本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測(cè)銅綠假單胞菌及喹諾酮類耐藥基因的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinasepolymeraseamplification，rpa)的引物及其應(yīng)用，具體涉及一種可同時(shí)檢測(cè)出銅綠假單胞菌及喹諾酮類耐藥基因(qnrs)的rpa快速檢測(cè)的引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
銅綠假單胞菌是醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一。患血液病、代謝性疾病和惡性腫瘤的患者，以及術(shù)后或某些治療后的患者易感染本菌。通過(guò)醫(yī)護(hù)人員可將病菌傳給病人，特別在灼傷和新生兒重癥監(jiān)護(hù)室，是重要的醫(yī)院內(nèi)病原菌。除醫(yī)院內(nèi)獲得感染外，hiv感染者很容易在社區(qū)獲得該菌的感染，而且一旦被銅綠假單胞菌感染，?？沙霈F(xiàn)晚期hiv感染的體征。如今由于廣譜抗生素、激素以及免疫抑制劑的廣泛使用，銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素快速產(chǎn)生耐藥性在臨床抗感染的一線戰(zhàn)場(chǎng)己是不爭(zhēng)的事實(shí)，對(duì)慶大霉素、頭孢噻甲羧肟、哌拉西林等亦早己產(chǎn)生不同程度的耐藥性，這就使得臨床的抗感染治療顯得越來(lái)越困難。而喹諾酮類藥物由于其敏感性極強(qiáng)，作用范圍廣，毒性低，價(jià)格適中的特點(diǎn)被廣泛的使用于銅綠假單胞感染病癥的治療中，然而近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)其耐藥菌發(fā)生率逐年增高，大量耐藥菌株的存在和流行使得由銅綠假單胞所引起疾病的發(fā)病率和死亡率不斷增加。這一現(xiàn)象引起世人的廣泛關(guān)注，因此我們急需一種快速準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的的現(xiàn)代檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)耐藥銅綠假單胞菌。
目前銅綠假單胞菌的檢測(cè)主要包括培養(yǎng)皿法-酶法(β-葡萄糖苷酸酶分析)、免疫法(抗原搜尋)、基因法(基因搜尋)，但在操作程序、檢測(cè)時(shí)間、特異性檢測(cè)等方面尚不理想。在近些年來(lái)科學(xué)家的不斷探究中，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinasepolymeraseamplification，rpa)檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生，它在現(xiàn)有體外核酸擴(kuò)增原理的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的恒溫體外快速擴(kuò)增核酸技術(shù)。研究人員只需根據(jù)所研究的樣品在對(duì)應(yīng)的生物靶標(biāo)基因序列中設(shè)計(jì)rpa對(duì)應(yīng)的特異性引物與探針(引物長(zhǎng)度通常需要達(dá)到30-38個(gè)堿基)，利用單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶(recombinase)、單鏈結(jié)合蛋白(ssb)和鏈置換dna聚合酶(polynerase)等三種特定酶，只需在25～43℃的恒溫條件下，便可實(shí)現(xiàn)特定核酸序列的擴(kuò)增且能在5～20min觀察到結(jié)果。對(duì)比我們常用的pcr技術(shù)，rpa的反應(yīng)更加快速便捷，實(shí)現(xiàn)恒溫?zé)o需不同的溫度環(huán)節(jié)，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的依賴性低，可降低實(shí)驗(yàn)成本，實(shí)現(xiàn)野外實(shí)時(shí)檢測(cè)。rpa的結(jié)果可通過(guò)瓊脂凝膠電泳檢測(cè)來(lái)讀取，也可以通過(guò)試紙條進(jìn)行讀取。
應(yīng)用rpa技術(shù)對(duì)樣品中銅綠假單胞菌中喹諾酮類耐藥基因進(jìn)行研究，在恒溫條件下5-20分鐘內(nèi)對(duì)靶基因進(jìn)行有效擴(kuò)增，在檢測(cè)銅綠假單胞菌的同時(shí)還可檢驗(yàn)銅綠假單胞菌中的喹諾酮類耐藥基因，對(duì)攜帶喹諾酮類耐藥基因的銅綠假單胞菌的研究提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，在醫(yī)藥衛(wèi)生，公共衛(wèi)生等方面有著重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可同時(shí)檢測(cè)銅綠假單胞菌及喹諾酮類耐藥基因(qnrs)的rpa快速檢測(cè)的引物序列。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下：
