本發(fā)明涉及通過正負(fù)電荷引入改善病毒樣顆粒自組裝和穩(wěn)定性的研究及應(yīng)用，屬于生物材料中的納米載體研究領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

病毒樣顆粒(virus-like particle,VLP)是由病毒衣殼結(jié)構(gòu)蛋白自組裝而形成的空心納米顆粒，不含病毒本身的核酸遺傳物質(zhì)而沒有感染性。但VLP具有與天然病毒相近的結(jié)構(gòu)特征，因此具有很強的免疫原性和生物學(xué)活性，適合進(jìn)行相關(guān)疫苗的研發(fā)。例如，能夠抵御乙型肝炎病毒(HBV)和人乳頭瘤病毒(HPV)的VLP疫苗已經(jīng)成功地應(yīng)用于臨床。此外，VLP還可作為載體平臺，通過化學(xué)偶聯(lián)或基因融合的方式形成嵌合型VLP，或者包裹核酸或小分子。因此，病毒樣顆粒作為一種蛋白類的納米顆粒，在免疫學(xué)、基因診斷、藥物輸送和材料學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。例如，鼠多瘤病毒樣顆粒呈二十面體，直徑45nm，由72個向右歪斜排列的衣殼粒組成，而每個衣殼粒包含5個主要衣殼蛋白VP1。研究報道，結(jié)構(gòu)蛋白VP1表達(dá)純化后通常以衣殼粒(Cap)的五聚體形式存在。鼠多瘤病毒樣顆粒目前通常使用兩步透析法進(jìn)行自組裝。首先在自組裝緩沖液中透析17h，再轉(zhuǎn)入穩(wěn)定緩沖液中透析24h，流程復(fù)雜。因而，提高病毒樣顆粒的自組裝效率和穩(wěn)定性對其應(yīng)用研究具有重大意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提出一種通過正負(fù)電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法和應(yīng)用，該方法在鼠多瘤病毒樣顆粒的實驗驗證有效。通過該方法構(gòu)建鼠多瘤病毒樣顆粒的兩種突變體，m+VP1和m-VP1，按比例直接混合后能夠自組裝。紫外檢測和濁點變溫實驗證實正負(fù)電荷引入使病毒樣顆粒自組裝效率和熱穩(wěn)定性均得到提高。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種通過正負(fù)電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法，通過構(gòu)建病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)蛋白的兩種突變體，其一通過精氨酸或者賴氨酸等酸性氨基酸引入正電荷，另一通過谷氨酸或天冬氨酸等堿性氨基酸引入負(fù)電荷，通過正負(fù)電荷間的靜電吸引提高病毒樣顆粒的自組裝效率和穩(wěn)定性。

本發(fā)明在鼠多瘤病毒樣顆粒改造和自組裝強化中的應(yīng)用，步驟如下：

(1)通過基因工程操作在鼠多瘤病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的HI環(huán)上插入精氨酸，構(gòu)建帶正電的VP1突變體(m+VP1)，通過插入天冬氨酸構(gòu)建帶負(fù)電的VP1(m-VP1)，同時表達(dá)野生型VP1(wtVP1)；

(2)將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，發(fā)酵表達(dá)目標(biāo)蛋白；

(3)菌液處理，獲得含有目標(biāo)蛋白的上清液；

(4)通過GST親和柱分離純化VP1，使用凝血酶切割GST標(biāo)簽，使用凝膠過濾色譜分離去除GST標(biāo)簽，獲得純化的VP1；

(5)通過引入的正負(fù)電荷輔助VLP自組裝，獲得穩(wěn)定性好，易于自組裝的VLP突變體，mVLP。

所述步驟(1)的方法是：在帶有VP1基因的質(zhì)粒pGEX-4T中插入外源基因序列，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性在VP1的HI環(huán)分別插入精氨酸密碼子和天冬氨酸密碼子，構(gòu)建得質(zhì)粒pGEX-4T-m-VP1和pGEX-4T-m+VP1。

