本發(fā)明屬于生物技術(shù)藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
：，尤其涉及一種適配體介導腺病毒靶向給藥系統(tǒng)及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：：惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)和化療，仍不能根治多數(shù)癌癥。因肝癌具有高侵襲性和遷移性，因此，其診斷非常困難。肝癌的手術(shù)切除率通常低于15％，但術(shù)后復發(fā)率卻高達50％。此外，雖然化療對高度增殖的腫瘤細胞能發(fā)揮作用，并在開始治療階段縮小大部分腫瘤，但它并不能阻止因多藥耐藥所導致的腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移。再者，由于缺乏針對腫瘤干細胞的特定靶向制劑，由傳統(tǒng)化療所引起的致命性毒性和副作用在所難免。目前，腫瘤的基因治療得到了人們的廣泛關(guān)注，而尋找一種合適的載體用于基因治療，是非常關(guān)鍵的。但無論選擇哪種載體，關(guān)鍵在于此載體在局部的表達效率。因為我們最終的目的是要在局部表達目的基因，并且使其具有一定的作用。雖然腺病毒感染效率高，幾乎可達100％，但由于腺病毒具有免疫原性，易引起機體本身的免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此，腺病毒在體內(nèi)滯留時間較短，其基因表達在體內(nèi)僅能維持1-2周，隨著細胞傳代，外源基因會逐漸丟失而不能長時間穩(wěn)定表達。另外，腺病毒有較大的宿主范圍，其組織分布的靶向性不強，因此到目前為止國內(nèi)外進入臨床研究的腺病毒基因治療藥物多采用局部(瘤內(nèi))注射的給藥方式，以避免腺病毒系統(tǒng)分布導致的對正常細胞和組織的毒性等不良反應(yīng)，然而，由于腫瘤具有浸潤、轉(zhuǎn)移的特性，局部給藥只能作為一種輔助的治療手段，不可能成為腫瘤藥物治療的主流。有研究表明攜載抑癌基因pten的重組腺病毒ad5-pten能抑制肝癌，但由于上述腺病毒缺陷以及缺乏靶向性，使ad5-pten的應(yīng)用受到了極大地限制。因此，對ad5-pten進行結(jié)構(gòu)改造或修飾，并將其制成靶向制劑，以精準靶向肝癌細胞，促使藥物聚集在腫瘤細胞，在徹底殺滅癌細胞的同時最大程度降低其毒副作用。靶向制劑中，適配體介導的靶向制劑受到了人們的普遍關(guān)注。適配體(aptamer)是一類由rna或單鏈dna寡核苷酸組成的小核酸分子，它對靶分子具有高特異性和高親和力。因生物標志物的發(fā)現(xiàn)和aptamer的優(yōu)點，aptamer技術(shù)在各生物醫(yī)學領(lǐng)域得到了廣泛發(fā)展，包括體外診斷領(lǐng)域，體內(nèi)成像和靶向治療等。盡管aptamer具有良好的靶向性能，但仍因其諸多缺點使適配體靶向制劑的臨床應(yīng)用受到了限制。一是aptamer自身固有的性質(zhì)，如構(gòu)象靈活性和核酸酶的穩(wěn)定性等。aptamer主要通過形成二級或三級結(jié)構(gòu)與靶標結(jié)合，這可能受到諸如溫度、ph、離子強度等體內(nèi)環(huán)境微小變化的影響。此外，靶分子在體內(nèi)的構(gòu)象可能會與體外有所不同，這種微小的變化可能會使aptamer無法正確識別靶分子，因而無法起到靶向作用。二是aptamer的化學穩(wěn)定性。在血液中，aptamer會迅速被血清核酸酶降解，這極大地限制了aptamer在臨床上的應(yīng)用。除了上述自身特性，還存在與靶標結(jié)合的問題。雖然aptamer能夠特異性結(jié)合不同的靶標，但只有aptamer與靶分子在特定條件下結(jié)合后，才能發(fā)揮靶向作用。在體內(nèi)，aptamer要避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和腎的清除聚集在腫瘤組織，通過與腫瘤細胞上的受體靶標結(jié)合后才能介導腺病毒藥物顆粒進入腫瘤細胞。因此，在實際的研究中，可采用一定手段增強aptamer的體內(nèi)穩(wěn)定性和延長其循環(huán)時間。epcam在大多數(shù)實體瘤中過表達而在人類正常上皮組織中表達低，已被確認為肝癌的腫瘤干細胞表面標記物，如hepg2細胞。而pten能夠降低上皮細胞粘附分子(epithelialcelladhesionmolecule，epcam)陽性肝癌的復發(fā)率。因此，本發(fā)明中我們創(chuàng)新性的使用epcam陽性的rna適配體epdt3修飾ad5-pten，成功構(gòu)建了新的基因給藥系統(tǒng)epdt3-peg-ad5-pten。此給藥系統(tǒng)的構(gòu)建中需解決以下幾方面的關(guān)鍵問題：1)如何對ad5-pten進行修飾。一要確保目標物在保留ad5的感染能力的同時最大限度地提高ad5的血清抗體中和性能，從而延長藥物的半衰期；二要降低腺病毒的免疫原性。2)如何對核酸適配體epdt3進行修飾，以增強其體內(nèi)外的穩(wěn)定性并延長其體內(nèi)循環(huán)時間。3)尋找合適的連接劑。4)反應(yīng)條件的摸索和合成流程的構(gòu)建。epap是以雙功能peg作為連接劑，通過酰胺鍵將ad5-pten與核酸適體epdt3結(jié)合而成，而在ad5-pten的聚乙二醇化過程中，peg兩端的羧基都有可能被活化并與腺病毒反應(yīng)而形成ad5-peg-ad5，最終將沒有位置再連接適配體epdt3而得到目標產(chǎn)物epap。因此，為了解決這一問題，需要探索該反應(yīng)的最佳條件，并從反應(yīng)開始就嚴格控制反應(yīng)物的比例。總之，此給藥系統(tǒng)epdt3-peg-ad5-pten的成功構(gòu)建，提高了ad5-pten的穩(wěn)定性，顯著增強了ad5-pten的抗肝癌活性的同時極大降低了毒副作用，有望成為肝癌臨床治療的新的基因靶向藥物。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種適配體介導腺病毒靶向給藥系統(tǒng)及其構(gòu)建方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種適配體介導腺病毒靶向給藥系統(tǒng)，所述適配體介導腺病毒靶向給藥系統(tǒng)以peg為連接臂，epdt3修飾的ad5-pten新基因給藥系統(tǒng)epdt3-peg-ad5-pten。epdt3的3′末端以氨基修飾，即5′-gcgacugguuacccggucg-(ch2)6-nh2-3′(并作2′-氟嘧啶修飾)，5′末端以羧基熒光素(fam)進行標記。此給藥系統(tǒng)中的rna適配體epdt3能特異性靶向epcam陽性腫瘤細胞，能有效增強pten基因?qū)Ω伟┑纳L抑制作用，同時降低藥物對正常細胞和組織的毒副作用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述適配體介導腺病毒靶向給藥系統(tǒng)的制備方法，所述適配體介導腺病毒靶向給藥系統(tǒng)的構(gòu)建方法包括以下步驟：步驟一，對重組腺病毒進行擴增、純化和滴度測定；步驟二，用雙功能peg作為連接劑，利用酰胺反應(yīng)原理，將peg先后與ad5-pten和epdt3偶聯(lián)成epap，并通過sds-page電泳法確認peg-ad5-pten的偶聯(lián)；步驟三，通過熒光強度檢測法、粒徑及zeta電位的測定和tbe-page電泳法鑒定epap的形成。進一步，所述適配體為rna適配體；采用epdt3為epcam陽性適配體；epdt3的3′末端以氨基修飾；即5′-gcgacugguuacccggucg-(ch2)6-nh2-3′；5′末端以fam進行熒光標記。進一步，所述適配體介導腺病毒靶向給藥系統(tǒng)的構(gòu)建方法包括以下步驟：第一步，重組腺病毒表面蛋白與peg偶聯(lián)形成ad5-peg-pten。