本發(fā)明涉及一種用于免疫細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液。
背景技術：
：免疫細胞是指參與免疫應答或免疫應答相關的細胞，包括淋巴細胞、樹突狀細胞、單核細胞等。免疫細胞和免疫器官組成免疫系統(tǒng)，保護機體不受侵害。人的免疫力在20歲的時候達到巔峰，40歲時只有巔峰時的1/2，到了70歲更是只剩下巔峰時期的1/10。免疫力下降意味著免疫細胞對抗病毒、細菌以及癌變的能力逐年降低，患病風險也相對提高。免疫細胞異常，可能引起各種嚴重疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡，原因是體內(nèi)有大量致病性自身抗體和免疫復合物而造成組織損傷。癌癥的發(fā)生，原因是腫瘤細胞逃逸免疫細胞的監(jiān)控而進行無節(jié)制的生長。因此將健康時的免疫細胞儲存，以供需要時再擴增并輸回使用，成為當前醫(yī)療科技界的新選擇。當發(fā)生癌癥等疾病，可用存儲的免疫細胞及時采取免疫細胞療法治療；同時，也可用來提高人體免疫力、抗衰老以及預防腫瘤。免疫細胞療法是繼手術、放療、化療三大傳統(tǒng)手段后的新支柱性治療手段，旨在激活自身的免疫系統(tǒng)，依靠免疫機能殺滅癌細胞和腫瘤組織的抗癌療法，其最大的優(yōu)勢在于個體性、安全性、靶向性和高效性。cik細胞，即細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-inducedkiller，cik)是一種新型的免疫活性細胞，cik增殖能力強，細胞毒作用強，具有一定的免疫特性。該細胞對腫瘤細胞的識別能力很強，尤其對手術或放化療后患者效果顯著，能消除殘留微小的轉移病灶，防止癌細胞擴散和復發(fā)，提高機體免疫力，其在臨床應用中功效已得到充分證實。當cik細胞在體外擴增至一定數(shù)量時，再回輸至患者體內(nèi)，采用cik細胞殺傷達到抗腫瘤的目的。因此，cik細胞被認為是新一代的腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。cik細胞數(shù)量和殺傷功能與療效直接相關，研究顯示，隨著抗腫瘤免疫細胞數(shù)量增加，對腫瘤的殺傷效果成線性增加。但是目前cik細胞培養(yǎng)方法，獲得高純度，足夠數(shù)量的cik細胞非常困難。傳統(tǒng)使用的白介素2、ifn-γ純度低(20-30％)，擴增后的cik細胞殺傷功能低下，不能滿足臨床需求。本發(fā)明在基礎培養(yǎng)基基礎上添加自體血漿、人血白蛋白、硫酸慶大霉素、白細胞介素-2、碳酸氫鈉、植酸、維生素c，解決cik數(shù)量和純度的問題，能定向擴增激活cik細胞，滿足臨床治療需求。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明實施的目的在于克服上述體外培養(yǎng)中常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)數(shù)量不足、純度低問題，提供一種用于免疫細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基及應用。本發(fā)明提供的用于免疫細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基、自體血漿、人血白蛋白、硫酸慶大霉素、白細胞介素-2、碳酸氫鈉、植酸、維生素c。所述基礎培養(yǎng)基具體為gibcomediumctstm培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中含有l(wèi)-谷酰酰胺，50μg/ml硫酸鏈霉素和10μg/ml硫酸慶大霉素。附圖說明圖1為在基礎培養(yǎng)液培養(yǎng)時，培養(yǎng)的免疫細胞在4倍顯微鏡倍數(shù)下的生長狀態(tài)。圖2為在本發(fā)明的培養(yǎng)液時，培養(yǎng)的免疫細胞在4倍顯微鏡倍數(shù)下的生長狀態(tài)。具體實施方案為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下對本發(fā)明進行進一步詳細說明，而非限制本發(fā)明。本發(fā)明提出一種培養(yǎng)液培養(yǎng)免疫細胞，包括如下步驟：1、培養(yǎng)基的配置：1000ml基礎培養(yǎng)液中含有以下成分：2、人外周血體外分離獲得單核細胞：1)采集志愿者外周血50ml，抗凝劑為肝素鈉，將采集到的血液在生物安全柜里轉移到新離心管中，500g離心10min，離心完畢后，上層制備自體血漿，下層血細胞分離制備單核細胞。2)將人外周血血細胞與生理鹽水按照體積比(1-2)：1混合均勻，得稀釋后的細胞懸液，將稀釋后的細胞懸液緩慢加入含淋巴細胞分離液的離心管內(nèi)，細胞懸液與分離液體積比為(1-2)：1。3)將離心管轉移至離心機，600g離心20min。4)用移液管輕輕移去上清液，收集白膜層細胞，并用生理鹽水離心洗滌兩次，即得到外周血單個核細胞。3、人外周血體外分離獲得自體血漿：1)采集志愿者外周血50ml，抗凝劑為肝素鈉，將采集到的血液在生物安全柜里轉移到新離心管中，500g離心10min，離心完畢后，上清液轉移到新離心管中，封口膜密封。2)離心管放入56℃恒溫水浴鍋中滅菌30-45min，水浴完畢后，用噴有75％酒精的無塵布拭擦離心管，900g離心10min，收集上清液，即為自體血漿。