本發(fā)明屬于基因工程和腫瘤生物治療領(lǐng)域，具體涉及一種含ccl5和sstr2基因的重組痘病毒及其制備方法。

背景技術(shù)：

溶瘤痘病毒作為一種腫瘤治療藥物和基因治療載體近年來(lái)發(fā)展迅速，痘病毒攜帶抗癌基因可提高其溶瘤效應(yīng)，許多基因改造的靶向性溶瘤痘病毒相繼進(jìn)入臨床試驗(yàn)，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的溶瘤痘病毒中，插入gm-csf基因的wyeth株重組痘病毒jx-594是最早進(jìn)入臨床試驗(yàn)的重組痘病毒，也是目前臨床試驗(yàn)研究最多的重組痘病毒。

在jx-594的已完成的ⅰ、ⅱ期臨床試驗(yàn)中，并無(wú)明顯客觀療效報(bào)道，為提高溶瘤痘病毒的療效，ⅲ期臨床試驗(yàn)中jx-594瘤內(nèi)注射聯(lián)合化療藥物索拉菲尼協(xié)同抗腫瘤作用，該計(jì)劃正在招募中，療效還未可知。而進(jìn)入臨床試驗(yàn)的重組痘病毒給藥方式為瘤內(nèi)注射或靜脈注射，由于各種免疫、生化或物理屏障的作用，導(dǎo)致病毒遞送效率很低，病毒進(jìn)入體內(nèi)后很快被補(bǔ)體、抗病毒抗體及各種吞噬細(xì)胞等破壞，不能發(fā)揮有效的抗腫瘤作用，這也是之前的重組痘病毒未能發(fā)揮完全溶瘤作用的原因之一。cik細(xì)胞具有向腫瘤組織聚集的特性，同時(shí)大量臨床應(yīng)用證明cik細(xì)胞大劑量回輸?shù)陌踩?，用cik細(xì)胞荷載重組痘病毒就顯示出明顯的優(yōu)越性。

而痘病毒的溶瘤潛能取決于所選擇的病毒株，研究已顯示，與wyeth、lister和copenhangen株均具有溶瘤潛能，而wr株具有最強(qiáng)的溶瘤效應(yīng)，顯然與wyeth等其它痘病毒株相比，痘病毒wr株具有更強(qiáng)的感染力和細(xì)胞裂解能力，并有悠久的實(shí)驗(yàn)室研究背景且完成了基因組全序列的測(cè)定，因此痘病毒wr株是作為構(gòu)建重組痘病毒的首選。含人ccl5和人sstr2基因的重組溶瘤痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+尚未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種含ccl5和sstr2基因的重組痘病毒，其為含有人ccl5和人sstr2基因的wr株重組痘病毒。

本發(fā)明方法利用ccl5與cik細(xì)胞表面高表達(dá)的ccr5相匹配的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)以及sstr2可以定向誘導(dǎo)奧曲肽靶向抑制腫瘤的特點(diǎn)，可顯著提高重組痘病毒的靶向溶瘤活性，使荷載重組痘病毒的cik細(xì)胞免疫治療的安全性得到保障，對(duì)cik細(xì)胞荷載重組病毒聯(lián)合奧曲肽靶向腫瘤細(xì)胞的免疫治療在臨床的推廣應(yīng)用起到了積極的作用。

psc65質(zhì)粒具有與痘病毒tk基因同源的側(cè)翼序列，可用作重組外源基因至痘病毒基因組的載體。將目的基因ccl5和sstr2以及熒光素酶報(bào)告基因luciferase克隆至psc65中得到重組的痘病毒真核表達(dá)載體psc65-ccl5-sstr2-luc+，并與野生型痘病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組得到重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+。