將100μln-羥基琥珀酰亞胺(nhs，3.75μm)和100μl碳二亞胺鹽酸鹽(edc，11.25μm)與100μlcooh-peg2000-cooh(1.5μm)水溶液混合均勻；以2-乙基磺酸(mes)緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的ph值至6.0，室溫下輕柔攪拌，孵育1h以活化cooh-peg2000-cooh中的羧基；加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersaline，pbs；100nmna3po4，150nmnacl，ph7.2)，將反應(yīng)液的ph值調(diào)整到7.2，立即向其中加入100μlad5-pten(1.5μm)溶液，用蒸餾水定容到500μl；在37℃水浴中以300r/min反應(yīng)2h，制得ad5-peg-pten粗產(chǎn)物；最后，用截留分子量為100kda的超濾離心管以5000g/min的轉(zhuǎn)速超濾離心10min，如此重復洗滌離心四次，以去除小分子物質(zhì)，得到精制的ad5-peg-pten；第二步，epdt3與ad5-peg-peg通過酰胺鍵偶聯(lián)形成epap。取100μl濃度為3.75μm的精制ad5-peg-pten，加入100μl濃度為11.25μm的nhs和100μl濃度為33.75μm的edc，并混合均勻；以mes緩沖液(ph6.4)將混合物ph值調(diào)整至6.0，輕柔攪拌，25℃孵育1h以活化精制peg-ad5-pten中另一個未反應(yīng)的羧基，加入100μlepdt3溶液(3.75μm)，以無rna酶水將反應(yīng)液稀釋至500μl；37℃水浴中輕柔攪拌，避光反應(yīng)2.5h，制得epdt3-peg-ad5-pten粗產(chǎn)物；用截留分子量為100kda的超濾離心管以5500g/min，超濾離心10min，重復洗滌離心四次，以去除未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到精制的目標給藥系統(tǒng)。本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為：以epdt3修飾攜載抑癌基因磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphataseandtensintomologuegene，pten)的重組腺病毒(ad5-pten)制備一種新型基因靶向給藥系統(tǒng)epdt3-peg-ad5-pten(epap)，克服ad5-pten的免疫原性強和靶向性低以及rna適配體epdt3的弱穩(wěn)定性等缺點，延長藥物的循環(huán)時間，增強藥物的靶向性，并初步驗證epap對hepg2肝癌的抑制作用；擬考察epap能否提高其血清穩(wěn)定性和基因轉(zhuǎn)染率，能否改變hepg2細胞的形態(tài)并抑制其增殖和遷移，能否抑制腫瘤增長并降低毒副作用。ad5-peg-pten經(jīng)sds-page電泳確認而epap經(jīng)熒光強度檢測、粒徑及zeta電位測定和tbe-page電泳鑒定后，以人胚腎細胞(humanembryonickidney，hek293)為模型，測定epap的血清穩(wěn)定性；以epcam陽性的hepg2細胞和人正常肝細胞l-02為模型，分別給予生理鹽水(saline)和用攜載報告基因lacz的重組腺病毒，以與epap同樣方法制得的epdt3-peg-ad5-lacz(epal)，評估epap的基因轉(zhuǎn)染效率以及細胞攝取；分別給予epdt3、5-氟尿嘧啶(5-fu)、ad5-pten和三組不同劑量的epap，以觀察hepg2的形態(tài)改變，并檢測hepg2、epcam陰性的hek293細胞和l-02的細胞活力以及hepg2的遷移能力。隨后，通過小鼠體內(nèi)急性毒性實驗對epap的毒副作用進行考察。最后，構(gòu)建hepg2裸鼠異位瘤模型，對epap的組織攝取以及epap的抗腫瘤活性進行評價。結(jié)果：實驗結(jié)果表明，ad5-pten的peg化效率為95.2±4.58％，epap的產(chǎn)率約80-90％，其粒徑和zeta電位分別為98.26±2.85nm和-21.56±9.75mv。體外實驗表明，epap的血清穩(wěn)定性和基因轉(zhuǎn)染效率均得到了極大提高；epap能特異性靶向hepg2肝癌細胞和腫瘤組織而對正常肝細胞沒有靶向性，且hepg2細胞對epap的攝取明顯高于l-02；epap能顯著改變體外hepg2肝癌細胞的形態(tài)并降低其活力和遷移能力，而對hek293細胞和正常肝細胞的活力卻無明顯影響。體內(nèi)急性毒性實驗表明，高劑量epap(1.73×1010pfu/ml)對小鼠肝臟有輕微毒性，而低、中劑量epap對實驗小鼠均無明顯無毒副作用。epap能抑制裸鼠異位瘤的生長與分化。本發(fā)明成功構(gòu)建了靶向基因給藥系統(tǒng)epap，其在體內(nèi)外均能特異性靶向epcam陽性肝癌細胞，并抑制其增殖和遷移，具有抗腫瘤活性，能抑制hepg2肝癌的生長和分化。低、中劑量的epap更適用于抗肝癌治療，epap有望成為一種人肝癌臨床基因治療新藥物。本發(fā)明的適配體是一種合成的單鏈寡核苷酸序列，epdt3的3′末端以氨基修飾，即5′-gcgacugguuacccggucg-(ch2)6-nh2-3′(并作2′-氟嘧啶修飾)，5′末端以羧基熒光素(fam)進行標記。此給藥系統(tǒng)中的rna適配體epdt3能特異性靶向epcam陽性腫瘤細胞，能有效增強pten基因?qū)Ω伟┑纳L抑制作用，同時降低藥物對正常細胞和組織的毒副作用；不僅可以折疊，也可與各種不同的配體高度親和及特異性的結(jié)合，而且具有良好的清除率，無免疫原性和無毒性；能克服ad5-pten的無選擇性和無特異性，增強其在血清中的穩(wěn)定性，降低腺病毒對正常細胞和組織的毒性，并增強ad5-pten對人肝癌的抗腫瘤效應(yīng)。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例提供的適配體介導腺病毒靶向給藥系統(tǒng)的構(gòu)建方法流程圖。圖2是本發(fā)明實施例提供的質(zhì)譜分析的報道單鏈epdt3適體示意圖。圖中：條件為:探針(esi)，錐(50v)desovation臨時(350℃)，毛細管(3.00kv)，提取器(5v)，氣體流量(3.5升/分鐘)。圖3是本發(fā)明實施例提供的通過sds-pade電泳檢測peg-ad5-pten示意圖。圖中：(a)被考馬斯亮藍染色，(b)由0.1mol/l碘溶液染色；1～5分別代表標志，牛血清白蛋白bsa，ad5-pten和peg-ad5-pten。圖4是本發(fā)明實施例提供的超濾前后epap濾液熒光強度比較示意圖。圖5是本發(fā)明實施例提供的epap由etbrtbe-page電泳染色示意圖。圖中1～4分別代表標志，核糖核酸適體epdt3，peg-ad5-pten和epap。圖6是本發(fā)明實施例提供的轉(zhuǎn)基因表達抑制測定中和結(jié)果示意圖。圖中：人血清稀釋范圍從1/10至1/20480；結(jié)果表示為相對轉(zhuǎn)導效率。圖7是本發(fā)明實施例提供的epal在hepg2和l-02細胞中的基因轉(zhuǎn)染效率(a)和(b)細胞攝取(n＝3)示意圖。圖中：*p＜0.01，ad5-lacz組與epal組比較。圖8是本發(fā)明實施例提供的hepg2細胞加入7組藥物72h后的細胞形態(tài)(a)和各組藥物抑制細胞hepg2(b)、hek293(c)和l-02(d)生長的mtt實驗結(jié)果(n＝5)示意圖。圖中：*p<0.05，**p<0.01，pbs組與其他給藥組比較；#p<0.05，##p<0.01，ad5-pten與epap高劑量組比較。圖9是本發(fā)明實施例提供的體外劃痕愈合實驗(a和c)和transwell遷移實驗(b和d)的hepg2細胞遷移抑制分析結(jié)果(n＝5)示意圖。圖中：*p＜0.05，**p＜0.01，pbs組與其他給藥組比較。圖10是本發(fā)明實施例提供的實驗小鼠心、肝、肺和腎的病理切片h&e染色結(jié)果(放大200倍)示意圖；圖11是本發(fā)明實施例提供的不同給藥組對hepg2異位瘤的抗腫瘤效應(yīng)(n＝5)示意圖。圖中：(a)腫瘤體積變化圖(mm3,從第21天起，*p<0.01)；(b)實驗小鼠代表性腫瘤塊；(c)瘤重(*p<0.05，**p<0.01，saline組與其他給藥組比較)；(d)腫瘤轉(zhuǎn)移的代表性小鼠；(e)和(f)分別為放大100倍和200倍的腫瘤病理切片。