本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種牛凝血酶的制備方法和牛凝血酶。
背景技術(shù)：
凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，也是血液凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的主要效應(yīng)蛋白酶，顯現(xiàn)出促凝和抗凝的特性。凝血酶是由在凝血酶原復(fù)合物中的非活性凝血酶原在xa因子(fxa)因子的作用下通過(guò)蛋白裂解的方式產(chǎn)生。當(dāng)循環(huán)凝血因子在暴露的血管外組織與組織因子相接觸時(shí)，凝血酶會(huì)在組織上聚集。凝血酶通過(guò)激活血小板，催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，促進(jìn)血塊穩(wěn)定而在血栓性疾病的引發(fā)和傳播上有著核心作用。
目前，國(guó)內(nèi)外主要以動(dòng)物血漿例如牛血漿為原料制備凝血酶(牛凝血酶)，也有報(bào)道從鮭魚(yú)和鴕鳥(niǎo)血漿中制備凝血酶。其提取的方法主要有等電點(diǎn)沉淀法和氫氧化鎂沉淀法。但現(xiàn)有的方法所提取的凝血酶對(duì)工藝設(shè)備條件要求高、并存在凝血酶的收率低、活性低等問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種牛凝血酶的制備方法，該方法以牛血漿為原料，采用檸檬酸鋇吸附法提取出牛凝血酶，其具有較高的收率，所提取的牛凝血酶比活高。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種牛凝血酶，由上述的制備方法所制得，該牛凝血酶具有純度和比活高的特性。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：
一種牛凝血酶的制備方法，其包括：
往含有檸檬酸鈉的抗凝牛血漿中加入bacl2溶液，離心、收集沉淀；其中，bacl2溶液濃度為0.8-1.1mol/l，bacl2溶液與所述抗凝牛血漿的體積比為(5-7)：50。
一種牛凝血酶，其根據(jù)上述牛凝血酶的制備方法所制得。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明的提供的牛凝血酶的制備方法，該制備方法以含有檸檬酸鈉的抗凝牛血漿為原料，加入bacl2溶液沉淀后，通過(guò)采用檸檬酸鋇吸附法，把依賴于維生素k的凝血因子沉淀下來(lái)，同時(shí)除去了與牛凝血酶作用的底物，降低牛凝血酶總活性的損失，提高了牛凝血酶的比活；采用本發(fā)明制備方法所制備的牛凝血酶的比活為6.34u/mg，提取率為65.15％，采用本發(fā)明提供的制備方法可以大規(guī)模制備高活力及高收率的牛凝血酶。設(shè)備要求簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模生產(chǎn)。
附圖說(shuō)明
為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。
圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的牛凝血酶溶液的sds-page分析結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的一種牛凝血酶的制備方法和牛凝血酶進(jìn)行具體說(shuō)明。
一方面，本發(fā)明提供的一種牛凝血酶的制備方法，其包括如下步驟：
s1血液分離
取新鮮牛血液，加入檸檬酸鈉抗凝，利用血球分離機(jī)進(jìn)行分離，去除血細(xì)胞，取牛血槳。
其中，檸檬酸鈉在牛血液中的終濃度優(yōu)選為3.7-3.9％，優(yōu)選為3.8％(m:v)。
s2沉淀
