本發(fā)明屬于水生致病性弧菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種東風(fēng)螺致病性弧菌的快速顯色培養(yǎng)基及利用該培養(yǎng)基的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

弧菌病是威脅重要貝類(lèi)品種——東風(fēng)螺的重要疾病。自2006年起，多個(gè)沿海地區(qū)養(yǎng)殖的東風(fēng)螺頻頻出現(xiàn)多種病征如“腫吻”、“翻背”、“脫殼”等，導(dǎo)致其大量死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)反復(fù)研究和鑒定，發(fā)現(xiàn)以上多種病癥的病原均是弧菌，主要包括哈維弧菌(vibrioharveyi)和塔氏弧菌(v.tubiashii)。這2種弧菌也是近年來(lái)貝類(lèi)養(yǎng)殖中出現(xiàn)頻率最高的致病菌種類(lèi)。由各種弧菌引起的東風(fēng)螺弧菌病的病程較長(zhǎng)，死亡率高達(dá)50％～60％。研究發(fā)現(xiàn)，東風(fēng)螺在夏季易發(fā)東風(fēng)螺弧菌病，特別是連續(xù)高溫時(shí)，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病頻繁且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，而不同年份發(fā)病的時(shí)間未顯示明顯規(guī)律性。為了進(jìn)一步深入研究東風(fēng)螺弧菌病，需要對(duì)其病原體進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。

現(xiàn)有的病原菌的鑒定方法主要包括傳統(tǒng)檢測(cè)方法、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法等；但這些方法多數(shù)難以進(jìn)行快速估算病原菌的數(shù)量，且難以在短時(shí)間內(nèi)獲得病原菌種資源并與其它弧菌迅速區(qū)分，非常不利于及時(shí)地對(duì)癥治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種東風(fēng)螺致病性弧菌的快速顯色培養(yǎng)基，該顯色培養(yǎng)基能針對(duì)東風(fēng)螺致病性弧菌進(jìn)行快速判別和分離培養(yǎng)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種利用本發(fā)明的快速顯色培養(yǎng)基進(jìn)行東風(fēng)螺致病性弧菌的檢測(cè)和估數(shù)的方法，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短、成本低。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種東風(fēng)螺致病性弧菌的快速顯色培養(yǎng)基，其特征在于：每1000ml東風(fēng)螺致病性弧菌的快速顯色培養(yǎng)基中含有蛋白胨10～15g、牛肉膏3～5g、蔗糖10～15g、氯化鈉15～25g、青霉素0.05～0.07g、鏈霉素1～2mg、克林霉素1～2mg、四環(huán)素0.025～0.05mg、利福平0.05～0.08mg、苯酚紅0.025～0.05g，最終ph為8.0～8.2。

優(yōu)選地，每1000ml所述的東風(fēng)螺致病性弧菌的快速顯色培養(yǎng)基含有蛋白胨10～12g、牛肉膏3～4g、蔗糖10～12g、氯化鈉20～22g、青霉素0.05～0.06g、鏈霉素1～1.5mg、克林霉素1～1.5mg、四環(huán)素0.025～0.03mg、利福平0.05～0.06mg、苯酚紅0.02～0.03g，蒸餾水1000ml定容，最終ph為8.0～8.2。

更優(yōu)選地，每1000ml所述的東風(fēng)螺致病性弧菌的快速顯色培養(yǎng)基含有：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、蔗糖10.0g、氯化鈉20.0g、青霉素0.05g、鏈霉素1mg、克林霉素1mg、四環(huán)素0.025mg、利福平0.05mg、苯酚紅0.025g，蒸餾水1000ml定容，最終ph為8.2。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中的快速顯色培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組成比例、鹽度、ph值等均非常利于東風(fēng)螺致病性弧菌的快速生長(zhǎng)。利用東風(fēng)螺致病性病原類(lèi)群對(duì)一定濃度下的青霉素、鏈霉素、克林霉素、四環(huán)素、利福平具抗性的特點(diǎn)，本培養(yǎng)基中添加了前述的幾種抗生素，以完全抑制其它非致病性的弧菌種類(lèi)的生長(zhǎng)，進(jìn)而能夠有效地將東風(fēng)螺致病性弧菌從其它細(xì)菌，包括對(duì)東風(fēng)螺不具致病性的其它弧菌中區(qū)分出來(lái)。通過(guò)苯酚紅的顯色時(shí)間，可以初步評(píng)估東風(fēng)螺致病性弧菌的數(shù)量級(jí)。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種利用上述的快速顯色培養(yǎng)基進(jìn)行東風(fēng)螺致病性弧菌的檢測(cè)和估數(shù)的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)制備快速顯色培養(yǎng)基：按上述的用量關(guān)系，取蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、氯化鈉和苯酚紅溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)ph值后，高壓滅菌并冷卻；根據(jù)上述的用量關(guān)系，再向冷卻后的混合物中依次加入青霉素、鏈霉素、克林霉素、四環(huán)素和利福平，使用蒸餾水定容后低溫保存待用；