上述含ccl5和sstr2基因的重組痘病毒的制備方法，

（1）分別以含人ccl5和人sstr2cdna序列的質(zhì)粒為模板，采用如下引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將pcr產(chǎn)物和psc65質(zhì)粒分別經(jīng)內(nèi)切酶酶切、電泳、切膠純化回收，獲得相應(yīng)dna片段，然后連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性細(xì)菌克隆小提質(zhì)粒，其中人ccl5基因插入p7.5啟動(dòng)子下游，人sstr2基因插入pe/l啟動(dòng)子下游；陽(yáng)性細(xì)菌克隆小提質(zhì)粒經(jīng)pcr、電泳和測(cè)序鑒定序列正確者命名為psc65-ccl5-sstr2-luc+；

ccl5f：5’-agcgcagagggcagtagcaat-3’

ccl5r：5’-tgatgtactcccgaaccca-3’；

sstr2f：5’-aagcaggctggtaccggtccggaattccc-3’

sstr2r：5’-ataggccggccaggatcgatccagacatgat-3’；

（2）將psc65-ccl5-sstr2-luc+質(zhì)粒與痘病毒wr株進(jìn)行同源重組，然后篩選陽(yáng)性重組子，經(jīng)純化、驗(yàn)證，最終獲得含人ccl5和sstr2基因的重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+；

（3）檢測(cè)cik細(xì)胞荷載重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+體外殺傷腫瘤的效應(yīng)。

重組痘病毒表達(dá)ccl5，與cik細(xì)胞表面高表達(dá)的ccr5相匹配具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，且荷載該重組溶瘤痘病毒的cik細(xì)胞高效殺傷腫瘤細(xì)胞后，釋放出的溶瘤痘病毒能發(fā)揮二次殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，隨之所產(chǎn)生的在腫瘤區(qū)域穩(wěn)定且持續(xù)的高濃度趨化因子ccl5使腫瘤細(xì)胞從無(wú)免疫原性變?yōu)閺?qiáng)免疫原性，不但激活和增強(qiáng)機(jī)體的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，定向誘導(dǎo)t、nk細(xì)胞靶向殺傷腫瘤，同時(shí)，還將募集更多荷載了該重組溶瘤病毒的cik細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位，發(fā)揮“免疫/溶瘤”雙重協(xié)同抗腫瘤作用。

腫瘤細(xì)胞中是否有sstr2基因的表達(dá)，及其表達(dá)水平的高低，將直接影響到ssa對(duì)腫瘤的治療效果。其中，奧曲肽（oct,sms201-995）是最常用的ssa，能與sstr2特異性結(jié)合。通過(guò)重組sstr2基因的溶瘤病毒將其導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，提高sstr2在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)水平，將精確定向并誘導(dǎo)奧曲肽到達(dá)腫瘤部位抑制腫瘤生長(zhǎng)。

構(gòu)建含ccl5和sstr2基因的重組痘病毒，后期實(shí)驗(yàn)中利用cik細(xì)胞荷載該痘病毒，不僅避免重組痘病毒被機(jī)體免疫系統(tǒng)所清除，而且cik細(xì)胞殺傷腫瘤后釋放的攜帶抗癌基因ccl5和sstr2的重組痘病毒，又可發(fā)揮二次殺傷腫瘤的效應(yīng)，發(fā)揮出“細(xì)胞-基因-病毒”的協(xié)同抗腫瘤作用。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果如下：

（1）本發(fā)明運(yùn)用的分子水平技術(shù)簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定可靠；

（2）通過(guò)本發(fā)明制備得到的重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+具有插入外源基因容量大而其遺傳穩(wěn)定性不受影響的優(yōu)點(diǎn)；

（3）通過(guò)本發(fā)明制備得到的重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制增殖，并不摻入真核細(xì)胞基因組內(nèi)，不受宿主基因組的影響；

（4）通過(guò)本發(fā)明制備得到的重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+是一種溶細(xì)胞病毒，復(fù)制周期快，細(xì)胞受感染后在三天內(nèi)死亡，且宿主范圍廣，可在體外一定期限內(nèi)不斷擴(kuò)大培養(yǎng)，且活性穩(wěn)定，適用于批量生產(chǎn)；