所述步驟(2)的方法是：將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，然后接種于氨芐氨青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)；再接種到氨芐氨青霉素的TB培養(yǎng)基中，養(yǎng)至菌懸液OD600為0.5～0.6；加入誘導(dǎo)劑IPTG，轉(zhuǎn)移至26℃下繼續(xù)培養(yǎng)20～30h，誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。

所述步驟(3)的方法是：收集菌體，加入預(yù)冷的緩沖液重懸菌體；冰水浴超聲破碎，以除去細(xì)胞碎片，獲得含有目標(biāo)蛋白的上清液。

所述步驟(4)的方法是：獲得的含有目標(biāo)蛋白的上清液通過GSTrap HP親和柱進(jìn)行分離：使用緩沖液平衡親和柱，使用洗脫緩沖液洗脫，獲得純化的目標(biāo)蛋白；使用凝血酶切除目標(biāo)蛋白連接的GST標(biāo)簽；凝膠過濾色譜去除GST標(biāo)簽以分離純化目標(biāo)蛋白。

所述步驟(5)的方法是：透析法自組裝或直接混合法自組裝。

本發(fā)明的正負(fù)電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法適用于構(gòu)建表面均勻分布正負(fù)電荷位點的病毒樣顆粒方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的正負(fù)電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法適用于多位點蛋白自組裝體方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的正負(fù)電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法提高病毒樣顆粒自組裝效率方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的正負(fù)電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法提高病毒樣顆粒穩(wěn)定性方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的正負(fù)電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法適用于多酶固定載體方面的用途

本發(fā)明通過正負(fù)電荷引入的方法改造鼠多瘤病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)蛋白，可以提高其自組裝效率和穩(wěn)定性。所得病毒樣顆粒突變體表面均勻分布正負(fù)電荷，可以通過靜電作用來固定兩種帶電不同的負(fù)載物，促進(jìn)生物類載體開發(fā)和多酶復(fù)合物等體系的構(gòu)建。

附圖說明

圖1：本發(fā)明構(gòu)建的突變型鼠多瘤病毒樣顆粒質(zhì)粒圖。

圖2：本發(fā)明的突變型鼠多瘤病毒樣顆粒的透射電鏡照片。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細(xì)描述，該實施例是用于解釋、而不以任何方式限制本發(fā)明。

本發(fā)明的正負(fù)電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝方法應(yīng)用于鼠多瘤病毒樣顆粒的技術(shù)方案概述如下：

(1)通過基因工程操作在鼠多瘤病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的HI環(huán)上插入精氨酸，構(gòu)建帶正電的VP1突變體(m+VP1)，通過插入天冬氨酸構(gòu)建帶負(fù)電的VP1(m-VP1)，同時表達(dá)野生型VP1(wtVP1)；

(2)將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，發(fā)酵表達(dá)目標(biāo)蛋白；

(3)菌液處理，獲得含有目標(biāo)蛋白的上清液；

(4)通過GST親和柱分離純化VP1，使用凝血酶切割GST標(biāo)簽，使用凝膠過濾色譜分離去除GST標(biāo)簽，獲得純化的VP1；

(5)通過引入的正負(fù)電荷輔助VLP自組裝，獲得穩(wěn)定性好，易于自組裝的VLP突變體，mVLP。

具體優(yōu)選各步驟如下，但不局限于此，凡是達(dá)到本發(fā)明目的的方法，都使用本發(fā)明。

所述步驟(1)的方法如下：

在帶有VP1基因的質(zhì)粒pGEX-4T中插入外源基因序列，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性在VP1的HI環(huán)分別插入精氨酸密碼子和天冬氨酸密碼子，構(gòu)建得質(zhì)粒pGEX-4T-m-VP1和pGEX-4T-m+VP1，如圖1所示。