(2)建立東風(fēng)螺致病性弧菌顯色時(shí)間表：取步驟(1)的顯色培養(yǎng)基，加入東風(fēng)螺致病性弧菌，配制成東風(fēng)螺致病性弧菌濃度梯度范圍為10⁵～10⁷cfu/ml的顯色反應(yīng)液，封口后培養(yǎng)并進(jìn)行顯色反應(yīng)，東風(fēng)螺致病性弧菌置于上述顯色培養(yǎng)基中顯示黃色，根據(jù)不同濃度的東風(fēng)螺致病性弧菌顯色反應(yīng)液完全顯色為黃色的顯示時(shí)間，建立顯色時(shí)間表如下：

(3)東風(fēng)螺致病性弧菌的檢測(cè)：取東風(fēng)螺組織樣品，置于步驟(1)的快速顯色培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)行顯色反應(yīng)；在顯色反應(yīng)過(guò)程中觀察樣品，其中樣品顏色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的是陽(yáng)性樣品，樣品顏色保持為紅色的是陰性樣品；記錄陽(yáng)性樣品完全變?yōu)辄S色的時(shí)間，根據(jù)步驟(2)的顯色時(shí)間表，初步確定東風(fēng)螺致病性弧菌的數(shù)量級(jí)。

上述檢測(cè)方法的原理是：東風(fēng)螺致病性弧菌在顯色培養(yǎng)基快速增殖后，其代謝產(chǎn)物形成的酸性環(huán)境可使顯色培養(yǎng)基中的苯酚紅指示劑轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。由于不同濃度的東風(fēng)螺致病性弧菌產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的速率不同，故樣品完全變色所需的時(shí)間也不同：樣品中的東風(fēng)螺致病性弧菌的濃度越高，樣品完全變色所需的時(shí)間越短。通過(guò)預(yù)先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制作不同濃度的東風(fēng)螺致病性弧菌所對(duì)應(yīng)的完全顯色時(shí)間的顯色時(shí)間表，可在正式檢測(cè)中通過(guò)測(cè)定樣品的完全顯色時(shí)間，初步評(píng)估樣品中的東風(fēng)螺致病性弧菌數(shù)量級(jí)。

在上述東風(fēng)螺致病性弧菌的快速顯色培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)和估數(shù)的方法中：

步驟(1)中高壓滅菌時(shí)的溫度優(yōu)選為115～121℃，時(shí)間優(yōu)選為15～20分鐘。

更優(yōu)選地，所述的高壓滅菌溫度為121℃，高壓滅菌時(shí)間為15分鐘。

步驟(1)中的冷卻優(yōu)選為冷卻至15～20℃。

步驟(2)和步驟(3)的培養(yǎng)方法優(yōu)選為：使用搖床培養(yǎng)箱進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30～37℃。

更優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)溫度為35℃。

步驟(3)中所述的組織樣品優(yōu)選為東風(fēng)螺的內(nèi)臟組織。

步驟(3)中所述的組織樣品與所述的快速顯色培養(yǎng)基的用量關(guān)系優(yōu)選為0.5～1.0g：7～8ml。

本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明的快速顯色培養(yǎng)基制作工藝簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高，能準(zhǔn)確地將東風(fēng)螺致病性弧菌從其它細(xì)菌，包括對(duì)東風(fēng)螺不具致病性的其它弧菌中區(qū)分出來(lái)，有利于東風(fēng)螺弧菌病的及時(shí)對(duì)癥治療；