往含有檸檬酸鈉的抗凝牛血漿中加入bacl2溶液，離心、收集沉淀；其中，bacl2溶液濃度為0.8-1.1mol/l，bacl2溶液與上述抗凝牛血漿的體積比為(5-7)：50。
優(yōu)選地，bacl2溶液濃度為1mol/l，bacl2溶液與上述抗凝牛血漿的體積比為6：50。
s3溶解
用edta溶液溶解上述沉淀，離心、取上清液。
優(yōu)選地，edta溶液濃度為0.18-0.22mol/l、ph為7.8-8.2。
更優(yōu)選地，edta溶液濃度為0.2mol/l、ph為8.0。
s4透析
上清液用tris-hcl緩沖液透析，得到牛凝血酶酶原液。
優(yōu)選地，tris-hcl緩沖液濃度為0.048-0.052mol/l、ph為7.1-7.3。
更優(yōu)選地，tris-hcl緩沖液濃度為0.05mol/l、ph為7.2。
s5激活
牛凝血酶酶原液經(jīng)激活處理后、得到激活后的牛凝血酶粗酶液。
優(yōu)選地，往上述牛凝血酶酶原液中加入終濃度為0.009-0.012mol/l的ca2+，在26-28℃下激活1.9-2.0h。
優(yōu)選地，往上述牛凝血酶酶原液中加入終濃度為0.01mol/l的ca2+，在27℃下激活1.95h。
采用檸檬酸鋇吸附法所得的凝血酶總活性、比活均比常規(guī)的等電點(diǎn)沉淀法和氫氧化鎂沉淀法高。因?yàn)?，血漿中大部分蛋白質(zhì)是酸性蛋白，凝血酶原在等電點(diǎn)沉淀時(shí)其他的雜蛋白(包括部分纖維蛋白原)也一同沉淀下來(lái)，凝血酶的活性損失較大。
檸檬酸鋇吸附凝血酶原具有一定的選擇性，只是把依賴于維生素k的凝血因子沉淀下來(lái)，同時(shí)除去了與凝血酶作用的底物，降低凝血酶總活性的損失，提高了凝血酶的比活。
本發(fā)明提供的牛凝血酶的制備方法，可以大規(guī)模制備高活力及高收率的牛凝血酶。該制備方法對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模生產(chǎn)，制備技術(shù)達(dá)到國(guó)內(nèi)先進(jìn)水平，為國(guó)內(nèi)凝血酶制備提供先進(jìn)的技術(shù)支持。
采用本發(fā)明所提供的制備方法提取牛血中的牛凝血酶，激活后的牛凝血酶的比活為6.34u/mg，提取率為：65.15％。
進(jìn)一步地，為了得到精制的牛凝血酶，上述制備方法還可包括：
s6純化
將上述牛凝血酶粗酶液經(jīng)濃縮處理后，用deae柱層析進(jìn)行純化，得到精制的牛凝血酶溶液。
其中，濃縮處理為：用截留分子量為10kd的超濾離心管進(jìn)行濃縮處理。
deae柱層析進(jìn)行純化包括：
洗脫步驟：經(jīng)過(guò)濃縮處理后的牛凝血酶粗酶液用0-1mol/lnacl溶液線性洗脫，控制流速為0.8-1.1ml/3min，收集洗脫液，上述洗脫液經(jīng)脫鹽處理后得到上述牛凝血酶溶液。
優(yōu)選地，控制流速為1ml/3min。
優(yōu)選地，a相：50mmtris-hclph＝7.2；b相：50mmtris-hcl+1mnaclph＝7.2；a-b相進(jìn)行20cv的梯度洗脫。
其中，脫鹽處理包括：用0.048-0.052mol/l、ph為7.1-7.3的tris-hcl對(duì)上述洗脫液進(jìn)行脫鹽換液，得到上述牛凝血酶溶液。
優(yōu)選地，用0.05mol/l、ph為7.2的tris-hcl進(jìn)行脫鹽換液。
通過(guò)上述純化后，對(duì)牛凝血酶粗酶液進(jìn)行純化，純化倍數(shù)16.52，回收率76.21％。
經(jīng)純度鑒定，電泳條帶呈單一條帶，已達(dá)到電泳純，所提取的牛凝血酶的分子量約為37kd。
進(jìn)一步地，為了使所得到牛凝血酶便于儲(chǔ)存或運(yùn)輸，上述制備方法還可包括：
s7凍干
將上述牛凝血酶溶液進(jìn)行凍干處理，得到牛凝血酶凍干粉。
另一方面，本發(fā)明還提供一種牛凝血酶，其有上述牛凝血酶的制備方法所制得。