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細的描述。本發(fā)明實施例提供的適配體介導腺病毒靶向給藥系統(tǒng)以peg為連接臂，開發(fā)出一種epdt3修飾的ad5-pten新基因給藥系統(tǒng)epdt3-peg-ad5-pten(epap)。如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的適配體介導腺病毒靶向給藥系統(tǒng)的構(gòu)建方法包括以下步驟：s101：對重組腺病毒進行擴增、純化和滴度測定，再用雙功能peg作為連接劑；s102：利用酰胺反應(yīng)原理，將peg先后與ad5-pten和epdt3偶聯(lián)成epap，并通過sds-page電泳法確認peg-ad5-pten的偶聯(lián)；s103：通過熒光強度檢測法、粒徑及zeta電位的測定和tbe-page電泳法鑒定epap的形成。下面結(jié)合實驗對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步的描述。1主要實驗試劑重組腺病毒ad5-pten-北京vgtc基因技術(shù)有限公司；重組腺病毒ad5-lacz-北京vgtc基因技術(shù)有限公司；epdt3適配體-上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；cooh-peg2000-cooh-北京鍵凱科技有限公司；n-羥基琥珀酰亞胺nhs-上海伊卡生物技術(shù)有限公司；碳化二亞胺鹽酸鹽edc-上海伊卡生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)marker-美國thermo公司；牛血清白蛋白bsa-北京索萊寶科技技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍染液-北京索萊寶科技技術(shù)有限公司；溴化乙錠etbr-美國amresco公司；dmem高糖培養(yǎng)基-美國gibco公司；胎牛血清-浙江天杭生物科技有限公司；x-gal-碧云天生物技術(shù)有限公司；β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒-碧云天生物技術(shù)有限公司；dapi-北京方程生物科技有限公司；氟尿嘧啶-天津金耀藥業(yè)有限公司；mtt-北京biosharp生物技術(shù)公司；其它試劑和化學藥品均為分析純-瀘州科陽化學試劑公司。2主要實驗儀器與設(shè)備移液槍-德國eppendrof公司；細胞培養(yǎng)板-美國corning公司；th4-200倒置光學顯微鏡-日本olympus公司；rf-5301熒光分光光度計-日本島津公司；dhg-9240電熱鼓風干燥箱-上海齊欣科學儀器有限公司；co2恒溫培養(yǎng)箱-美國thermo公司；立式高溫壓力蒸汽滅菌器-上海申安醫(yī)療器械廠；cu-420電熱恒溫水槽-上海齊欣科學儀器有限公司；高速冷凍離心機-賀利氏集團公司；5702臺式低速離心機-德國艾本德公司；fc104電子天平-上海精科天平廠；電泳儀-美國bio-rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)-美國bio-rad公司；kq3200型超聲波清洗器-昆山市超聲儀器有限公司；-80℃超低溫冰箱-美國thermo公司；4℃/-20℃冰箱-midea公司；bhc-1300a2生物潔凈安全柜-蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；infinitem200全功能酶標儀-上海安景科技有限公司；激光共聚焦顯微鏡-美國hamamatsu公司；臺式恒溫振蕩器-北京北方利輝設(shè)備有限公司；xw-80a渦旋混合器-海門市其林貝爾儀器有限公司；游標卡尺-北京亞中博克工具有限公司；ms300磁力攪拌器-上海上海潁特科技公司。3實驗細胞和動物人胚腎細胞hek293，人肝癌細胞hepg2和人正常肝細胞l-02均購于中國科學院上海細胞庫，并由本室保存。hepg2細胞和hek293細胞均用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，l-02細胞用含10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基，在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人體細胞的所有實驗均按西南醫(yī)科大學人類細胞倫理委員會的原則進行。6～8周balb/c雌性裸小鼠(18～22g)購于成都達碩實驗動物有限公司(中國成都，證書號scxk2015-030)。雌性昆明小鼠(～30g)，6～8周，購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心(中國瀘州，證書號syxk2013-065)。實驗前，所有小鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)至少5天。實驗過程中，小鼠以5只/籠在恒定的濕度、溫度和無病原體的條件下飼養(yǎng)。所有動物實驗均嚴格按準則執(zhí)行，并遵循《西南醫(yī)科大學動物使用和管理委員會》協(xié)議(許可證編號20160141)。4實驗方法4.1rna適配體序列設(shè)計及合成本發(fā)明選用的epdt3為epcam陽性適配體。epdt3的3′末端以氨基修飾，即5′-gcgacugguuacccggucg-(ch2)6-nh2-3′(并作2′-氟嘧啶修飾)，5′末端以fam進行熒光標記。適配體由上海吉瑪制藥有限公司采用固相化學法合成，產(chǎn)品經(jīng)hplc純化后再進行質(zhì)譜鑒定。4.2重組腺病毒擴增、純化、滴度測定4.2.1重組腺病毒的擴增用重組腺病毒ad5-pten感染hek293細胞，待細胞全部出現(xiàn)球型或葡萄樣病變時，收集細胞先后于-20℃及37℃下快速凍融3次，使細胞破碎釋放出病毒，于4℃下，5000rpm離心10min，收集含重組腺病毒的上清液，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.2重組腺病毒的純化重組腺病毒的純化采用氯化銫(cscl)密度梯度離心法，其中氯化銫密度分別為1.45g/ml和1.25g/ml。離心后收集cscl之間的乳白色病毒帶，并將收集的病毒條帶置于10mmtris-hcl(ph8)，2mm氯化鎂，5％蔗糖的溶液中，于4℃條件下透析24h(截留分子量為25000)，期間每5h更換一次透析液，以除去氯化銫鹽，收集純化的重組腺病毒原液，分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?.2.3重組腺病毒滴度檢測重組腺病毒滴度由細胞病變效應(yīng)(cpe)法檢測得到。將dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)所得hek293細胞的密度調(diào)整至105個/ml，以100μl/孔接種于96孔板，然后于5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞長滿。用培養(yǎng)液將病毒原液稀釋成10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14共八個梯度的稀釋度。吸出96孔板中原有的細胞培養(yǎng)液，于96孔板的每行12個孔中的10個孔中分別加入100μl同一病毒稀釋液，其余兩個孔不加病毒(作為陰性對照)，8行依次加入不同濃度梯度的病毒稀釋液。于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10天后，顯微鏡下觀察每一行中出現(xiàn)cpe的孔數(shù)。病毒滴度由karber統(tǒng)計方法lgtcid50＝-[x+0.5d-ds]計算得到。其中，x為出現(xiàn)100％感染的最高稀釋度的對數(shù)；d為稀釋間隔倍數(shù)的對數(shù)；s為出現(xiàn)100％感染的最高稀釋度開始的各個稀釋度病變細胞比例之和。