(2)通過(guò)快速顯色培養(yǎng)基的顯色時(shí)間長(zhǎng)短，可對(duì)東風(fēng)螺致病性弧菌的數(shù)量進(jìn)行初步評(píng)估預(yù)測(cè)；從取樣到獲得結(jié)果只需數(shù)小時(shí)即可完成，操作步驟簡(jiǎn)單，不需要使用復(fù)雜的檢測(cè)儀器；

(3)本發(fā)明的快速顯色培養(yǎng)基以及利用該培養(yǎng)基進(jìn)行的東風(fēng)螺致病性弧菌的檢測(cè)和估數(shù)的方法成本較低，有利于在基層檢測(cè)部門(mén)推廣應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

在下文的實(shí)施例中，所使用的蛋白胨購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，所使用的牛肉膏購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，所使用的蔗糖購(gòu)自廣州威佳科技有限公司，所使用的氯化鈉購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司，所使用的青霉素購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，所使用的鏈霉素購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，所使用的克林霉素購(gòu)自梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，所使用的四環(huán)素購(gòu)自廣州威佳科技有限公司，所使用的利福平購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，所使用的苯酚紅購(gòu)自天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心。

實(shí)施例1

在本實(shí)施例中，東風(fēng)螺致病性弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、蔗糖10.0g、氯化鈉20.0g、青霉素0.05g、鏈霉素1mg、克林霉素1mg、四環(huán)素0.025mg、利福平0.05mg、苯酚紅0.025g，蒸餾水1000ml定容，最終ph為8.2。

一種利用上述的快速顯色培養(yǎng)基進(jìn)行東風(fēng)螺致病性弧菌的檢測(cè)和估數(shù)的方法，包括以下步驟：

1.按上述用量關(guān)系，取各原料蛋白胨、牛肉膏、蔗糖、氯化鈉和苯酚紅，溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)ph值為8.2后，在115～121℃的溫度下高壓滅菌后，冷卻至15～20℃。根據(jù)用量關(guān)系加入青霉素、鏈霉素、克林霉素、四環(huán)素、利福平，定容至1000ml，低溫保存待用；

2.建立東風(fēng)螺致病性弧菌顯色時(shí)間表：取上述選擇性顯色培養(yǎng)基，加入東風(fēng)螺致病性弧菌，配制成東風(fēng)螺致病性弧菌濃度梯度范圍為10⁵、10⁶、10⁷的顯色反應(yīng)液，封口后搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)，進(jìn)行顯色反應(yīng)，東風(fēng)螺致病性弧菌置于上述選擇性顯色培養(yǎng)基中顯示黃色，根據(jù)不同濃度的東風(fēng)螺致病性弧菌顯色反應(yīng)液完全顯色為黃色的顯示時(shí)間，建立顯色時(shí)間表如下：

表1

3.東風(fēng)螺致病性弧菌的檢測(cè)：取東風(fēng)螺樣品組織，置于上述選擇性顯色培養(yǎng)基中，封口后搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)，進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)過(guò)程中觀察樣品，其中樣品顏色顯示為黃色的是陽(yáng)性樣品，樣品顏色顯示為紅色的是陰性樣品，記錄陽(yáng)性樣品完全變?yōu)辄S色的時(shí)間，根據(jù)顯示時(shí)間表，確定東風(fēng)螺致病性弧菌的數(shù)量級(jí)。其中，搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)的溫度為30～35℃恒溫培養(yǎng)；顯色反應(yīng)時(shí)間為30～180分鐘；組織樣品為東風(fēng)螺的內(nèi)臟組織；東風(fēng)螺組織樣品與快速顯色培養(yǎng)基的用量關(guān)系可為0.5～1.0g：7～8ml。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1不同的是，東風(fēng)螺致病性弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基配方為：每1000ml培養(yǎng)基中含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、蔗糖10g、氯化鈉15g、青霉素0.06g、鏈霉素1.5mg、克林霉素1.5mg、四環(huán)素0.03mg、利福平0.06mg、苯酚紅0.03g，蒸餾水1000ml定容，最終ph為7.8～8.2。