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明根據(jù)銅綠假單胞菌及喹諾酮類耐藥基因(qnrs)的特征靶基因設(shè)計(jì)出2對(duì)特異性引物f1/r1、f2/r2，見(jiàn)表1。各特異性引物具有高度種內(nèi)保守、種間特異性等優(yōu)點(diǎn)。擴(kuò)增后片段長(zhǎng)度大小各異，銅綠假單胞菌擴(kuò)增后產(chǎn)物大小為416bp，喹諾酮類耐藥基因(qnrs)擴(kuò)增后產(chǎn)物大小為202bp，可通過(guò)電泳進(jìn)行分開辨別。
表1、rpa快速檢測(cè)特異性引物序列
具體檢測(cè)方法包括以下步驟：
步驟(1).樣品dna提取
取1ml培養(yǎng)好的菌液加入至1.5ml離心管，12000g離心1min，棄上清，在離心管內(nèi)加入400μl裂解液，混勻后加600μl酚-氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入為該上清液0.8倍體積的異丙醇，12000g離心10min；取沉淀，用體積含量為70％的乙醇清洗1次，再在常溫或50℃下晾干20min，然后加入80μlph值為8.0的te緩沖溶液溶解，得到dna提取物；該dna提取物即為模板dna；將dna提取物采用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定模板dna的濃度與純度；
所述的酚-氯仿-異戊醇混合溶劑由酚、氯仿、異戊醇按照體積比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-異戊醇混合溶劑由氯仿、異戊醇按照體積比24∶1混合而成；
所述的te緩沖液為1ml濃度為1m、ph值為8.0的tris-cl，0.2ml濃度為0.5m、ph值為8.0的edta，定容至100ml溶液；
所述的裂解液為tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸鈉sds組成的混合液，其中tris-hcl的濃度為50mm、ph值為8.0，乙二胺四乙酸edta的濃度為25mm，nacl的濃度為100mm，蛋白酶k的濃度為20μg/μl，十二烷基硫酸鈉sds的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％；
步驟(2).rpa擴(kuò)增
將rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，進(jìn)行rpa擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
所述的rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系即rpa凝膠檢測(cè)體系為50μl由含有凍干酶粉的0.2mltwistampbasic反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydrationbuffer)29.5μl，去離子水11μl，混合引物6μl(10μmol/l)，提取的樣品基因組dna1μl，醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/l)組成。
將rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，放入37℃恒溫金屬浴反應(yīng)18min，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的加入的混合引物為2對(duì)特異性引物的混合引物，其中2對(duì)特異性引物的濃度比為f1∶r1∶f2∶r2＝1∶1∶1∶1。
步驟(3).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)
反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物2～3μl，于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)成像得到相應(yīng)的電泳條帶判斷結(jié)果。如果在416bp處有特異性條帶，說(shuō)明該細(xì)菌是銅綠假單胞菌；如果在202bp處有特異性條帶，說(shuō)明該菌不是銅綠假單胞菌，但是該細(xì)菌存在喹諾酮類耐藥基因(qnrs)；如果在202bp與416bp處都有特異性條帶，說(shuō)明該細(xì)菌為攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrs)的銅綠假單胞菌。無(wú)條帶則為陰性，說(shuō)明該菌既不是銅綠假單胞菌又不攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrs)。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物具有較好的種間特異性和種內(nèi)保守性，該技術(shù)能在一次反應(yīng)中檢測(cè)出銅綠假單胞菌及喹諾酮類耐藥基因(qnrs)，短時(shí)間內(nèi)可判斷該菌是否為攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrs)的銅綠假單胞菌，因此更加便捷、高效。
附圖說(shuō)明
圖1為攜帶喹諾酮類耐藥基因的銅綠假單胞菌rpa檢測(cè)圖譜，其中m：marker；泳道1：銅綠假單胞菌擴(kuò)增條帶；泳道2：喹諾酮類耐藥基因(qnrs)擴(kuò)增條帶；泳道3：攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrs)的銅綠假單胞菌擴(kuò)增條帶；泳道4：陰性對(duì)照。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的分析。
實(shí)施例1.