（5）本發(fā)明得到的重組溶瘤痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+自身攜帶一個(gè)失活的tk基因，用于增強(qiáng)病毒的腫瘤殺傷特異性；這一特性使得該溶瘤病毒不僅可利用腫瘤細(xì)胞自身表達(dá)的tk幫助病毒自身復(fù)制，直接發(fā)揮溶瘤作用；并且，由于其無(wú)法有效利用正常細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制裝置，不能在正常細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，因此具有良好的安全性；

（6）通過(guò)本發(fā)明制得重組痘病毒后，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)估cik細(xì)胞介導(dǎo)rvv-ccl5-sstr2-luc+聯(lián)合奧曲肽靶向殺傷大腸癌細(xì)胞的療效，為后期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討cik細(xì)胞介導(dǎo)rvv-ccl5-sstr2-luc+靶向治療大腸癌發(fā)揮溶瘤效應(yīng)的作用機(jī)制提供前期準(zhǔn)備和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為重組質(zhì)粒psc65-ccl5-sstr2-luc+的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖，其中圖a為ccl5-luc片段（約2000bp）pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖，泳道1：dnamarker，泳道2-9：psc65-ccl5-luc單克隆pcr產(chǎn)物鑒定；圖b為sstr2片段（約1110bp）pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖，泳道1：dnamarker，泳道2-8：sstr2單克隆鑒定pcr產(chǎn)物；

圖2為用同源重組方法構(gòu)建重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+的原理圖；

圖3a為wb檢測(cè)rvv-ccl5-sstr2-luc+感染hela細(xì)胞60h后sstr2蛋白表達(dá)水平，b為相應(yīng)組條帶的灰度分析，結(jié)果表明雙基因病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+的sstr2蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照病毒rvv-luc+（**p<0.01）；

圖4為elisa檢測(cè)rvv-ccl5-sstr2-luc+感染hela細(xì)胞60h后上清中ccl5蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明雙基因病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+的ccl5蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照病毒rvv-luc+（*p<0.05）；

圖5為cck8檢測(cè)cik細(xì)胞荷載重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+并聯(lián)合奧曲肽抑制腫瘤細(xì)胞的增殖情況，其中a為其對(duì)大腸癌細(xì)胞dld1增殖的抑制，b為其對(duì)大腸癌細(xì)胞hct116增殖的抑制，c為其對(duì)宮頸癌細(xì)胞hela增殖的抑制。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明的，均采用常規(guī)方法。

實(shí)施例1：含ccl5和sstr2基因的重組痘病毒的制備方法，具體內(nèi)容如下：

1、主要材料

（1）bs-c-1（3142c0001000000033），非洲綠猴腎細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)（chinacenterfortypeculturecollection,cctcc），bsc-1細(xì)胞是病毒載體轉(zhuǎn)染的理想宿主，用于同源重組和病毒滴度測(cè)定。

（2）143b（atcc^?crl-8303tm），人骨肉瘤細(xì)胞系，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（americantypeculturecollection,atcc），143b細(xì)胞是一株人胸腺激酶缺陷（tk^-）的細(xì)胞系，用于重組痘病毒的篩選。

（3）hela：人子宮頸癌細(xì)胞系，dld1：結(jié)腸癌細(xì)胞系，hct116：結(jié)直腸癌細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù)-中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。

（4）psc65，購(gòu)自biovector中國(guó)質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心-ntcc國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心，作為構(gòu)建人ccl5和sstr2基因的痘病毒真核表達(dá)載體質(zhì)粒。含t2a-luc的克隆載體質(zhì)粒phblv-cmvie-zsgreen-t2a-luc和含ccl5和sstr2基因的克隆載體質(zhì)粒pdonr223購(gòu)自上海漢恒生物科技有限公司。

（5）痘病毒vacciniavirus（atcc^?vr-1354tm），（wr,nihtc-adapted）株，購(gòu)自biovector中國(guó)質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心-ntcc國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心，作為病毒載體。

細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板均為corning公司（美國(guó)）產(chǎn)品；formaco2培養(yǎng)箱（美國(guó)）；nikon倒置顯微鏡（日本）；大腸桿菌菌株dh5α購(gòu)自invitrogen（美國(guó)）；限制性內(nèi)切酶、凝膠回收試劑盒購(gòu)自axygen（美國(guó)）；質(zhì)粒dna小、大量抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；hyclonerpmi-1640、mem購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)操作均在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞操作間進(jìn)行，病毒擴(kuò)大及培養(yǎng)操作在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