實(shí)施例3

與實(shí)施例1不同的是，東風(fēng)螺致病性弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基配方為：每1000ml培養(yǎng)基中含有蛋白胨15g、牛肉膏5g、蔗糖15g、氯化鈉25g、青霉素0.06g、鏈霉素1.5mg、克林霉素1.5mg、四環(huán)素0.03mg、利福平0.06mg、苯酚紅0.03g，蒸餾水1000ml定容，最終ph為7.8～8.2。

實(shí)施例4

與實(shí)施例1不同的是，東風(fēng)螺致病性弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基配方為：每1000ml培養(yǎng)基中含有蛋白胨8g、牛肉膏4g、蔗糖10g、氯化鈉22g、青霉素0.05g、鏈霉素1mg、克林霉素1mg、四環(huán)素0.025mg、利福平0.05mg、苯酚紅0.025g，蒸餾水1000ml定容，最終ph為7.8～8.2。

實(shí)施例5

與實(shí)施例1不同的是，東風(fēng)螺致病性弧菌的選擇性顯色培養(yǎng)基配方為：每1000ml培養(yǎng)基中含有蛋白胨12g、牛肉膏3g、蔗糖12g、氯化鈉18g、青霉素0.05g、鏈霉素1mg、克林霉素1mg、四環(huán)素0.025mg、利福平0.05mg、苯酚紅0.022g，蒸餾水1000ml定容，最終ph為7.8～8.2。

實(shí)施例6

快速顯色培養(yǎng)基的特異性測(cè)試

步驟1：取19種不同的種類(lèi)的菌液10微升，分別加入按照實(shí)施例1的配比制成的19個(gè)快速顯色培養(yǎng)基中并編號(hào)，使每種菌種在培養(yǎng)基中的初始濃度為10⁷cfu/ml；

步驟2：將上述的19個(gè)含菌液的培養(yǎng)基以及1個(gè)未加入任何菌液的培養(yǎng)基封口，在搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)，進(jìn)行顯色反應(yīng)。將結(jié)果記錄于下表2：

表2

上表2的編號(hào)1～9來(lái)源于東風(fēng)螺內(nèi)臟組織的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株，并通過(guò)人工感染試驗(yàn)(王江勇等，《南方水產(chǎn)科學(xué)》，2013，9(5)：p94)確定對(duì)具有強(qiáng)致病性，能引起東風(fēng)螺腫吻、翻背、死亡等病癥。經(jīng)hsp60基因序列分析，鑒定出這9個(gè)菌株分別是塔氏弧菌(3株，菌株編號(hào)1、2、3)、哈維弧菌(3株，菌株編號(hào)1、2、3)、坎氏弧菌(1株)、溶藻弧菌(1株)和地中?；【?1株)；編號(hào)10～19均為對(duì)東風(fēng)螺無(wú)致病性、但與致病的弧菌同種的美人魚(yú)發(fā)光桿菌(引起魚(yú)類(lèi)結(jié)節(jié)病)、哈維弧菌(菌株編號(hào)4，引起鮑萎縮癥)、溶珊瑚弧菌(引起鮑苗脫落死亡)、哈維弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株)、副溶血弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株)、溶藻弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株)、創(chuàng)傷弧菌(標(biāo)準(zhǔn)株)、嗜水氣單胞菌(標(biāo)準(zhǔn)株)、金黃色葡萄球菌(標(biāo)準(zhǔn)株)和鏈球菌(標(biāo)準(zhǔn)株)；編號(hào)20為空白對(duì)照組。由結(jié)果可見(jiàn)，引起東風(fēng)螺病癥的菌株(1～9)經(jīng)本實(shí)施例的快速顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)后均呈陽(yáng)性結(jié)果，而對(duì)東風(fēng)螺無(wú)致病性的菌株(11～19)和空白對(duì)照組(20)均呈陰性結(jié)果。以上結(jié)果說(shuō)明本實(shí)施例的培養(yǎng)基具備特異性，能夠快速區(qū)分其它非弧菌的細(xì)菌種類(lèi)，且可以排除其它相近弧菌種類(lèi)的干擾，確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