4、培養(yǎng)觀察：1)對照組：用少量培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞放置在基礎培養(yǎng)液內(nèi)，轉移到t75培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)。2)實驗組：用少量培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞放置在本發(fā)明配制的培養(yǎng)液內(nèi)，轉移到t75培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)。3)培養(yǎng)第二天，添加細胞誘導因子100iu/μlifn-γ和10iu/μlil-1，定向誘導單核細胞。整個培養(yǎng)過程中，每隔一天，觀察細胞生長狀態(tài)，并根據(jù)細胞計數(shù)，添加培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細胞濃度為1～2×106個/ml。4)在培養(yǎng)的第11天時收集對照組細胞和實驗組細胞，用血液分析儀進行細胞計數(shù)，計算細胞總量，并用流式細胞分析儀進行細胞比例的分析。結果：a.使用本發(fā)明中的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至11天時，細胞數(shù)量明顯高于基礎培養(yǎng)液，且達到顯著性差異，說明本發(fā)明中的培養(yǎng)液能有效的提高細胞數(shù)量。附圖為倒置顯微鏡4倍下細胞生長狀態(tài)。圖1為基礎培養(yǎng)液培養(yǎng)的免疫細胞的生長狀態(tài)，圖2為使用本發(fā)明的培養(yǎng)液培養(yǎng)的免疫細胞的生長狀態(tài)。b.使用本發(fā)明中的培養(yǎng)液，實驗組cd3+cd8+、cd3+cd56+比例高于對照組，表明使用本發(fā)明中的培養(yǎng)液，單核細胞誘導成cik細胞純度提高。表1為流式細胞檢測結果比較。表1組別cd3+cd8+cd3+cd56+對照組52.6％±1.6418.5％±1.38實驗組89.6％±0.8941.2％±1.17與現(xiàn)有培養(yǎng)基相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：1、本發(fā)明在培養(yǎng)液中添加自體血漿，解決動物血清異源、質量不穩(wěn)定影響培養(yǎng)問題，而且自體血漿中含有促進細胞生長的各種激素和生長因子等更有利于細胞生長。2、本發(fā)明在培養(yǎng)液中添加人血白蛋白和碳酸氫鈉，減少細胞代謝過程對ph變化的影響，維持細胞生長內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，高活率生長。3、本發(fā)明在培養(yǎng)液中添加維生素c，維持細胞代謝的穩(wěn)定性和清除細胞代謝產(chǎn)生的自由基等氧化物質。4、本發(fā)明在培養(yǎng)液中添加植酸，作為一種抗氧化劑，能有效的解決培養(yǎng)液中各成分因開封氧化而降解的問題，保證培養(yǎng)液各成分的穩(wěn)定。5、本發(fā)明在培養(yǎng)液中添加硫酸慶大霉素，提高抗生素的濃度，能更有效的抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長，確保培養(yǎng)細胞的安全性。本發(fā)明提供的培養(yǎng)液含有自體血漿、人血白蛋白、硫酸慶大霉素、白細胞介素-2、碳酸氫鈉、植酸、維生素c，最大限度的模擬細胞生長內(nèi)環(huán)境，保證細胞培養(yǎng)效果。應用本發(fā)明提供的培養(yǎng)液培養(yǎng)免疫細胞，可滿足細胞遺傳學研究、臨床治療需求，如治療各種實質性腫瘤。本發(fā)明培養(yǎng)液成分的添加，部分探索過程見表2，每種成分都做單因素試驗，以確定最優(yōu)的組合。取細胞懸液計數(shù)，時間為培養(yǎng)的第11天。表2由上表可知，僅用基礎培養(yǎng)液培養(yǎng)，第11天，細胞數(shù)量為(3.90±0.42)×109個，當添加抗生素硫酸慶大霉素、緩沖劑碳酸氫鈉、抗氧化劑植酸和維生素c穩(wěn)定細胞培養(yǎng)液酸堿度后，細胞的數(shù)量為(4.32±0.35)×109個，增幅不大。當在此基礎上添加自體血漿后，細胞數(shù)量為(4.83±0.26)×109個、添加人血白蛋白后，細胞數(shù)量為(4.94±0.86)×109個，添加白細胞介素-2后，細胞數(shù)量為(4.88±0.64)×109個。當自體血漿和人血白蛋白混合加入后，細胞數(shù)量約為(5.86±0.38)×109個，自體血漿和白細胞介素-2混合加入后，細胞數(shù)量約為(5.75±0.29)×109個，人血白蛋白和白細胞介素-2混合加入后，細胞數(shù)量約為(5.75±0.29)×109個。當自體血漿、人血白蛋白和白細胞介素-2均加入基礎培養(yǎng)液后，細胞數(shù)量約為(7.04±0.24)×109個，約為在基礎培養(yǎng)液培養(yǎng)數(shù)量的2倍，說明本發(fā)明中添加的成分能有效提高細胞數(shù)量。當前第1頁12