4.3目標給藥系統(tǒng)epap的制備4.3.1重組腺病毒與peg偶聯(lián)制備ad5-pten經(jīng)rna適配體修飾的基因給藥系統(tǒng)epap的制備過程包括兩個部分。第一步是重組腺病毒表面蛋白與peg偶聯(lián)形成ad5-peg-pten。首先,將100μln-羥基琥珀酰亞胺(nhs,3.75μm)和100μl碳二亞胺鹽酸鹽(edc,11.25μm)與100μlcooh-peg2000-cooh(1.5μm)水溶液混合均勻。以2-乙基磺酸(mes)緩沖液(ph6.4)調(diào)節(jié)反應(yīng)液的ph值至6.0，室溫下輕柔攪拌，孵育1h以活化cooh-peg2000-cooh中的羧基。加入pbs緩沖(100nmna3po4,150nmnacl,ph7.2)，將其ph值調(diào)整到7.2，立即向反應(yīng)液中加入100μlad5溶液(1.5μm)，用蒸餾水定容到500μl。以300r/min攪拌，37℃水浴反應(yīng)2h，制備得到ad5-peg-pten粗產(chǎn)物。最后，用截留分子量為100kda的超濾離心管以5000g/min，超濾離心10min，重復洗滌離心四次，以去除小分子物質(zhì)后最終得到精制的ad5-peg-pten。4.3.2適配體與peg化的重組腺病毒的偶聯(lián)epap制備的第二步是將epdt3與ad5-peg-pten通過酰胺鍵偶聯(lián)形成epap。取100μl濃度為3.75μm的精制ad5-peg-pten，加入100μl濃度為11.25μm的nhs和100μl濃度為33.75μm的edc，并混合均勻。以mes緩沖液(ph6.4)將混合物ph值調(diào)整至6.0，輕柔攪拌，25℃孵育1h，以活化精制peg-ad5中另一個未反應(yīng)的羧基。然后,加入100μlepdt3(3.75μm)溶液，以無rna酶水將反應(yīng)液稀釋至500μl。37℃下輕柔攪拌(300r/min)，避光反應(yīng)2.5h，制備得到epdt3-peg-ad5-pten(epap)或epdt3-peg-ad5-lacz(epal)粗產(chǎn)物。最后，用截留分子量為100kda的超濾離心管以5500g/min，超濾離心10min，重復洗滌離心四次，以去除未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，最終得到精制的目標給藥系統(tǒng)epap或epal。4.4peg-ad5-pten與epap的鑒定4.4.1sds-page電泳鑒定peg-ad5本發(fā)明采用sds-page凝膠電泳法，以考馬斯亮蘭對蛋白質(zhì)染色，以0.1mol/l碘溶液對peg染色來進行peg-ad5-pten合成情況的鑒定。以熒光檢測、粒徑測定和tbe-page電泳法來確認epap的合成，并評估其產(chǎn)率。4.4.2熒光強度檢測法確認epap的形成epdt3適配體上修飾有羧基熒光素fam，其激發(fā)波長為492nm，發(fā)射波長為518nm。為進一步確認未反應(yīng)的epdt3是否除盡，每次超濾離心后，立即用熒光分光光度計測定超濾離心管的外部濾液和內(nèi)部樣品的平均熒光強度(ex＝492nm；em＝518nm)，重復測量三次。當濾液的熒光強度幾乎不能被檢測到，而樣品熒光強度值仍較高，且?guī)缀醪蛔儠r，說明游離epdt3已基本除盡，得到了較純的目標產(chǎn)物epap。此外，將2.5nmol的epdt3標準品溶于1ml無rna酶水中，得到濃度為2.5×10-6mol/l的epdt3溶液，標為a液，并檢測其熒光強度。然后，將a液稀釋成一系列具有濃度梯度的epdt3稀釋液，分別測定各梯度液的熒光強度，由此建立epdt3的熒光標準曲線。最后，結(jié)合epdt3反應(yīng)前的熒光強度和反應(yīng)后產(chǎn)物的熒光強度來計算epap的產(chǎn)率。4.4.3epap的粒徑及zeta電位的測定通過馬爾文激光粒度儀測定epap復合物的平均粒徑及zeta電位。測量之前，用無rna酶水將樣品按1:3(v/v)的比例稀釋。常溫下，在90°的固定角度下進行測定。每次測量時間為3min(n＝3)。通過比較裸ad5-pten和目標物epap的粒徑和zeta電位差別來斷定epap的制備是否成功。4.4.4tbe-page電泳鑒定epaptbe-page電泳檢測前，準備好tbe緩沖液(89nmtris，89mm硼酸，2mmedta，ph8.3)和濃度為20％的page膠后，預電泳30min。將樣品蛋白marker，epdt3，peg-ad5和epap分別與上樣緩沖液以10：1(v/v)的比例混勻，將混合液置于95℃水浴中變性5min。于冰上冷卻后立即取每種樣品約10μg按上面的順序加樣。在80v恒定電壓下電泳5h。電泳結(jié)束后，用5mg/ml的溴化乙錠溶液對凝膠塊染色10分鐘，之后用tbe緩沖液洗滌凝膠3次。在紫外光照下，用凝膠成像系統(tǒng)觀察凝膠上各條帶的確切位置并照相。4.5體外血清穩(wěn)定性實驗為了探索epap的血清穩(wěn)定性，本發(fā)明將用報告基因lacz代替抑癌pten制得epal。本發(fā)明的人血清來自于健康志愿者西南醫(yī)科大學的附屬醫(yī)院(瀘州,中國)。使用前，咋西南醫(yī)科大學倫理委員會的批準下，篩選具有最高滴度抗腺病毒抗體的血清。中和實驗前一天，在96孔板中接種hek293(2×104cells/每孔)。56℃下，60分鐘滅活血清中的補體。隨后，用無血清dmem培養(yǎng)基倍比稀釋血清，得到一系列梯度稀釋液(稀釋度從1/10到1/20480，終體積為200μl)。陰性對照孔不加血清，以使hek293細胞最大限度表達lacz基因。50μl樣品，即裸ad5-lacz(moi20)組，epal(moi20)組，加到50μl無血清dmem培養(yǎng)基中，分別與對應(yīng)的準備好的人血清一起37℃孵育1h。每個樣品200μl感染hek293細胞，37℃孵育4h，以便于病毒吸附和感染。去除上清液，加入200μll新鮮的含10％新生牛血清的dmem培養(yǎng)液，于37℃，5％co2的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。通過x-gal染色法檢測lacz基因表達。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗測定其在490nm處的光密度。以未加人血清的陰性對照孔作為100％轉(zhuǎn)染率，計算各實驗組相對轉(zhuǎn)染率。4.6epap在不同細胞中的基因轉(zhuǎn)染效率檢測基因轉(zhuǎn)染實驗在hepg2和l-02細胞中進行。將處于對數(shù)生長期的細胞以3×105個/ml的密度接種于24孔板中培養(yǎng)至細胞達到約70％的融合度。棄去原有培養(yǎng)基，用pbs洗滌3次。接下來，分別加入以無血清培養(yǎng)基配制所得的500μl含裸ad5-lacz(moi＝20)和epal(moi＝20)藥物溶液。置于37℃，轉(zhuǎn)染4h后，移除轉(zhuǎn)染液，加入新鮮的完全培養(yǎng)液，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h。本發(fā)明通過檢測轉(zhuǎn)染細胞中的總蛋白和β-半乳糖苷酶活性，可對β-半乳糖苷酶的表達進行定量分析，從而評估轉(zhuǎn)染率。實驗以piercebca蛋白分析法測定細胞裂解液總蛋白的含量，并用β-半乳糖苷酶分析系統(tǒng)測定β-半乳糖苷酶的活性。轉(zhuǎn)染率以每微克總蛋白所含β-半乳糖苷酶的量(pg)來表示(pg/μg蛋白)。4.7目標給藥系統(tǒng)的體內(nèi)外攝取考察4.7.1目標給藥系統(tǒng)的體外細胞攝取和共定位為了方便追蹤epap的攝取，用alexa555對ad5-lacz進行紅色熒光標記后與fam綠色熒光標記的epdt3反應(yīng)制得epal。將對數(shù)生長期的hepg2和l-02細胞懸液濃度調(diào)整為7.5×104個/ml。將細胞爬片平鋪于24孔培養(yǎng)板，每孔接種1ml細胞懸液，培養(yǎng)至細胞完全貼壁后，棄去原有培養(yǎng)基，分別加入500ml/孔生理鹽水(saline)和epal(moi＝20)稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后吸去原有藥物培養(yǎng)液，用4％多聚甲醛將細胞固定15min，再用dapi染色5min，將染液吸除后用pbs充分洗滌。