所述步驟(2)的方法如下：

將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，然后接種于25mL含有50～100μg/mL氨芐氨青霉素的LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉)中，在37℃，170rpm條件培養(yǎng)10～15h；將種子液分別按1:100～1:1000的比例接種到250mL含50～100μg/mL氨芐氨青霉素的TB培養(yǎng)基(12g/L胰蛋白胨，24g/L酵母提取物，0.4％(v/v)甘油，2.31g/L KH₂PO₄，12.54g/L K₂HPO₄)中，在37℃，170rpm條件培養(yǎng)至菌懸液OD600為0.5～0.6。加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度0.2～0.3mmol/L)，轉(zhuǎn)移至26℃下繼續(xù)培養(yǎng)20～30h，誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)；

所述步驟(3)的方法如下：

菌液在4℃，4000～5000rpm離心15～30min，收集菌體，加入預(yù)冷的L緩沖液(50mM Tris，pH 7.4，1mM EDTA，5％甘油，200mM NaCl，4mM DTT)重懸菌體，250mL菌液離心獲得的菌體加60～100mL重懸液；冰水浴超聲破碎，破碎條件為：200～400W，40％輸出功率，工作4s，間歇6s，70～100個循環(huán)。破菌液在4℃，10000～12000rpm離心15～30min以除去細(xì)胞碎片，獲得含有目標(biāo)蛋白的上清液。

所述步驟(4)的方法如下：

獲得的含有目標(biāo)蛋白的上清液通過5mL GSTrap HP親和柱進(jìn)行分離：使用L緩沖液以0.4～0.8mL/min的流速平衡親和柱，以0.3～0.6mL/min流速上樣，之后使用洗脫緩沖液E(40mM Tris，pH 8.0，10mM還原性谷胱甘肽，200mM NaCl，1mM EDTA，5％(v/v)甘油，5mM DTT)以0.4～0.6mL/min的流速洗脫，獲得純化的目標(biāo)蛋白。

使用凝血酶切除目標(biāo)蛋白連接的GST標(biāo)簽：將550μL純化目標(biāo)蛋白置于1.5mL的PE管中，加入0.3～0.6mg凝血酶，22℃酶切1.5～3.5h；

凝膠過濾色譜去除GST標(biāo)簽以分離純化目標(biāo)蛋白：使用LU緩沖液(40mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，5％(v/v)甘油，5mM DTT，0.5M尿素)以0.15～0.25mL/min的流速平衡凝膠過濾柱Superdex 200；將酶切后所得溶液以同樣流速上樣；使用LU緩沖液洗脫，保存出峰位置的蛋白，通過電泳驗證目標(biāo)蛋白。

所述步驟(5)的方法如下：

透析法自組裝：分離純化所得wtVP1和m+VP1，m-VP1按比例混合，室溫下置于透析袋(截留分子量8000～14000)中，先用自組裝緩沖液(0.5M(NH₄)₂SO₄，20mM Tris，pH 7.4,5％(v/v)甘油，1mM CaCl₂)透析17h，再轉(zhuǎn)入穩(wěn)定緩沖液(200mM NaCl，20mM Tris，pH 7.4，5％(v/v)甘油，1mM CaCl₂)中透析24h。

直接混合法自組裝：將分離純化所得wtVP1和m+VP1，m-VP1按比例混合，置于1.5mL PE管中，加入CaCl₂至終濃度為1mmol/L，室溫放置12～28h。

所得自組裝體系滴到碳支持膜銅片，晾干后使用2％磷鎢酸(pH 7.4)負(fù)染色，使用場發(fā)射透射電子顯微鏡觀察樣品形態(tài)，如圖2所示。

具體說明和驗證如下：

實施例1：鼠多瘤病毒樣顆粒突變體的質(zhì)粒構(gòu)建。

在帶有鼠多瘤病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的基因的質(zhì)粒pGEX-4T中插入外源基因序列。根據(jù)大腸桿菌E.coil BL21(DE3)密碼子偏好性在VP1的Arg²⁹⁴和Asn²⁹⁵之間對應(yīng)位點插入8個精氨酸密碼子(CGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGT)，構(gòu)建質(zhì)粒pGEX-4T-m-VP1；插入8個天冬氨酸密碼子(GATGATGATGATGATGATGATGAT)，構(gòu)建質(zhì)粒pGEX-4T-m+VP1。

