 5400

cuauugcuau guuuauuuua uuaguuaaaa aacuaccaga gcccuaggac uucugagcac 5460

auuuagaaaa uaccagaggc aauuuuaaga cuagcauuag aaagaaagaa aagaauaaga 5520

auaaaacuaa gacuugcaua ccuuagaauc cuaaccaaug uggugauuuu uaaaaauuaa 5580

uguuucagag acucuaaauu aggguaguug guuucaucaa uuacauuuuu uaaguuaaua 5640

uaaagugcuu uuguauguaa auucucuuaa uagauaauuu agguaaaaug aaaguguggc 5700

auuuuuuguu ccauagaaug uaaaacuaac gucagaauaa gaauucuuuu gggaauuuag 5760

gauuuuuuug augcuucuca aaucaucugu aaugacuuuu auuuauagaa aagguagauu 5820

auucauuagu uuuuaugaaa aacacucagu uuaaauagcc ggguauggug gcgcauggcu 5880

guagucccag cuacucagga ggcugggcac gagaauugcu ugaaccugug aggcagaggu 5940

ugcagugagc caagaucgca ccacugcacu ccagccuggu ccagagugag auuccgucuc 6000

gaacaaaaca aaacaaaaau auugagcuaa ucuaaauggu aaaaaucuag auuugaagaa 6060

auuuauuuua aaauaguugu ucauuuguca aauagaaaag uaugaucuua gcagguuugg 6120

uuagaucccu aucugaaaca aaguaaacua aagauguuuu ucuugaucaa ugcauagcaa 6180

uaacugcugu ucaaacaugu gaggaaucac caguaaauug ggggauagaa agcaggaaaa 6240

ggagcuuuuu ucucuuauuu uuuuucauuu aucaguuuuu cccauuuguc cauccuuucc 6300

uauaaucaug gaaauuuuua uuuuuuacac uccucucccc auuuuuuuau ccuagauugc 6360

caccacacca agguuuucua gaguuaggca gaaagagaac cugggccuag augcuaaugg 6420

aaacuauccc augcuuucuc agacucucuu uccuccccag agacaagagg agcaaaacag 6480

gaguugaugg cucauugcug uugcuucugu ggcugcccug uuugguugac cugagcuuuu 6540

uuuaaaaacc uccacucuug acgcuuaacu cuaugaauaa aauuagggcc agucacacug 6600

uauuuucauc aucaguuauc ccuagugauu caaauuuagc acaaaccugc ugugaguaca 6660

uauuaauuag gugaauacag uagaaugcaa ucauaacaug agucuuuuaa uaacuauucu 6720

uuguuugauu uuuauuuuag aaguuugaag uuauuuuguu gaaaaucuag aaaaucuuua 6780

ugugagcaac ugagguucgg guagcccaca acaguuuaaa ucaaacauua acuugcagua 6840

aaacacuacu gaaagugucu uugauuuuga ggugcagaga gcuguuucaa guuaaguugc 6900

uauauuaguc uguucucaug cugcuaauaa agacauaccu gcaaccgggc aauuuauuaa 6960

aaaaaaaaag agguuuaauu gacugacagu uccacauggc uggggaggcc ucaccgucau 7020

ggugaaagag caagggaugu cuuacauggu ggcaggcaag aaguuugugc agaggaacuc 7080

cuguuuauaa aaccaccaga ucucaugaga cuuacucacu accaggagaa caggaugcgg 7140

gaaaccaccu cggugauuca guuaucugca ccuggcccca cccuugacac auguugauua 7200

uuacaauuca aggugagauu uggguaggua cacagccaaa ccauaucagc ugcccauucu 7260

ccugugcagu gacauaaagg ucugauaacc ugauuuaaag cuuggacucu aagauuuuuu 7320

uuuuucuuuu uuugagucag guuaucucug ucgcucaagc uggaguucag uggcaugaac 7380

agggcucauu gcagccucaa ccuuccaggu ucaagugauu cucuugccuc aaccuccuga 7440

guaucugggg cuacaggcau gugccaccgu gccaggcuaa uauuuuuauu uuuauuuuug 7500

uaaagauggg gucucacuuc ugggcucaag caaucuuucc ucagccuccc aaagugcugg 7560

gauuauaggu gcgagccacu gcacccugcu guaaagaauu ucauaucccu guuuucggug 7620

ugcuguguca cuguuugcca uggguaaagg uauaugaauc ucuuuuauuu ugcugcuugc 7680

aacccaauuc ccaugccaaa cccaauuugu auccaaacaa acaauauugg agacaaguuc 7740

uucuauagaa agcuucauaa gccaguuacu gacuacugug ucuguaaaua uacucaaacu 7800

auuuuguagu cuugcuauuu uaaaaaaugu gugggugugg gaagugaugu ugaaugaauu 7860

caggguaauu ggugguucuu uguauuagga aaacucacua guuaagggaa gucuguuuuc 7920