步驟(1).樣品dna提取
取1ml培養(yǎng)好的菌液加入至1.5ml離心管，12000g離心1min，棄上清，在離心管內(nèi)加入400μl裂解液，混勻后加600μl酚-氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入為該上清液0.8倍體積的異丙醇，12000g離心10min；取沉淀，用體積含量為70％的乙醇清洗1次，再在常溫或50℃下晾干20min，然后加入80μlph值為8.0的te緩沖溶液溶解，得到dna提取物；該dna提取物即為模板dna；將dna提取物采用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定模板dna的濃度與純度；
所述的酚-氯仿-異戊醇混合溶劑由酚、氯仿、異戊醇按照體積比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-異戊醇混合溶劑由氯仿、異戊醇按照體積比24∶1混合而成；
所述的te緩沖液為1ml濃度為1m、ph值為8.0的tris-cl，0.2ml濃度為0.5m、ph值為8.0的edta，定容至100ml溶液；
所述的裂解液為tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸鈉sds組成的混合液，其中tris-hcl的濃度為50mm、ph值為8.0，乙二胺四乙酸edta的濃度為25mm，nacl的濃度為100mm，蛋白酶k的濃度為20μg/μl，十二烷基硫酸鈉sds的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％；
步驟(2).rpa擴(kuò)增
將rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，進(jìn)行rpa擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
所述的rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系即rpa凝膠檢測(cè)體系為50μl由含有凍干酶粉的0.2mltwistampbasic反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydrationbuffer)29.5μl，去離子水11μl，混合引物6μl(10μmol/l)，提取的樣品基因組dna1μl，醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/l)組成。
將rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，放入37℃恒溫金屬浴反應(yīng)18min，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的加入的混合引物為2對(duì)特異性引物的混合引物，其中2對(duì)特異性引物的濃度比為f1∶r1∶f2∶r2＝1∶1∶1∶1。
步驟(3).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)
反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物2～3μl，于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)成像得到相應(yīng)的電泳條帶判斷結(jié)果。結(jié)果顯示，在416bp處有特異性條帶，說(shuō)明該細(xì)菌是銅綠假單胞菌。
實(shí)施例2.
步驟(1).樣品dna提取
取1ml培養(yǎng)好的菌液加入至1.5ml離心管，12000g離心1min，棄上清，在離心管內(nèi)加入400μl裂解液，混勻后加600μl酚-氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入為該上清液0.8倍體積的異丙醇，12000g離心10min；取沉淀，用體積含量為70％的乙醇清洗1次，再在常溫或50℃下晾干20min，然后加入80μlph值為8.0的te緩沖溶液溶解，得到dna提取物；該dna提取物即為模板dna；將dna提取物采用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定模板dna的濃度與純度；
所述的酚-氯仿-異戊醇混合溶劑由酚、氯仿、異戊醇按照體積比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-異戊醇混合溶劑由氯仿、異戊醇按照體積比24∶1混合而成；
所述的te緩沖液為1ml濃度為1m、ph值為8.0的tris-cl，0.2ml濃度為0.5m、ph值為8.0的edta，定容至100ml溶液；
所述的裂解液為tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸鈉sds組成的混合液，其中tris-hcl的濃度為50mm、ph值為8.0，乙二胺四乙酸edta的濃度為25mm，nacl的濃度為100mm，蛋白酶k的濃度為20μg/μl，十二烷基硫酸鈉sds的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％；
步驟(2).rpa擴(kuò)增
將rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，進(jìn)行rpa擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
所述的rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系即rpa凝膠檢測(cè)體系為50μl由含有凍干酶粉的0.2mltwistampbasic反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydrationbuffer)29.5μl，去離子水11μl，混合引物6μl(10μmol/l)，提取的樣品基因組dna1μl，醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/l)組成。
將rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，放入37℃恒溫金屬浴反應(yīng)18min，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的加入的混合引物為2對(duì)特異性引物的混合引物，其中2對(duì)特異性引物的濃度比為f1∶r1∶f2∶r2＝1∶1∶1∶1。
步驟(3).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)
反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物2～3μl，于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)成像得到相應(yīng)的電泳條帶判斷結(jié)果。結(jié)果顯示，在202bp處有特異性條帶，說(shuō)明該菌不是銅綠假單胞菌，但是該細(xì)菌存在喹諾酮類耐藥基因(qnrs)。
實(shí)施例3.