另一方面，本發(fā)明還提供一種牛凝血酶制品，其含有上述牛凝血酶。
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供的牛凝血酶的制備方法，其具體步驟如下。
1.1血液分離
取新鮮牛血液，加入檸檬酸鈉抗凝，檸檬酸鈉在牛血液中的終濃度為3.8％，利用血球分離機(jī)進(jìn)行分離，去除血細(xì)胞，取牛血槳。
1.2沉淀
1.2.1往上述100ml抗凝牛血漿中加入1mol/lbacl2溶液，bacl2溶液的加入量為牛血漿12％，即bacl2溶液與抗凝牛血漿的體積比為6:50。
1.2.2磁力攪拌1h后，于4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min，收集沉淀(檸檬酸鋇沉淀)。
1.3溶解
用0.2mol/l、ph為8.0的edta溶液溶解上述沉淀，攪拌1h，4000r/min、離心15min，棄去不溶物，取上清液。
1.4透析
上清液用0.05mol/l、ph為7.2的tris-hcl緩沖液透析，不斷更換透析液，至無(wú)ba2+為止，得到牛凝血酶酶原液。
1.5激活
牛凝血酶酶原液中加入ca2+，使其終濃度為0.01mol/l，在27℃下激活1.95h，得到激活后的牛凝血酶粗酶液。
1.6牛凝血酶的酶活性檢測(cè)
(1)酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品，用0.9％nacl溶解，分別定量稀釋成每毫升含5u、6.4u、8u和10u的酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
(2)纖維蛋白原溶液：取纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品中所含凝固物的含量，用0.9％nacl溶解配置成含1mg/ml可凝固物的溶液。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取內(nèi)徑1cm的試管4支，各準(zhǔn)確加入0.9ml纖維蛋白原溶液，37℃的水浴中保存5min，吸取上述不同濃度的酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1ml，迅速加入到各試管中，立即記時(shí)、搖勻，在37℃的水浴中觀察纖維蛋白原的初凝時(shí)間，每種濃度測(cè)5次，求平均值(當(dāng)最大值與最小值之差超過(guò)平均值的10％時(shí)重測(cè))。酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度應(yīng)控制凝結(jié)時(shí)間在14-60s為宜。以標(biāo)準(zhǔn)品酶活單位為橫坐標(biāo)，凝結(jié)時(shí)間為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(4)樣品酶活的測(cè)定：準(zhǔn)確吸取待測(cè)樣品0.1ml，按上述方法測(cè)定初凝時(shí)間，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的酶活(單位為u/ml)。
(5)比活的計(jì)算方法：牛凝血酶粗酶液的酶活(u/ml)與蛋白濃度(mg/ml)的比值；提取率的計(jì)算方法：牛凝血酶粗酶液的總活力與牛血液的總活力的比值，其中，總活力＝酶活(u/ml)×總體積(ml)。
經(jīng)檢測(cè)，激活后的牛凝血酶粗酶液的比活為6.34u/mg，提取率為65.15％。
為了得到精制的牛凝血酶，在上述步驟的基礎(chǔ)，用deae柱層析進(jìn)行純化，操作如下。
1.6純化
1.6.1deae-52的預(yù)處理
稱取一定量deae-52(whatman公司)與10ml量筒中，用蒸餾水浸泡12h，觀察溶脹后的體積，根據(jù)層析柱柱床體積計(jì)算試驗(yàn)中deae-52用量。