2、重組人ccl5、sstr2基因的痘病毒真核表達(dá)載體psc65-ccl5-sstr2-luc+的分步構(gòu)建

引物設(shè)計(jì)與合成：在ncbi上搜索psc65質(zhì)粒的全序列sequence57frompatentwo9932646并參考相關(guān)文獻(xiàn)，用blast系統(tǒng)對(duì)各部分序列進(jìn)行比對(duì)分析?？芍撡|(zhì)粒全長(zhǎng)7252bp，以pbr322為主要骨架(堿基5091-6931)，包含pbr322的rep復(fù)制子和amp抗性基因。外源基因在合成的早晚期啟動(dòng)子pe/l和p7.5的指導(dǎo)下表達(dá)，同時(shí)載體上還帶有用于同源重組的病毒tk基因的左右側(cè)翼。使用primerprimer5軟件，參照人ccl5[nm_002985.2]和人sstr2[nm_001050]基因分別設(shè)計(jì)合成引物，引入合適酶切位點(diǎn)，將ccl5和sstr2分別插入psc65質(zhì)粒的p7.5和pe/l啟動(dòng)子下游，此外在ccl5后連接t2a自裂肽再連接luciferase，即p7.5啟動(dòng)子下游為：ccl5-t2a-luc+；

ccl5f：5’-agcgcagagggcagtagcaat-3’

ccl5r：5’-tgatgtactcccgaaccca-3’；

sstr2f：5’-aagcaggctggtaccggtccggaattccc-3’

sstr2r：5’-ataggccggccaggatcgatccagacatgat-3’；

構(gòu)建步驟如下：（1）xho/eco雙酶切psc65載體，切除掉lacz(約3kb)，然后克隆入ccl5-t2a-luc，構(gòu)建psc65-ccl5-t2a-luc重組載體。

酶切體系（37℃孵育2h）：

；

載體酶切完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定和膠回收。

目的片段與載體連接，反應(yīng)體系為（連接液在37℃溫育30min）：

；

將連接后的片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆菌落，并進(jìn)行菌液pcr經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1a）和測(cè)序鑒定，鑒定正確者命名為pcs65-ccl5-luc，可進(jìn)行下一步的構(gòu)建工作。

（2）kpni單酶切psc65-ccl5-t2a-luc重組載體，插入sstr2序列，完成psc65-ccl5-sstr2-luc重組載體的構(gòu)建

酶切體系如下（37℃孵育2h）：

；

將處理好的目的片段與酶切后載體連接（37℃下孵育30min），反應(yīng)體系為：

；

連接后產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板以及挑選陽(yáng)性克隆搖菌并進(jìn)行菌液pcr，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1b）和測(cè)序鑒定后，序列正確者命名為psc65-ccl5-sstr2-luc+，大提質(zhì)粒，保存?zhèn)溆谩?/p>

3、psc65-ccl5-sstr2-luc+轉(zhuǎn)染經(jīng)痘病毒wr株感染的細(xì)胞（同源重組（圖2）），并完成重組痘病毒ccl5和sstr2的表達(dá)驗(yàn)證

前一天接種bs-c-1細(xì)胞于六孔板中，5×10⁵cell/孔，待bs-c-1細(xì)胞長(zhǎng)至70-80%融合度時(shí)，棄培養(yǎng)液，加入lml經(jīng)mem稀釋的痘病毒wr株，病毒滴度為moi=0.05pfu/cell，bs-c-1細(xì)胞經(jīng)wr痘病毒感染l-2h后，用lipofectamine2000（invitrogen）將重組質(zhì)粒psc65-ccl5-sstr2-luc+轉(zhuǎn)染細(xì)胞，37℃5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h；棄上清，加入3ml含10%fbs的mem培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天；培養(yǎng)期間于顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，直至大部分細(xì)胞展示出被感染的病理現(xiàn)象，收集細(xì)胞離心重懸于lmlmem中，分別依次置于-80℃和37℃水浴中凍融，重復(fù)凍融三次；超聲波處理以上凍融液1min后，300×g，4℃，離心5min，將上清轉(zhuǎn)入一干凈的ep管中，即為混合病毒液（含重組痘病毒和野生型痘病毒）?；旌喜《疽航?jīng)篩選純化、擴(kuò)增，并提取重組痘病毒dna，通過(guò)pcr分析，確定正確的重組痘病毒，即命名為攜帶了ccl5和sstr2基因并以luc為報(bào)告基因的重組痘病毒：rvv-ccl5-sstr2-luc+。