使用實(shí)施例2～5的培養(yǎng)基進(jìn)行上述測(cè)試，均得到與表2相同的結(jié)果。

實(shí)施例7

本發(fā)明方法的靈敏性

在無(wú)菌操作條件下，取東風(fēng)螺致病菌用生理鹽水稀釋至10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷cfu/ml六種濃度梯度后，分別取100微升加到裝有7～8ml選擇性顯色培養(yǎng)基(實(shí)施例1中的配方)的試管中，試管封口，放入30～35℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中，進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)時(shí)間為25～180分鐘。顯色反應(yīng)過(guò)程中觀察樣品，其中樣品顏色顯示為黃色的是陽(yáng)性樣品，樣品顏色顯示為紅色的是陰性樣品，記錄陽(yáng)性樣品完全變?yōu)辄S色的時(shí)間，根據(jù)顯示時(shí)間表，確定東風(fēng)螺致病性弧菌的數(shù)量級(jí)與顯色時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

經(jīng)觀察，濃度為10⁵、10⁶、10⁷cfu/ml的樣品均可在3小時(shí)內(nèi)使培養(yǎng)基明顯變色，其中10⁷cfu/ml的樣品在24分鐘開(kāi)始變色，30分鐘后完全顯示黃色。與此相對(duì)，濃度為10²、10³、10⁴cfu/ml的東風(fēng)螺致病性弧菌的變色時(shí)間超過(guò)18小時(shí)，顯色不明顯。經(jīng)平板計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證，時(shí)間表推測(cè)的弧菌數(shù)量級(jí)基本對(duì)等，確定此實(shí)施方案可行，結(jié)果如下表3：

表3

使用實(shí)施例2～5的培養(yǎng)基進(jìn)行上述測(cè)試，均得到與上文相同的結(jié)果。

實(shí)施例8

在無(wú)菌操作條件下，分別取健康東風(fēng)螺和受弧菌感染發(fā)病的活體內(nèi)臟組織1.0g，用鑷子將待測(cè)組織分別放入裝有7～8ml選擇性顯色培養(yǎng)基(實(shí)施例1中的配方)的試管中，試管封口，放入30～37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中，進(jìn)行顯色反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為0.5～5小時(shí)，顯色反應(yīng)過(guò)程中觀察樣品，其中樣品顏色顯示為黃色的是陽(yáng)性樣品，樣品顏色顯示為紅色的是陰性樣品，記錄陽(yáng)性樣品完全變?yōu)辄S色的時(shí)間，根據(jù)顯示時(shí)間表(表1)，確定東風(fēng)螺致病性弧菌的數(shù)量級(jí)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表面，受致病性弧菌人工感染的東風(fēng)螺內(nèi)臟組織樣品在3～5小時(shí)使培養(yǎng)基開(kāi)始變色，弧菌濃度數(shù)量級(jí)大約在10^5～6cfu/ml，空白對(duì)照不能使培養(yǎng)基變色，在培養(yǎng)48小時(shí)后仍為紅色，經(jīng)平板計(jì)數(shù)結(jié)果驗(yàn)證，時(shí)間表推測(cè)的弧菌數(shù)量級(jí)基本對(duì)等，確定此實(shí)施方案可行。

實(shí)施例9

在無(wú)菌操作條件下，分別取健康東風(fēng)螺和受弧菌感染發(fā)病的內(nèi)臟組織0.5g，用鑷子將待測(cè)組織分別放入裝有7～8ml選擇性顯色培養(yǎng)基(實(shí)施例1中的配方)的試管中，試管封口，放入30～37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中，進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)時(shí)間為25～180分鐘，顯色反應(yīng)過(guò)程中觀察樣品，其中樣品顏色顯示為黃色的是陽(yáng)性樣品，樣品顏色顯示為紅色的是陰性樣品，記錄陽(yáng)性樣品完全變?yōu)辄S色的時(shí)間，根據(jù)顯色時(shí)間表(表1)，確定東風(fēng)螺致病性弧菌的數(shù)量級(jí)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受致病性弧菌人工感染的東風(fēng)螺內(nèi)臟組織樣品在3～5小時(shí)使培養(yǎng)基開(kāi)始變色，弧菌濃度數(shù)量級(jí)大約在10^5～6cfu/ml，健康東風(fēng)螺內(nèi)臟組織不能使培養(yǎng)基變色，在培養(yǎng)48小時(shí)后仍為紅色。經(jīng)平板計(jì)數(shù)結(jié)果驗(yàn)證，時(shí)間表推測(cè)的弧菌數(shù)量級(jí)基本對(duì)等，確定此實(shí)施方案可行。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。