實施例2：鼠多瘤病毒樣顆粒突變體的制備。

將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，然后接種于25mL含有100μg/mL氨芐氨青霉素的LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉)中，在37℃，170rpm條件培養(yǎng)12h。將種子液分別按1:1000的比例接種到250mL含100μg/mL氨芐氨青霉素的TB培養(yǎng)基(12g/L胰蛋白胨，24g/L酵母提取物，0.4％(v/v)甘油，2.31g/L KH₂PO₄，12.54g/L K₂HPO₄)中，在37℃，170rpm條件培養(yǎng)至菌懸液OD600為0.5～0.6。加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度0.3mmol/L)，轉(zhuǎn)移至26℃下繼續(xù)培養(yǎng)24h，誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。

菌液在4℃，4500rpm離心15min，收集菌體，加入預(yù)冷的L緩沖液(50mM Tris，pH 7.4，1mM EDTA，5％甘油，200mM NaCl，4mM DTT)重懸菌體，250mL菌液離心獲得的菌體加90mL重懸液。冰水浴超聲破碎，破碎條件為：300W，40％輸出功率，工作4s，間歇6s，90個循環(huán)。破菌液在4℃，12000rpm離心15min以除去細(xì)胞碎片，獲得含有目標(biāo)蛋白的上清液。

獲得的含有目標(biāo)蛋白wt VP1，或m-VP1，或m+VP1的上清液通過5mL GSTrap HP親和柱進(jìn)行分離：使用L緩沖液以0.5mL/min的流速平衡親和柱，以0.4mL/min流速上樣，之后使用洗脫緩沖液E(40mM Tris，pH 8.0，10mM還原性谷胱甘肽，200mM NaCl，1mM EDTA，5％(v/v)甘油，5mM DTT)以0.5mL/min的流速洗脫，獲得純化的目標(biāo)蛋白wtVP1，或m-VP1，或m+VP1。

使用凝血酶切除目標(biāo)蛋白連接的GST標(biāo)簽，將550μL純化目標(biāo)蛋白wt VP1，或m-VP1，或m+VP1置于1.5mL的PE管中，加入0.4mg凝血酶，22℃酶切3h；

使用LU緩沖液(40mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，5％(v/v)甘油，5mM DTT，0.5M尿素)以0.2mL/min的流速平衡凝膠過濾柱Superdex 200；將酶切后所得溶液以同樣流速上樣；使用LU緩沖液洗脫，保存出峰位置的蛋白，通過電泳驗證目標(biāo)蛋白。

實施例3：鼠多瘤病毒樣顆粒突變體的制備。

將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，然后接種于25mL含有75μg/mL氨芐氨青霉素的LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉)中，在37℃，170rpm條件培養(yǎng)10h。將種子液分別按1:500的比例接種到250mL含75μg/mL氨芐氨青霉素的TB培養(yǎng)基(12g/L胰蛋白胨，24g/L酵母提取物，0.4％(v/v)甘油，2.31g/L KH₂PO₄，12.54g/L K₂HPO₄)中，在37℃，170rpm條件培養(yǎng)至菌懸液OD600為0.5～0.6。加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度0.3mmol/L)，轉(zhuǎn)移至26℃下繼續(xù)培養(yǎng)30h，誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。

菌液在4℃，5000rpm離心20min，收集菌體，加入預(yù)冷的L緩沖液(50mM Tris，pH 7.4，1mM EDTA，5％甘油，200mM NaCl，4mM DTT)重懸菌體，250mL菌液離心獲得的菌體加100mL重懸液。冰水浴超聲破碎，破碎條件為：400W，40％輸出功率，工作4s，間歇6s，70個循環(huán)。破菌液在4℃，11000rpm離心20min以除去細(xì)胞碎片，獲得含有目標(biāo)蛋白的上清液。