最后將細胞浸泡于少量pbs中，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光在細胞中的位置并分析其強度。4.7.2目標給藥系統(tǒng)的體內(nèi)組織攝取為了考察epap在體內(nèi)的組織攝取及靶向性，本發(fā)明用fam熒光標記的epdt3和攜帶lacz報告基因的ad5制得epal。用pbs重懸對數(shù)生長期的hepg2細胞，密度為5×107個/ml，取約0.2ml皮下接種于裸鼠右側(cè)腋，以形成異位瘤。當腫瘤體積達到約300mm3，荷瘤balb/c小鼠(每組三只)分別一次性靜脈注射0.2ml生理鹽水或epap(4.32×109pfu/ml)。給藥4h后，處死所有小鼠，收集正常肝臟和腫瘤組織。并立即制成冰凍切片(8μm)，用激光共聚焦觀察其綠色熒光并拍照記錄。4.8epap體外對癌細胞的抑制作用為考察epap對細胞形態(tài)的改變、對腫瘤細胞增殖和遷移的抑制作用以及對正常細胞的毒性作用，進行了細胞形態(tài)學觀察實驗、mtt實驗、劃痕愈合實驗和transwell遷移實驗。實驗分組如下：a:pbs組；b:epdt3(200nm)；c:5-fu(20μg/ml)陽性對照組；d:裸ad5-pten(moi40)組；e:epap(moi20)低劑量組；f:epap(moi40)中劑量組；g:epap(moi80)高劑量組。4.8.1癌細胞形態(tài)學觀察取2ml對數(shù)生長期的hepg2細胞以1×106個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜以達到～70％的融合度。移去原有培養(yǎng)液，分別加入各分組藥物稀釋液2ml，繼續(xù)培養(yǎng)72h。在倒置顯微鏡下，放大200倍，觀察細胞形態(tài)并拍照。4.8.2mtt實驗檢測細胞活力為定量評價epap的細胞抗腫瘤效果及對正常細胞的毒性，在epcam陽性的hepg2細胞、epcam陰的hek293細胞和人正常肝細胞l-02中進行了mtt實驗。將密度為5×104個/ml的細胞懸液以100μl/孔接種于96孔板中。培養(yǎng)箱細胞達70-80％的融合時，除去原有培養(yǎng)基，分別加入各分組藥物稀釋液100μl/孔，繼續(xù)分別培養(yǎng)24h、48h和72h。每組設(shè)置5個復孔。每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl(ph7.4)，避光輕輕振蕩5min后，繼續(xù)孵育4h，移去培養(yǎng)基，每孔加入150μl的dmso，輕輕振搖15min。用酶標儀測定各孔在595nm處的吸收值(abs值)，按如下公式計算細胞存活率：viability＝(abssample-absblank)/(abscontrol-absblank)×100％。4.8.3劃痕愈合實驗先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃條橫線。對數(shù)增長期的epcam過表達hepg2細胞以1.0×106個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜待細胞完全貼壁并剛好鋪滿。用10μl槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕。吸除培養(yǎng)基，用pbs清洗3次，除劃下的細胞，置于顯微鏡下拍照并記錄劃痕的寬度sw。每孔分別加入2ml含藥物的細胞維持液。置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中，分別繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h后，再次置于顯微鏡下觀察并拍照記錄同一位置劃痕的寬度sw。每組3個平行孔，實驗重復3次，劃痕愈合率(％)＝(劃痕寬度0h-劃痕寬度24h或48h)/劃痕寬度0h×100％。4.8.4transwell遷移實驗transwell遷移實驗的目的是進一步考察epap對hepg2細胞遷移能力的影響。將100μl密度為1.16×106個/ml的細胞接種于transwell上室(8.0μm)，分別加入100μl含藥物的饑餓培養(yǎng)基。下室加入500μl含20％(v/v)fbs的dmem培養(yǎng)基，作為化學引誘劑。為了更準確地對遷移細胞進行計數(shù)，培養(yǎng)24h后，用pbs清洗上室3次，并用棉簽把上室上表面未遷移的細胞仔細擦掉。上室下表面的遷移細胞用4％甲醛固定25min后，用0.1％結(jié)晶紫染色10min，再用清水充分清洗。在倒置顯微鏡下，隨機選取5個不同視野，計算每個視野下的平均遷移細胞數(shù)，并在200倍鏡下拍照。4.9epap小鼠急性毒性實驗為了考察epap在體內(nèi)的潛在毒性并為接下來的體內(nèi)抗腫瘤研究提供參考，給昆明小鼠單次大劑量靜脈注射藥物，之后觀察epap在7天內(nèi)對小鼠的毒性。選取35只健康小鼠按體重隨機分為如下七組(n＝5)：a：生理鹽水對照組；b：epdt3組(200nm)組；c：5-fu(125mg/kg)組；d：ad5-pten(8.64×109pfu/ml)組；e：epap低劑量組(4.32×109pfu/ml)；f：epap中劑量組(8.64×109pfu/ml)；g：epap高劑量組(1.73×1010u/ml)組。藥物均溶于無菌生理鹽水，注射體積均為200μl/只。給藥前和給藥后第3天、7天，從各組小鼠眼眶后靜脈叢處采血，樣本送西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院進行血清肝腎功能檢測，檢測指標包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)，天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ast)，血尿素氮(bun)和血肌酐(cr)。實驗期間所有小鼠自由飲水，給予普通飼料，每天測量體重并觀察其飲食、尿液和糞便變化以及中毒和死亡情況，做好記錄。給藥后第7天結(jié)束實驗，處死小鼠，迅速摘取心、肝、肺和腎，并觀察其形態(tài)和色澤。這些臟器經(jīng)生理鹽水洗滌后用濾紙吸干稱重,根據(jù)以下公式：臟器指數(shù)(％)＝臟器重量(g)/體重(g)×100％計算臟器指數(shù)。4％甲醛固定，石蠟包埋切片，脫蠟，he染色，制成病理切片，顯微鏡下觀察，通過與正常組織的對比評價藥物的毒性。4.10epap體內(nèi)抗腫瘤活性實驗4.10.1腫瘤模型的建立按體內(nèi)組織攝取實驗的方法接種腫瘤細胞。隨后，通過在裸小鼠右側(cè)皮下移植～50mg無壞死的腫瘤組織塊將異位瘤傳代3次。簡言之，注射腫瘤細胞懸液約21天后，當腫瘤直徑達約10mm時，處死小鼠并取出腫瘤塊。之后，將新鮮腫瘤組織塊在無菌生理鹽水中剪成1-2mm3的小塊，再將其接種到裸鼠背部右前方皮下。當腫瘤塊達到100mm3時，即植入腫瘤塊第12天時開始給藥治療。4.10.2藥物劑量和給藥方案腫瘤接種12天后，當腫瘤體積達到100mm3左右時，hepg2肝癌荷瘤小鼠隨機分為七組，每組5只，按如下分組給藥：a：生理鹽水(對照)；b：epdt3200nm；c：5-fu25mg/kg(陽性對照)；d：nakedad5-pten2.16×109pfu/ml；e：epap1.08×109pfu/ml；f：epap2.16×109pfu/ml；g：epap4.32×109pfu/ml。每次治療靜脈注射0.2ml藥物，每3天給藥一次，共給藥7次。4.10.3抗腫瘤活性評價與病理分析裸鼠體重及其hepg2異位瘤的體積測量從給藥前開始，之后每3天給藥一次，直到小鼠處死。用游標卡尺測量腫瘤的長和寬(l為長，w為寬)，同時測量小鼠體重。腫瘤體積(mm3)按1/2(lxw2)(mm)計算?？鼓[瘤活性通過腫瘤生長抑制(tgi)評估，即第35天時，每個給藥組(tg)相對生理鹽水對照組(cg)的平均瘤重(mtw)，根據(jù)之前文獻報道的公式：(mtwtg–mtwcg)÷mtwcg×100％計算結(jié)果。4.11統(tǒng)計學處理所有結(jié)果的比較和分析均采用spss17.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)均以表示。