步驟(1).樣品dna提取
取1ml培養(yǎng)好的菌液加入至1.5ml離心管，12000g離心1min，棄上清，在離心管內(nèi)加入400μl裂解液，混勻后加600μl酚-氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入為該上清液0.8倍體積的異丙醇，12000g離心10min；取沉淀，用體積含量為70％的乙醇清洗1次，再在常溫或50℃下晾干20min，然后加入80μlph值為8.0的te緩沖溶液溶解，得到dna提取物；該dna提取物即為模板dna；將dna提取物采用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定模板dna的濃度與純度；
所述的酚-氯仿-異戊醇混合溶劑由酚、氯仿、異戊醇按照體積比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-異戊醇混合溶劑由氯仿、異戊醇按照體積比24∶1混合而成；
所述的te緩沖液為1ml濃度為1m、ph值為8.0的tris-cl，0.2ml濃度為0.5m、ph值為8.0的edta，定容至100ml溶液；
所述的裂解液為tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸鈉sds組成的混合液，其中tris-hcl的濃度為50mm、ph值為8.0，乙二胺四乙酸edta的濃度為25mm，nacl的濃度為100mm，蛋白酶k的濃度為20μg/μl，十二烷基硫酸鈉sds的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％；
步驟(2).rpa擴(kuò)增
將rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，進(jìn)行rpa擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
所述的rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系即rpa凝膠檢測(cè)體系為50μl由含有凍干酶粉的0.2mltwistampbasic反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydrationbuffer)29.5μl，去離子水11μl，混合引物6μl(10μmol/l)，提取的樣品基因組dna1μl，醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/l)組成。
將rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，放入37℃恒溫金屬浴反應(yīng)18min，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的加入的混合引物為2對(duì)特異性引物的混合引物，其中2對(duì)特異性引物的濃度比為f1∶r1∶f2∶r2＝1∶1∶1∶1。
步驟(3).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)
反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物2～3μl，于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)成像得到相應(yīng)的電泳條帶判斷結(jié)果。結(jié)果顯示，在202bp與416bp處都有特異性條帶，說(shuō)明該細(xì)菌為攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrs)的銅綠假單胞菌。
實(shí)施例4.
步驟(1).樣品dna提取
取1ml培養(yǎng)好的菌液加入至1.5ml離心管，12000g離心1min，棄上清，在離心管內(nèi)加入400μl裂解液，混勻后加600μl酚-氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿-異戊醇混合溶劑，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入與該上清液等體積的氯仿，劇烈振蕩，12000g離心10min；取上清液，加入為該上清液0.8倍體積的異丙醇，12000g離心10min；取沉淀，用體積含量為70％的乙醇清洗1次，再在常溫或50℃下晾干20min，然后加入80μlph值為8.0的te緩沖溶液溶解，得到dna提取物；該dna提取物即為模板dna；將dna提取物采用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定模板dna的濃度與純度；
所述的酚-氯仿-異戊醇混合溶劑由酚、氯仿、異戊醇按照體積比25∶24∶1混合而成；
所述的氯仿-異戊醇混合溶劑由氯仿、異戊醇按照體積比24∶1混合而成；
所述的te緩沖液為1ml濃度為1m、ph值為8.0的tris-cl，0.2ml濃度為0.5m、ph值為8.0的edta，定容至100ml溶液；
所述的裂解液為tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸鈉sds組成的混合液，其中tris-hcl的濃度為50mm、ph值為8.0，乙二胺四乙酸edta的濃度為25mm，nacl的濃度為100mm，蛋白酶k的濃度為20μg/μl，十二烷基硫酸鈉sds的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％；
步驟(2).rpa擴(kuò)增
將rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，進(jìn)行rpa擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。
所述的rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系即rpa凝膠檢測(cè)體系為50μl由含有凍干酶粉的0.2mltwistampbasic反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydrationbuffer)29.5μl，去離子水11μl，混合引物6μl(10μmol/l)，提取的樣品基因組dna1μl，醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/l)組成。
將rpa擴(kuò)增反應(yīng)體系振蕩混勻后，放入37℃恒溫金屬浴反應(yīng)18min，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；
所述的加入的混合引物為2對(duì)特異性引物的混合引物，其中2對(duì)特異性引物的濃度比為f1∶r1∶f2∶r2＝1∶1∶1∶1。
步驟(3).擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)
反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物2～3μl，于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)成像得到相應(yīng)的電泳條帶判斷結(jié)果。結(jié)果顯示，無(wú)特異性條帶，說(shuō)明該菌既不是銅綠假單胞菌又不攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrs)。