準(zhǔn)確稱取4gdeae-52纖維素用蒸餾水浸泡12h，期間多次換水以除去表面漂浮顆粒。布氏漏斗抽干，置于0.5mol/lhcl溶液中浸泡1h，離子水多次漂洗使其ph至中性；再置于0.5mol/lnaoh溶液中浸泡1h，離子水多次漂洗使其ph至中性。處理完畢后保存?zhèn)溆谩?/p>
1.6.2裝柱
取清洗干凈的層析柱(xk16(16mm*20mm)，ge公司)，垂直固定到鐵架臺(tái)上，打開(kāi)層析柱下出液口，取備用的edae-52，混勻后分多次緩慢倒入層析柱內(nèi)，使其自然沉降，待柱高達(dá)試驗(yàn)要求后停止裝柱。注意層析柱不能出現(xiàn)截面和氣泡，要保證填料的的致密均勻，否則，重新裝柱。
1.6.3平衡
打開(kāi)恒流泵，用3-5倍柱床體積0.05mol/l、ph7.2的tris-hcl緩沖液平衡層析柱，控制流速為1ml/3min。
1.6.4上樣
將上述牛凝血酶粗酶液經(jīng)截留分子量為10kd的超濾離心管進(jìn)行濃縮處理。
打開(kāi)層析柱下出液口，待柱內(nèi)液面高度為1mm時(shí)，將濃縮后的牛凝血酶粗酶液沿層析柱四周環(huán)繞注入，待酶液達(dá)一定高度后再與柱中間小心加樣，上樣量不宜過(guò)大，一般控制在柱床體積的1％-5％(體積分?jǐn)?shù))。樣液全部進(jìn)入層析柱后，用2-3倍柱床體0.05mol/lph7.2的tris-hcl緩沖液過(guò)柱，洗出未被吸附物質(zhì)。
1.6.5洗脫
洗脫步驟：用0-1mol/lnacl(0.05mol/lph7.2的tris-hcl)溶液線性洗脫，控制流速為1ml/3min，收集洗脫液。
a相：50mmtris-hclph＝7.2；b相：50mmtris-hcl+1mnaclph＝7.2；a-b相進(jìn)行20cv的梯度洗脫。
1.6.6脫鹽
洗脫液經(jīng)10kd的超濾膜包0.05mol/lph7.2的tris-hcl進(jìn)行脫鹽換液，得到精制的牛凝血酶溶液。
1.6.7檢測(cè)精制的牛凝血酶溶液的酶活。
純化倍數(shù)的計(jì)算方法：牛凝血酶溶液的比活與牛凝血酶粗酶液的比活的比值；回收率的計(jì)算方法：牛凝血酶溶液的總活力與牛凝血酶粗酶液的總活力的比值。
通過(guò)上述純化后，對(duì)牛凝血酶粗酶液進(jìn)行純化，純化倍數(shù)16.52，回收率76.21％。經(jīng)純度鑒定，電泳條帶呈單一條帶(如圖1所示，圖中：m為maker，1為牛凝血酶粗酶液，2為純化后的牛凝血酶溶液)，已達(dá)到電泳純，所提取的牛凝血酶的分子量約為37kd。
進(jìn)一步地，為了使所得到牛凝血酶便于儲(chǔ)存或運(yùn)輸，在上述步驟的基礎(chǔ)上，本實(shí)施例提供的制備方法還包括：
1.7凍干
將上述牛凝血酶溶液放入凍干機(jī)(scientz-50nd，寧波新芝公司)進(jìn)行凍干，得到牛凝血酶凍干粉。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供的牛凝血酶的制備方法，其具體步驟如下。
2.1血液分離
(同實(shí)施例1)。
2.2沉淀
2.2.1取100ml抗凝牛血漿，加入0.8mol/lbacl2溶液，bacl2溶液的加入量為牛血漿10％，即bacl2溶液與抗凝牛血漿的體積比為5:50。
2.2.2離心(同實(shí)施例1)，收集沉淀；
2.3溶解
用0.18mol/l、ph為7.8的edta溶液溶解上述沉淀，攪拌1h，4000r/min、離心15min，棄去不溶物，取上清液。
2.4透析
上清液用0.048mol/l、ph為7.1的tris-hcl緩沖液透析，不斷更換透析液，至無(wú)ba2+為止，得到牛凝血酶酶原液。
2.5激活
牛凝血酶酶原液中加入ca2+，使其終濃度為0.009mol/l，在26℃下激活1.9h，得到激活后的牛凝血酶粗酶液。
2.6純化
2.6.1deae-52的預(yù)處理
(同實(shí)施例1).