augauucaug uauguuuaac uuaaaaaaaa auucuuccau ccuucucucc aguuuccacu 7980

cuaccucaua aauucaagua augaaggaau uuaaauaaua gaauuuuaua acugaaagga 8040

uuuuggagag aaucuauuaa cccuccuacu acaguugagg aaauagaugu ccagugaggu 8100

caaaugagau cauguagcua guuuaaaaac ccaaauaaca uuuuaguagu uuguuuccau 8160

uaguaaacac uguucuguuu gauuugcccu aacauguuca uaaucagagu cauaauaagg 8220

aaaaaucacu aauaugugug ugguacuuuc uugugcauac cucagucacu ucucaaaaga 8280

ggucuguaag gugucgguau ccugguuucc auucagggag agaacagucu augagccuaa 8340

gagaccuguc ugugccaguc acuaucagaa cagucuaaug cuaugugucu uccuaccuug 8400

gcaaaagcau uggcuggucu cuggacaguu cucauagacc acaggauugg gcagggggga 8460

gccacaucuu cauguuaggg cucuaaccug uaccaauuau uaacuguugu cucuauuuca 8520

ucauuucuua aagggaaaaa aaagcacuuu uuaaagagca ugagauuuua aauuuuucaa 8580

aagaaggaug cuggaucauu auaaguaagg cauguuuuaa agaucuucuu aucaacagcu 8640

uaaaaauuag ccaguauaua cugaacaucc acuguauaaa aagcacauua uggggugcuc 8700

caguagguac agcagugauc gagacagaau cauagccuuc agggaagagg uauaugcaau 8760

guucucuccu uccaaagauu accuagauag agaacuguuc auaagaaaua ucuugguacu 8820

gucuacauua cucuugagau auaaaauaua uauuauuucu uacgucugaa augagucagu 8880

uguuucuaaa acaauuugua uuaaaguauu cacauuaaaa auuuguaaaa uacagaaaag 8940

uagagagaaa aaaucaugaa uuuuuaacau gguaaugauu auaucaguuu cguucuuggc 9000

guuucuuuaa cuugauggga uagcuaaugu uuuuugucau ugcauagcuu uguaaacuug 9060

uccuaaggau uauauaauuu cagcaugagu uaguuucuaa guaugucaga aaucuagcuu 9120

uuuuguggua auuguuguuu uacacaaaau gauuaauaaa agacucuaaa cuaaccuugg 9180

cuuuagaaau gcuuuuuaaa uuuuaaaaua gugaaugagu agcagauuac uuucuaguau 9240

uucuuuaagg ucaccaaaau cacuuaacuu gcuuaaaaua uugauggaaa uaucaacuac 9300

guacaguuga ccuaaauuag aaaugggugu uuuuuaaaua gugaaauuua uaaauauaau 9360

auguauauuu uaaaauacag uuuauauuau agaguuaugu uccucuguaa uaauuucucu 9420

uuacacugaa ucauguucag uuuuuauuau gcagauaauu uaaucuuaca gcuuugaucu 9480

uuuuuaaaaa auaaaacagc cauuuggagu cuaaa 9515

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 內(nèi)參基因GAPDH特異性PCR正向引物

<400> 2

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 內(nèi)參基因GAPDH特異性PCR反向引物

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> LINC00472正向引物

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

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<400> 5

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<212> DNA

<213> 原位雜交檢測(cè)LINC00472探針1

<400> 6

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<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 原位雜交檢測(cè)LINC00472探針2

<400> 7

aagaatggaa gtgggaagag agaaagactt 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 原位雜交檢測(cè)LINC00472探針3

<400> 8

taattcaggg gtatccgtct tagtttaggc 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> GAPDH探針1

<400> 9

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<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> GAPDH探針2

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gtcagaggag accacctggt gctcagtgta 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> GAPDH探針3

<400> 11

cagtagaggc agggatgatg ttctggagag 30