獲得的含有目標(biāo)蛋白wt VP1，或m-VP1，或m+VP1的上清液通過5mL GSTrap HP親和柱進(jìn)行分離，使用L緩沖液以0.8mL/min的流速平衡親和柱，以0.6mL/min流速上樣，之后使用洗脫緩沖液E(40mM Tris，pH 8.0，10mM還原性谷胱甘肽，200mM NaCl，1mM EDTA，5％(v/v)甘油，5mM DTT)以0.6mL/min的流速洗脫，獲得純化的目標(biāo)蛋白wtVP1，或m-VP1，或m+VP1。

將550μL純化目標(biāo)蛋白wt VP1，或m-VP1，或m+VP1置于1.5mL的PE管中，加入0.6mg凝血酶，22℃酶切1.5h；

使用LU緩沖液(40mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，5％(v/v)甘油，5mM DTT，0.5M尿素)以0.25mL/min的流速平衡凝膠過濾柱Superdex 200。將酶切后所得溶液以同樣流速上樣。使用LU緩沖液洗脫，保存出峰位置的蛋白，通過電泳驗證目標(biāo)蛋白。

實施例4：鼠多瘤病毒樣顆粒突變體的制備。

將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，然后接種于25mL含有50μg/mL氨芐氨青霉素的LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉)中，在37℃，170rpm條件培養(yǎng)15h。將種子液分別按1:100的比例接種到250mL含50μg/mL氨芐氨青霉素的TB培養(yǎng)基(12g/L胰蛋白胨，24g/L酵母提取物，0.4％(v/v)甘油，2.31g/L KH₂PO₄，12.54g/L K₂HPO₄)中，在37℃，170rpm條件培養(yǎng)至菌懸液OD600為0.5～0.6。加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度0.3mmol/L)，轉(zhuǎn)移至26℃下繼續(xù)培養(yǎng)20h，誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。

菌液在4℃，4000rpm離心30min，收集菌體，加入預(yù)冷的L緩沖液(50mM Tris，pH 7.4，1mM EDTA，5％甘油，200mM NaCl，4mM DTT)重懸菌體，250mL菌液離心獲得的菌體加60mL重懸液。冰水浴超聲破碎，破碎條件為：200W，40％輸出功率，工作4s，間歇6s，100個循環(huán)。破菌液在4℃，10000rpm離心30min以除去細(xì)胞碎片，獲得含有目標(biāo)蛋白的上清液。

獲得的含有目標(biāo)蛋白wt VP1，或m-VP1，或m+VP1的上清液通過5mL GSTrap HP親和柱進(jìn)行分離，使用L緩沖液以0.4mL/min的流速平衡親和柱，以0.3mL/min流速上樣，之后使用洗脫緩沖液E(40mM Tris，pH 8.0，10mM還原性谷胱甘肽，200mM NaCl，1mM EDTA，5％(v/v)甘油，5mM DTT)以0.4mL/min的流速洗脫，獲得純化的目標(biāo)蛋白wtVP1，或m-VP1，或m+VP1。

將550μL純化目標(biāo)蛋白wt VP1，或m-VP1，或m+VP1置于1.5mL的PE管中，加入0.3mg凝血酶，22℃酶切3.5h；

使用LU緩沖液(40mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，1mM EDTA，5％(v/v)甘油，5mM DTT，0.5M尿素)以0.15mL/min的流速平衡凝膠過濾柱Superdex 200。將酶切后所得溶液以同樣流速上樣。使用LU緩沖液洗脫，保存出峰位置的蛋白，通過電泳驗證目標(biāo)蛋白。