平均值之間的差異在不同的治療組間進行分析用tukey-kramer多重比較測試單因素方差分析。p<0.05為具有統(tǒng)計學意義。顯著性水平越高被設(shè)定為p<0.01。每個實驗都至少獨立重復操作3次，除非另有說明。結(jié)果1epdt3的質(zhì)譜鑒定epdt3合成后，對其進行標準化純化和質(zhì)譜鑒定。如圖2所示，合成產(chǎn)物的分子量約為7422kda。由此可知，純化的產(chǎn)物正是所需要的適配體epdt3。2重組腺病毒滴度觀察并計算每種濃度出現(xiàn)cpe現(xiàn)象的百分數(shù)，由karber統(tǒng)計方法lgtcid50＝-[x+0.5d-ds]計算得到重組腺病毒的滴度t為1.34×109.5ifu/ml(＝4.32×109pfu/ml)。3重組腺病毒成功地peg化基于考馬斯亮藍染色和碘染色的方法，未修飾peg的腺病毒蛋白能被考馬斯亮藍染色而不能被碘染色，而已修飾peg的腺病毒蛋白能被碘染色而不能被考馬斯亮藍染色。如圖3所示，圖3a為考馬斯亮藍染色結(jié)果，圖3b為碘染色結(jié)果。圖3b中，泳道1自上而下均為蛋白質(zhì)marker(250kda，130kda，100kda，70kda，55kda)的條帶；泳道2為牛血清白蛋白(bsa，～66kda)的條帶；泳道3中130～250kda之間的條帶為重組腺病毒ad5-pten(～200kda)的顯色條帶；泳道4中的peg-ad5-pten(～202kda)不顯色。而圖3b中，只有泳道4中的peg-ad5-pten顯色，其余泳道均無現(xiàn)色帶。由此可知，peg與ad5表面的衣殼蛋白成功地偶聯(lián)耦合成peg-ad5。通過nihimagej軟件分析可知peg-ad5-pten的產(chǎn)率為95.2±4.58％，這為下一步連接適配體奠定了基礎(chǔ)。4目標給藥系統(tǒng)epap合成的確認4.1熒光檢測超濾前，樣品的平均熒光強度為13582±324.18。如圖4所示，隨著超濾次數(shù)的增加，濾液的熒光強度逐漸減弱。第4次超濾時，濾液的熒光強度幾乎不能被檢測到，這提示只有極其微量的游離epdt3表1不同濃度的epdt3標準溶液及其對應(yīng)的熒光強度(n＝3)table1differentconcentrationsofepdt3standardsolutionandtheircorrespondingfluorescenceintensity(n＝3)存在；而此時樣品的熒光強度仍保持在4989±163.58的較高水平，這部分熒光應(yīng)該來自目標復合物epap。此外，本研究中的epdt3經(jīng)fam熒光修飾，其熒光強度與epdt3或epap的濃度呈線性關(guān)系，因此，可以通過檢測濾液中的熒光強度變化來確定游離epdt3是否被超濾完全。一系列濃度的epdt3標準水溶液的熒光強度如表1所示，當濃度在1.9531×10-8-2.5×10-6mol/l范圍時，epdt3的濃度和熒光強度才有正相關(guān)關(guān)系。選擇epdt3溶液濃度在1.9531×10-8-2.5×10-6mol/l范圍內(nèi)的溶液熒光強度建立epdt3溶液的標準曲線，其回歸方程為y＝2×109x+30.73(r2＝0.9996)。結(jié)合epdt3反應(yīng)前的熒光強度和反應(yīng)后產(chǎn)物的熒光強度，計算epap的產(chǎn)率為90.44±3.09％。4.2epap的粒徑和zeta電位如表2所示，epap的平均粒徑(98.26±2.85nm)與裸ad5-pten(92±3.22nm)比較，并沒有顯著的增加(p＞0.05)。但是，裸ad5-pten表面的zeta電位為-10.17±1.28mv，適配體epdt3的為-7.66±3.51mv，而epap表面的zeta電位則降為-21.56±9.75mv。由此可知，反應(yīng)產(chǎn)物主要為epap。在儲存過程中發(fā)現(xiàn)epap的zeta電位并未發(fā)生明顯改變，這也許表明其具有較好的動力學穩(wěn)定性。表2檢測物的粒徑分布及其zeta電位(n＝3)table2sizedistributionandzetapotentialoftestsample(n＝3)pdi(polydispersityindex)：多分散指數(shù)4.3tbe-page電泳基于溴化乙錠染色的方法，只有rna適配體epdt3和epdt3修飾物epap能被標記，而peg-ad5-pten不能被標記。由圖5可知，marker(lane1)、epdt3(～7kda，lane2)和epap(～209kda,lane4)泳道有條帶，而peg-ad5-pten(～200kda,lane3)泳道沒有條帶出現(xiàn)。此外，epdt3的條帶比marker中10kda的條帶要稍微低一點，而epap的條帶在marker中130kda和250kda條帶之間。結(jié)果表明目標給藥系統(tǒng)epap的制備是成功的，且由nihimagej軟件分析可知epap的產(chǎn)率為81.68±2.95％。5epap的血清穩(wěn)定性由于血液循環(huán)中存在抗腺病毒抗體，腺病毒載體在體內(nèi)的廣泛應(yīng)用受到了極大的挑戰(zhàn)。中和抗體可影響腺病毒的轉(zhuǎn)運及其功能的發(fā)揮。為了評價epap的血清穩(wěn)定性，用lacz報告基因代替pten基因，通過轉(zhuǎn)基因抑制法來檢測ad5的中和作用。如圖6所示，在與抗血清作用后，裸ad5-lacz和epal的轉(zhuǎn)染效率均明顯降低，即使稀釋度為1：320，抗血清仍對裸ad5-lacz有完全的抑制作用，而對epal復合物的感染性影響有限。在60％的基因表達水平，epal(清稀釋度為1：160)需要比裸ad5-lacz(稀釋度為1：2560)濃度高出16倍的抗血清才能保持與ad5-pten相同的轉(zhuǎn)導抑制作用。這一結(jié)果表明，epal能在一定程度上免受中和抗體的影響。6epdt3增強外源基因在epcam陽性細胞中的表達和攝取裸ad5-pten和epal轉(zhuǎn)染后，hepg2和l-02細胞中l(wèi)acz基因的表達水平如圖7a所示。對epcam陽性hepg2細胞，經(jīng)epal轉(zhuǎn)染后，細胞中β-半乳糖苷酶的平均表達量為(1.26±0.15)×106pgβ-gal/μg蛋白，是裸ad5-pten轉(zhuǎn)染(7.52±0.28)×104pgβ-gal/μg蛋白后的15倍多(p<0.01)。但對正常epcam陰性肝細胞l-02，ad5-pten和epal轉(zhuǎn)染后的β-半乳糖苷酶的平均表達量分別為(5.94±0.36)×106和(6.35±0.44)×106pgβ-gal/μg蛋白pgβ-gal/μg蛋白，兩者之間沒有顯著性差異(p>0.05)。這一結(jié)果表明，epdt3修飾的epap可提高腺病毒介導的pten基因在epcam陽性肝癌細胞中的表達，這可能是因為epdt3適配體能被相應(yīng)的epcam受體所識別。如圖7b所示，epal在hepg2細胞中的紅色和綠色熒光強度均遠強于正常l-02細胞。通過nihimagej圖像軟件分析可知，hepg2和l-02細胞對epal的攝取率分別為89.25±1.21％和8.02±1.52％。這一結(jié)果表明，適配體epdt3能夠增強epcam過表達的hepg2細胞對epal的攝取，但不能增強人正常肝細胞l-02的。這一結(jié)論與基因轉(zhuǎn)染的結(jié)果是一致的。另外，紅色和綠色熒光在細胞中的位置相同，這表示epdt3和ad5-pten成功地連接成為了一個整體，這也說明了epap的制備是成功的。7目標給藥系統(tǒng)epap的體內(nèi)組織攝取量正常肝和腫瘤組織冰凍切片在激光共聚焦顯微鏡下的觀察發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組的正常肝和腫瘤切片中均未檢測到綠色熒光，而epap組的腫瘤組織切片中檢測到強熒光而正常肝組織切片中未檢測到。這一發(fā)現(xiàn)表明epap能夠特異性地靶向epcam陽性hepg2腫瘤組織，而不能靶向正常肝組織。8目標給藥系統(tǒng)epap改變肝癌細胞的形態(tài)并抑制其增殖8.1對細胞形態(tài)觀察結(jié)果hepg2細胞經(jīng)過7組藥物作用72h后的形態(tài)變化見圖8a。