2.6.2裝柱
(同實(shí)施例1)。
2.6.3平衡
(同實(shí)施例1)。
2.6.4上樣2
(實(shí)施例1)
2.6.5洗脫
洗脫步驟：用0-1mol/lnacl(0.05mol/lph7.2的tris-hcl)溶液線性洗脫，控制流速為0.8ml/3min，收集洗脫液。
a相：50mmtris-hclph＝7.2；b相：50mmtris-hcl+1mnaclph＝7.2；a-b相進(jìn)行20cv的梯度洗脫。
2.6.6脫鹽
洗脫液經(jīng)10kd的超濾膜包0.048mol/lph7.1的tris-hcl進(jìn)行脫鹽換液，得到精制的牛凝血酶溶液。
2.7凍干
將上述牛凝血酶溶液放入凍干機(jī)進(jìn)行凍干，得到牛凝血酶凍干粉。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供的牛凝血酶的制備方法，其具體步驟如下。
3.1血液分離
(同實(shí)施例1)。
3.2沉淀
3.2.1取100ml抗凝牛血漿，加入1.1mol/lbacl2溶液，bacl2溶液的加入量為牛血漿14％，即bacl2溶液與抗凝牛血漿的體積比為7:50。
3.2.2離心(同實(shí)施例1)，收集沉淀；
3.3溶解
用0.22mol/l、ph為8.2的edta溶液溶解上述沉淀，攪拌1h，4000r/min、離心15min，棄去不溶物，取上清液。
3.4透析
上清液用0.052mol/l、ph為7.3的tris-hcl緩沖液透析，不斷更換透析液，至無(wú)ba2+為止，得到牛凝血酶酶原液。
3.5激活
牛凝血酶酶原液中加入ca2+，使其終濃度為0.012mol/l，在28℃下激活2.0h，得到激活后的牛凝血酶粗酶液。
3.6純化
3.6.1deae-52的預(yù)處理
(同實(shí)施例1).
3.6.2裝柱
(同實(shí)施例1)。
3.6.3平衡
(同實(shí)施例1)。
3.6.4上樣
(實(shí)施例1)
3.6.5洗脫
洗脫步驟：用0-1mol/lnacl(0.05mol/lph7.2的tris-hcl)溶液線性洗脫，控制流速為1.1ml/3min，收集洗脫液。
a相：50mmtris-hclph＝7.2；b相：50mmtris-hcl+1mnaclph＝7.2；a-b相進(jìn)行20cv的梯度洗脫。
3.6.6脫鹽
洗脫液經(jīng)10kd的超濾膜包0.052mol/lph7.3的tris-hcl進(jìn)行脫鹽換液，得到精制的牛凝血酶溶液。
3.7凍干
將上述牛凝血酶溶液放入凍干機(jī)進(jìn)行凍干，得到牛凝血酶凍干粉。
綜上，本發(fā)明的提供的牛凝血酶的制備方法，該制備方法以含有檸檬酸鈉的抗凝牛血漿為原料，加入bacl2溶液沉淀后，通過(guò)采用檸檬酸鋇吸附法，把依賴于維生素k的凝血因子沉淀下來(lái)，同時(shí)除去了與牛凝血酶作用的底物，降低牛凝血酶總活性的損失，提高了牛凝血酶的比活；采用本發(fā)明制備方法所制備的牛凝血酶的比活為6.34u/mg，提取率為：65.15％，純化后的回收率可達(dá)76.21％，純化倍數(shù)16.52，采用本發(fā)明提供的制備方法可以大規(guī)模制備高活力及高收率的牛凝血酶。設(shè)備要求簡(jiǎn)單、適合大規(guī)模生產(chǎn)。該制備方法達(dá)到國(guó)內(nèi)先進(jìn)水平，為國(guó)內(nèi)凝血酶制備提供先進(jìn)的技術(shù)支持。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。