實施例5：正負(fù)電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝。

分離純化所得wtVP1和m+VP1，m-VP1等比例混合，室溫下置于透析袋(截留分子量8000～14000)中，先用自組裝緩沖液(0.5M(NH₄)₂SO₄，20mM Tris，pH 7.4,5％(v/v)甘油，1mM CaCl₂)透析17h，再轉(zhuǎn)入穩(wěn)定緩沖液(200mM NaCl，20mM Tris，pH 7.4，5％(v/v)甘油，1mM CaCl₂)中透析24h。所得自組裝體系滴到碳支持膜銅片，晾干后使用2％磷鎢酸(pH 7.4)負(fù)染色，使用場發(fā)射透射電子顯微鏡觀察樣品形態(tài)，如圖2所示。

自組裝體的電鏡結(jié)果顯示，m+VP1：m-VP1等比例混合體系形成規(guī)則顆粒，如圖2所示，而同等條件的野生型體系沒有任何變化，說明正負(fù)電荷的引入能夠很好促進(jìn)病毒樣顆粒的自組裝。

表達(dá)純化所得VP1蛋白，包括wtVP1，m-VP1和m+VP1，均使用圓二色測定其二級結(jié)構(gòu)，掃描光譜范圍為190～260nm。

結(jié)果表明，m-VP1和m+VP1與wtVP1具有相同二級結(jié)構(gòu)，說明帶正電或帶負(fù)電序列的插入并不影響結(jié)構(gòu)蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

實施例6：病毒樣顆粒突變體的自組裝效率檢測。

牛血清白蛋白(BSA)通過去離子水溶解獲得濃度為50mg/mL的溶液。在96微量孔板上，每孔滴加300μL BSA溶液，于室溫下放置2h，封閉微孔中的結(jié)合位點。隨后每次使用200μL的自組裝緩沖液(0.5M(NH₄)₂SO₄，20mM Tris，pH 7.4，5％(v/v)甘油，1mM CaCl₂)潤洗微孔3次。

100μL wtVP1，m+VP1，m-VP1的等比例混合物(蛋白終濃度為0.15mg/mL)加入已封閉結(jié)合位點的微孔中，再各加入200μL自組裝緩沖液(0.5M(NH₄)₂SO₄，20mM Tris，pH 7.4,5％(v/v)甘油，1mM CaCl₂)，混勻后使用酶標(biāo)儀(Infinite M200，TECAN)檢測350nm的紫外吸收值，檢測持續(xù)17h。

結(jié)果表明，隨著自組裝時間推移，突變型VP1等比例混合物的OD₃₅₀增加速率快于野生型VP1，說明突變型結(jié)構(gòu)蛋白的自組裝效率高于野生型。

實施例7：突變型病毒樣顆粒的熱穩(wěn)定性檢測。

利用紫外可見分光光度計檢測wtVLP和mVLP的熱穩(wěn)定性。蛋白樣品分別溶解于穩(wěn)定緩沖液(200mM NaCl，20mM Tris，pH 7.4，5％(v/v)甘油，1mM CaCl₂)中，樣品終濃度為0.05mg/mL,檢測前使用0.22μm的濾膜過濾蛋白樣品。將1mL蛋白樣品置于1cm×1cm比色皿中，檢測逐漸遞增溫度時樣品在350nm處的紫外吸收，測溫范圍30～80℃。每個樣品測試三次，取平均值。

結(jié)果表明wtVLP的T_m為52℃，而mVLP的T_m為59.2℃，表明mVLP的熱穩(wěn)定性高于野生型。

綜上，實驗結(jié)果說明正負(fù)電荷的引入可以提高病毒樣顆粒的自組裝效率和熱穩(wěn)定性，該方法是一種改善病毒樣顆粒自組裝和穩(wěn)定性的有效方法。

本發(fā)明提出一種通過正負(fù)電荷引入輔助病毒樣顆粒自組裝的方法和應(yīng)用。無透析組裝、自組裝過程紫外吸光值實時檢測、紫外濁點檢測等實驗全面考察病毒樣顆粒的自組裝效率和熱穩(wěn)定性，已通過實施例進(jìn)行描述，相關(guān)技術(shù)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)。特別需要指出的是，所有相類似的替代和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。