4、蔗糖梯度離心法濃縮純化重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+

離心機(jī)轉(zhuǎn)頭預(yù)冷至4℃，取以上hela細(xì)胞培養(yǎng)重組病毒凍融液轉(zhuǎn)入50ml離心管，300×g，4℃，離心5min，棄沉淀，取上清；將上清緩慢加在2倍體積36%蔗糖溶液之上，12500rpm,4℃，離心80min，小心移除上清，沉淀即為重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+，將沉淀懸浮于約10ml10mmtris-hcl(ph9.0)中；重復(fù)36%蔗糖純化步驟1次，最終將重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+懸浮于1ml10mmtris-hcl(ph9.0)中，-80℃保存，待滴度測(cè)定確定重組痘病毒滴度（pfu/ml）。

實(shí)施例2：rvv-ccl5-sstr2-luc+感染大腸癌細(xì)胞系后，wb檢測(cè)sstr2和elisa檢測(cè)ccl5蛋白表達(dá)水平

前一天接種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系（hct116,dld1）于六孔板中，37℃5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。重組痘病毒感染hela細(xì)胞60h后收取上清和細(xì)胞，其中上清用elisa檢測(cè)ccl5蛋白表達(dá)水平，細(xì)胞提取總蛋白wb檢測(cè)sstr2蛋白水平，結(jié)果顯示感染rvv-ccl5-sstr2-luc+組的sstr2蛋白在hela細(xì)胞中表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組rvv-luc+（p＜0.01）（圖3）。圖4結(jié)果表明雙基因病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+的ccl5蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照病毒rvv-luc+（*p<0.05）。

實(shí)施例3：體外檢測(cè)cik細(xì)胞荷載重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

將通過(guò)上述方法制得的重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+，在體外擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行滴度測(cè)定后儲(chǔ)存于-80℃，可進(jìn)行cik細(xì)胞荷載重組痘病毒對(duì)人大腸癌細(xì)胞和人宮頸癌的殺傷實(shí)驗(yàn)，分別在殺傷24h、48h、72h、96h檢測(cè)其細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示，cik細(xì)胞荷載重組痘病毒對(duì)大腸癌細(xì)胞dld1的增殖有一定的抑制作用（圖5a），其中cik組對(duì)dld1細(xì)胞的抑制作用最弱，rvv-luc+/cik組由于荷載溶瘤病毒后對(duì)dld1細(xì)胞的抑制作用稍微增強(qiáng)，rvv-ccl5-sstr2-luc+/cik組由于抗癌基因的作用對(duì)dld1細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)，rvv-ccl5-sstr2-luc+/cik+oct組在抗癌基因和奧曲肽的聯(lián)合作用下對(duì)dld1細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，在hct116和hela細(xì)胞中可以得到同樣的結(jié)果（圖5b和5c）。由此證明cik細(xì)胞荷載重組痘病毒rvv-ccl5-sstr2-luc+并聯(lián)合奧曲肽對(duì)人大腸癌細(xì)胞和人宮頸癌細(xì)胞的殺傷效果最好。

序列表

<110>昆明理工大學(xué)

<120>含ccl5和sstr2基因的重組痘病毒及其制備方法

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agcgcagagggcagtagcaat21

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgatgtactcccgaaccca19

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aagcaggctggtaccggtccggaattccc29

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ataggccggccaggatcgatccagacatgat31