pbs對照組的細胞貼壁生長，呈梭形，排列整齊，邊界清晰(8a-a)；epdt3組的細胞略有改變，細胞間隙也略有增大，輪廓也沒有pbs組的清晰(8a-b)。其他五個給藥組(8a-c-g)的細胞均出現(xiàn)不同程度的死亡，形態(tài)呈現(xiàn)不同程度的改變(變圓或變得不規(guī)則)，細胞間隙明顯增大，邊界變得模糊，其中5-fu(8a-c)和epap高劑量組(8a-g)表現(xiàn)最為突出。epap的3個濃度組的細胞均呈現(xiàn)類似地改變，即細胞形態(tài)先變成長梭形，然后變圓，呈網(wǎng)狀聚集，且這種改變呈現(xiàn)濃度依耐性；而5-fu組的細胞則變圓，分散存在。epap的三個組和5-fu組的細胞形態(tài)變化存在本質(zhì)上的區(qū)別，這表明epap和5-fu的作用機制肯定是不同的。8.2epap抑制hepg2細胞的增殖本通過mtt法進一步定量考察epap對hepg2、hek293和l-02細胞作用24h、48h和72h后的體外增殖抑制作用，其結(jié)果見圖8b-d。對hepg2細胞(圖8b)，和pbs組比較，給藥48h和72h后，epdt3組具有一定的細胞增殖抑制作用(p<0.05)，而其余5個給藥組都有較強的抑制效應(yīng)。epap高劑量組(moi80)的抑制作用最強(p<0.05,p<0.01)；5-fu給藥組如預期的那樣，大大降低了細胞生存率(p<0.01)。與同濃度的裸ad5-pten(moi40)比較，給藥48h和72h后，epap中劑量組(moi40)組的增殖抑制作用更強(p<0.05和p<0.01)。對hek293和l-02細胞(圖8c，d)，只有5-fu治療組對細胞增殖有抑制作用(p<0.05)，其余6組均無明顯抑制效果，這一結(jié)果說明epap對hek293和l-02細胞均無明顯毒性?；谏鲜鼋Y(jié)果，可以得出如下結(jié)論：第一，epdt3、裸ad5-pten和epap對epcam陰性hek293細胞的增殖沒有明顯抑制效應(yīng)，且對正常肝細胞l-02也無明顯毒性。其次，epdt3、ad5-pten和epap對epcam陽性hepg2細胞的有增殖抑制作用，其中，epdt3在48h和72h顯示出較弱的抑制作用。相同劑量下，epap對hepg2細胞的抑制作用明顯強于ad5-pten，這表明epdt3能增強ad5-pten的細胞增殖抑制作用。第三，5-fu降低所有細胞的存活率表明5-fu的細胞抑制作用沒有選擇性，而epap選擇性抑制epcam陽性hepg2細胞的增殖說明epap對epcam陽性的hepg2細胞有靶向性，而對epcam陰性細胞沒有靶向性。9epap抑制肝癌細胞的遷移早期的報道表明pten基因能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞的擴散和遷移，抑制腫瘤細胞，并有促進細胞凋亡、抵抗轉(zhuǎn)移和抗血管生成的特性。本研究通過劃痕愈合實驗和transwell遷移實驗考察epap對高度侵襲性的hepg2細胞的遷移抑制作用。從圖9a，c可以看出，給藥后24h和48h后，pbs對照組的細胞劃痕愈合率分別為37.89±0.72％和69.08±0.55％，與其他各給藥組比較均有顯著性差異(p＜0.05或p＜0.01)。epap對細胞遷移的抑制作用呈劑量依賴性(p＜0.05或p＜0.01)；與同濃度的裸ad5-pten比較，epap中劑量能顯著抑制細胞遷移；epap高劑量組的細胞遷移抑制作用在這兩個時間點均顯著強于5-fu組。有趣的是，epdt3在200nm下也能抑制hepg2細胞的遷移(p＜0.05)，這與mtt在48h時的檢測結(jié)果一致。而且，transwell遷移實驗在給藥后24h后得到與劃痕實驗類似的結(jié)果(圖9b，d)。這兩個實驗的結(jié)果均表明epap對hepg2細胞的遷移抑制效應(yīng)明顯強于裸ad5-pten，這說明了適配體epdt3能夠顯著增強ad5-pten對人肝癌細胞的遷移抑制作用，且在一定濃度范圍內(nèi)，這種抑制效果具有劑量和時間依耐性。10epap小鼠急性毒性實驗結(jié)果10.1小常規(guī)觀察結(jié)果昆明小鼠體內(nèi)的急性毒性實驗發(fā)現(xiàn)，5-fu組小鼠飲食減少，平均體重也下降了5.28％，并且有2只小鼠在給藥后第7天死亡(表3)。而其余六個處理組小鼠毛發(fā)、飲食及行為活動均無異常，生長良好，未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡情況。其體重均呈平穩(wěn)增長態(tài)勢，給藥后第7天其體重均升高了6-8％，但和生理鹽水對照組比較無顯著性差異(p＞0.05)。小鼠體重等常規(guī)觀察顯示一次性靜脈注射高劑量epap(1.73×1010pfu/ml)對實驗小鼠一般活動沒有明顯影響。10.2epap對小鼠臟器指數(shù)的影響臟器外觀觀察發(fā)現(xiàn)各給藥組的心、肺、腎臟與生理鹽水對照組比較均未見明顯異常，只有ad5-pten(8.64×109pfu/ml)組和epap高劑量組(1.73×1010pfu/ml)的肝臟有輕微的水腫、肥大，顏色比生理鹽水組的更淡。由表4可知，生理鹽水對照組的肝臟系數(shù)為3.3±0.267％，ad5-pten(8.64×109pfu/ml)組和epap高劑量組(1.73×1010pfu/ml)的肝臟系數(shù)分別升高到了4.2±0.294％和4.6±0.354％(p<0.05)，但其余臟器系數(shù)的變化無統(tǒng)計學意義(p>0.05)，但濃度同樣為8.64×109pfu/ml的epap組、epdt3(200nm)組和epap(4.32×109pfu/ml)組的心、肝、肺、腎的臟器系數(shù)均無明顯變化(p>0.05)。結(jié)果表明，腺病毒peg化后能降低其毒性。結(jié)合各組臟器外觀來看，目標復合物epap毒性的靶器官為肝臟，且濃度達1.73×1010pfu/ml時才可能對肝臟產(chǎn)生毒性。此外，5-fu(125mg/kg)組小鼠的心、腎臟系數(shù)較生理鹽水對照組的均顯著升高了，這提示5-fu對小鼠的心臟和肝臟可能都有毒性。表3試驗小鼠的存活數(shù)和體重變化(n＝5)table3survivalandbodyweightchangeofthetestedmice(n＝3)**p<0.01，saline組與其他給藥組比較表4實驗小鼠的臟器系數(shù)(n＝3)table4visceraindexofthetreatedmice(n＝3)*p<0.05,salinegroupvstheothertreatedgroups.10.3epap對小鼠肝腎功能的影響由表5可知，與生理鹽水對照組比較，在給藥后第3天和第7天，ad5-pten(8.64×109pfu/ml)治療組的alt和ast以及epap(1.73×1010pfu/ml)治療組的ast均顯著升高(p＜0.05)，這兩組的bun和cr無明顯變化(p>0.05)，而其余各給藥組給藥后第3d和第7d血清生化指標均無顯著變化(p>0.05)。結(jié)果表明目標復合物epap對腎功能無明顯毒性，但達到一定濃度時對小鼠的肝功能有損傷。10.4病理切片結(jié)果he染色病理切片由病理學家采取隨機雙盲原則進行觀察。圖10為各實驗組小鼠的心、肝、肺和腎在給藥后第7天的病理組織學代表圖。如圖10可知，與生理鹽水對照組相比，5-fu組的心臟有明顯病變：心肌輪廓不清、部分心肌細胞脂肪變性或橫紋肌斷裂消失；腎臟有輕微的病理變化，主要表現(xiàn)為腎小管部分血管擴張和充血，系膜細胞增殖和核染色加深。epap(1.73×1010pfu/ml)和ad5pten(8.64×109pfu/ml)組的肝臟組織均出現(xiàn)了輕微的病變，主要表現(xiàn)為肝細胞的輕度水腫、肝腫大、肝血竇狹窄和一些炎癥細胞浸潤。其余各組的心、肝、肺和腎臟結(jié)構(gòu)均正常，未出現(xiàn)明顯病變。心肌細胞排列緊密，邊界清晰，心肌細胞胞漿紅染；肝細胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，圍繞中央靜脈排列，肝血竇正常；肺泡及肺小動脈結(jié)構(gòu)清晰正常；腎細胞數(shù)量正常、分布均勻，腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰可見。表5檢測小鼠的血清生化指標表4實驗小鼠的臟器系數(shù)(n＝5)table5bloodbiochemicalparametersofserumfromthetestedmice(n＝5)*p<0.05,salinegroupvstheothertreatedgroups.以上小鼠急性毒性實驗結(jié)果表明，epap(1.73×1010pfu/ml)和ad5pten(8.64×109pfu/ml)對小鼠的肝臟均有毒性，而epap(4.32×109pfu/ml和8.64×109pfu/ml)對小鼠沒有明顯毒性。因此，選取濃度為4.32×109pfu/ml和8.64×109pfu/ml的epap用于后續(xù)研究也許更合適，但這仍需要通過接下來的體內(nèi)抗腫瘤活性實驗進行確認。11epdt3增強epap的體內(nèi)抗腫瘤活性11.1epap的腫瘤增長抑制作用因為體內(nèi)急性毒性實驗結(jié)果顯示濃度為4.32×109和8.64×109pfu/ml的epap對實驗小鼠沒有副作用，因此本實驗中，選擇4.32×109pfu/ml作為高劑量epap。移植腫瘤塊35天后，處死hepg2異位瘤裸鼠，相關(guān)結(jié)果如圖11所示。圖11a為不同藥物對hepg2裸鼠異位瘤的抗腫瘤活性的曲線圖。由圖可知，epap顯示出明顯的抗腫瘤活性(與生理鹽水組和5-fu組比較，p＜0.05或p＜0.01)，且呈劑量依耐性，其中，epap高劑量組(與生理鹽水組比較，p＜0.01)的腫瘤生長抑制作用最強；在接種腫瘤后第21天(給藥后第9天)時，中劑量epap組開始表現(xiàn)出比同濃度的ad5-ten組更高的抗腫瘤療效(p＜0.05)。各組的腫瘤圖(圖11b)表明，與生理鹽水對照組比較，其余各組均有顯著性差異。腫瘤平均重量，epdt3200nm，5-fu25mg/kg，裸ad5-pten2.16×109pfu/ml，epap(1.08×109pfu/ml)，epap(2.16×109pfu/ml)，epap(4.32×109pfu/ml)各組對hepg2腫瘤的平均抑瘤率分別為14.3±6.6％、55.4±9％、50±6.3％、46.4±6％、69.6±5.5％，和87.5±2.9％。ad5pten(2.16×109pfu/ml)和epap(2.16×109pfu/ml)處理組之間的顯著性(p＜0.05)表明，核酸適配體epdt3對腫瘤的生長也產(chǎn)生較弱的的抑制作用，且與ad5-pten的結(jié)合后，能顯著增強其ad5-pten的腫瘤抑制作用。如圖11d所示，生理鹽水組中有些裸鼠的腫瘤從原來的側(cè)面(點1)自發(fā)轉(zhuǎn)移到了頭部位置(點2)，這表明epap也許能抑制hepg2腫瘤的遷移和侵襲。此外，試驗期間，小鼠沒有發(fā)生給藥相關(guān)的死亡，且除5-fu治療組的小鼠體重降低了約12.20％外(從22.14±0.56g降低到了19.44±0.95g)，其余各組小鼠的體重均逐漸增加。這說明治療劑量下，小鼠對epap安全又耐受，而5-fu對實驗小鼠有極大毒性。11.2腫瘤組織病理學分析如圖11e，f所示，5-fu、ad5-pten和epap治療組的小鼠腫瘤組織均有典型的壞死，如核裂解、收縮，和溶解。與生理鹽水對照組相比，epdt3組的腫瘤組織平均壞死率約為15％，5-fu組為45％，ad5-pten組為50％，epap(1.08×109pfu/ml)組為50％，epap(2.16×109pfu/ml)組為70％，而epap(4.326×109pfu/ml)組為85％。此外，epap高劑量組中大多數(shù)癌細胞呈高度分化，這也進一步說明了epap能有效抑制惡性肝癌細胞的生長分化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。肝癌因其高致死率，危害極大。目前傳統(tǒng)方法仍不能根治肝癌在內(nèi)的多種癌癥，而基因治療有望克服這一難題?；趀pdt3具有epcam陽性細胞特異性靶向能力，本研究使用epdt3修飾ad5-pten，成功構(gòu)建了新的基因給藥系統(tǒng)epap。通過體外細胞攝取和體內(nèi)腫瘤組織攝取實驗，首次證實了epdt3能夠高效靶向epcam陽性的人肝癌hepg2細胞，并顯著提高pten基因?qū)θ薶epg2肝癌的治療效果，而對正常細胞和組織沒有明顯毒性。與裸ad5-pten相比，結(jié)合了epdt3的ad5-pten具有更高的穩(wěn)定性和基因表達能力，這可能是由于兩個方面的原因：首先，peg(cooh-peg2000-cooh)與epdt3的結(jié)合降低了血液循環(huán)對藥物的清除率，從而延長了藥物的半衰期；其次，peg與腺病毒的結(jié)合保留了ad5的感染能力，同時能一定程度上防止ad5受抗體中和。體內(nèi)外實驗表明，epap的抗肝癌作用可能不僅與腫瘤細胞的抑制作用有關(guān)，也與其對正常細胞和組織的毒性小有關(guān)。此外，高劑量epap(1.73×1010pfu/ml)對小鼠肝臟有毒性，表明在有肝功能損傷的情況下，此給藥系統(tǒng)的使用要慎重。本發(fā)明初步發(fā)現(xiàn)epap和5-fu的作用機制具有本質(zhì)的不同。shigdar等人研究表明，epdt3靶向到epcam后，通過內(nèi)吞作用進入細胞，該機制可用于包括化療藥物在內(nèi)的多種藥物。曾有報道稱pten在多種腫瘤中耐藥，而hsu等人發(fā)現(xiàn)pten基因過表達的細胞系對5-fu化療藥物敏感。因此，epap與5-fu聯(lián)合應(yīng)用有望成為癌癥治療的一種有效手段。特別地，epap是以peg作為連接劑，通過酰胺鍵將ad5-pten與核酸適體epdt3結(jié)合而成，而在ad5-pten的聚乙二醇化過程中，peg兩端的羧基都有可能被活化并與腺病毒反應(yīng)而形成ad5-peg-ad5，最終將沒有位置再連接適配體epdt3而得到目標產(chǎn)物epap。因此，為了解決這一問題，應(yīng)從反應(yīng)開始就嚴格控制反應(yīng)物的比例。此后sds-page電泳結(jié)果表明，反應(yīng)產(chǎn)物主要為cooh-peg-ad5-pten。另外epap的熒光強度測定、粒徑測定和tbe-page電泳鑒定結(jié)果均顯示反應(yīng)的最終產(chǎn)物為epap，表明ad5-peg-ad5產(chǎn)物是可以通過控制反應(yīng)條件避免的。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)單獨的epdt3在體內(nèi)外具有一定的抗腫瘤活性，但目前尚無法確定藥物到達體內(nèi)后，epap中的pten能否與epdt3協(xié)同作用從而放大抗腫瘤效果，因此需要進一步研究以闡明epap的抗癌機制。此外，為了改進epap，可從以下幾個方面展開工作：1)優(yōu)化epap的制備方法，如尋找更好的連接劑；2)改進劑型，如脂質(zhì)體或納米粒，從而最大限度地提高epap的抗腫瘤療效，同時降低其潛在毒性；3)將epap推廣到肝癌之外的其他腫瘤的治療；4)研究epap與其他抗癌藥物聯(lián)合用藥的療效。本發(fā)明成功合成了一種新型肝癌靶向基因藥物傳遞系統(tǒng)epap，其體內(nèi)外實驗結(jié)果顯示：1)epap在人血清中的穩(wěn)定性較裸ad5-pten高，表明ad5-pten通過peg與rna適配體epdt3連接后能夠一定程度上免受中和抗體的影響；2)適配體epdt3增強了ad5-pten在epcam陽性hepg2細胞中的表達和攝??；3)epap能夠特異性地高效靶向到epcam陽性hepg2腫瘤組織，卻不能靶向到正常肝組織；4)化療藥物5-fu的細胞抑制作用和細胞毒性對腫瘤細胞和正常細胞沒有選擇性，而epap的作用機制與其具有本質(zhì)的不同；5)epap在體內(nèi)外對hepg2細胞增殖和遷移的抑制效應(yīng)明顯強于裸ad5-pten，且在一定濃度范圍內(nèi)，這種抑制效果具有劑量和時間依耐性；6)小鼠體內(nèi)急性毒性實驗表明，epap達到一定濃度后會對肝臟有毒性作用，因此應(yīng)用epap時應(yīng)控制其濃度在安全范圍內(nèi)?？傊?，本發(fā)明成功構(gòu)建了基因治療給藥系統(tǒng)epap，其對肝癌具有很好的治療作用，而對正常細胞和組織的毒副作用很低。epap有望成為有效的抗肝癌給藥系統(tǒng)，后續(xù)還將繼續(xù)開展相關(guān)工作。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12當前第1頁12