本發(fā)明涉及林業(yè)森林保護(hù)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)確認(rèn)，伴隨著化學(xué)、生態(tài)及分子生物技術(shù)和研究方法的成熟，昆蟲綜合治理技術(shù)也發(fā)生了質(zhì)的飛躍，這種飛躍體現(xiàn)在綜合利用昆蟲與寄主植物間、種間等的化學(xué)通訊基礎(chǔ)，從而從生態(tài)學(xué)、化學(xué)及生物技術(shù)領(lǐng)域開展昆蟲的防治措施研究，即利用寄主昆蟲、寄主植物、天敵等均可以釋放特定的具有吸引、拒避或不吸引寄主昆蟲對寄主植物選擇的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)來實現(xiàn)預(yù)防昆蟲的目的。

光肩星天牛是一種蛀干類雜食性昆蟲，但寄主植物對光肩星天牛的吸引作用、危害程度具有一定的差異性，在同一地點栽植不同寄主樹種，存在只危害優(yōu)勢寄主樹種，而不危害其他樹種的情況。如糖槭作為優(yōu)勢寄主樹種，當(dāng)與榆樹、白樺、楊樹、柳樹等樹種在同一地點栽植時，對糖槭都危害非常嚴(yán)重，而對其他樹種不危害或危害但不成災(zāi)。研究也證明，糖槭揮發(fā)物對光肩星天牛的引誘作用明顯高于其他樹種揮發(fā)物。

從現(xiàn)有研究技術(shù)來看，國內(nèi)外相關(guān)光肩星天牛引誘劑的內(nèi)容也比較多，主要從單純的光肩星天牛性信息素成分提出性引誘劑的制作方法及現(xiàn)有其它的植物源引誘劑應(yīng)用到光肩星天牛的防治中，以上方法均從單一方面的寄主植物或植食性昆蟲角度提出，然而昆蟲在實際的生存環(huán)境中，昆蟲對寄主植物的定向選擇，是對寄主植物釋放的揮發(fā)物和昆蟲自身釋放的聚集信息素成分混合物的一種綜合反映。同時，作為光肩星天牛寄主樹種揮發(fā)物和聚集信息素成分較多，利用常用單一的嗅覺行為測試，很難篩選出高效的引誘活性成分。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)均從單一方面的寄主植物或植食性昆蟲角度提出，很難篩選出高效的引誘活性成分的缺點，而提出一種篩選高效引誘成分及制備光肩星天牛引誘劑的方法。

一種篩選光肩星天牛引誘成分的方法包括以下步驟：

步驟一：提取及純化光肩星天牛觸角感器的總rna；

步驟二：獲取光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白全長；

步驟三：構(gòu)建光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白的原核表達(dá)載體；

步驟四：光肩星天牛重組氣味結(jié)合蛋白的誘導(dǎo)及純化；

步驟五：光肩星天牛引誘成分的篩選。

一種制備光肩星天牛引誘劑的方法的具體過程為：

將9種糖槭揮發(fā)物與8種光肩星天牛聚集信息素?fù)]發(fā)物以體積比2:1混合后，按照體積比1:2溶于液體石蠟，制成光肩星天牛引誘劑；

所述9種糖槭揮發(fā)物順-3-己烯醇、4-己烯，1-乙酸酯、十六烷酸甲酯、乙酸己酯、3-己烯，1-乙酸酯、4-己烯，1-丁酸酯、4-己烯，1-戊酸酯、2-二丙基-己二酸酯、鄰苯二甲酸二異辛酯的質(zhì)量百分比依次為：2.78：34.70：5.06：2.07：0.38：12.36：6.38：5.74：0.79；

所述8種光肩星天牛聚集信息素?fù)]發(fā)物2-甲基-二十二烷、順式-9-二十三烯、順式-9-二十五烯、順式-7-二十五烯、順式-9-二十七烯、順式-7-二十七烯、4-庚氧基-丁醛、4-庚氧基-正丁醇的體積比為：0.5：1：2：1：0.5：0.5：1:1。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，選擇從綜合趨性行為和分子生物學(xué)手段篩選光肩星天牛優(yōu)勢寄主樹種糖槭的揮發(fā)物和光肩星天牛聚集信息素中高效的引誘活性成分，通過誘捕試驗從而確立引誘劑的最佳配方。對光肩星天牛具有引誘作用最強的配方為糖槭揮發(fā)物混合物：聚集信息素混合物＝2:1。

本發(fā)明的目的在于提供一種利用觸角氣味受體蛋白篩選光肩星天牛優(yōu)勢寄主樹種糖槭揮發(fā)物和聚集信息素的高效引誘成分方法及利用高效的植物源引誘成分及聚集信息素成分制備光肩星天牛引誘劑的方法。其創(chuàng)新點在于利用具有引誘作用的光肩星天牛優(yōu)勢寄主樹種特定比例的糖槭揮發(fā)物及光肩星天牛特定比例的聚集信息素中揮發(fā)物成分按不同比例混合，篩選出具有高效引誘作用的特定比例的高效引誘成分的引誘劑混合物。

附圖說明

圖1為觸角總rna0.01瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2為目標(biāo)蛋白pet-32a(+)-agla-obp1電泳圖；

圖3為目標(biāo)蛋白pet-32a(+)-agla-obp2電泳圖；

圖4為純化后目標(biāo)蛋白pet-32a(+)-agla-obp1電泳圖；

圖5為純化后目標(biāo)蛋白pet-32a(+)-agla-obp2電泳圖；

圖6為不同配比引誘劑配方對光肩星天牛的eag反應(yīng)圖；

圖7為不同配比的引誘劑配方對光肩星天牛嗅覺趨性圖；

圖8為野外誘捕光肩星天牛防治效果。

具體實施方式

具體實施方式一：一種篩選光肩星天牛引誘成分的方法包括以下步驟：

步驟一：提取及純化光肩星天牛觸角感器的總rna；

步驟二：獲取光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白全長；

步驟三：構(gòu)建光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白的原核表達(dá)載體；

步驟四：光肩星天牛重組氣味結(jié)合蛋白的誘導(dǎo)及純化；

步驟五：光肩星天牛引誘成分的篩選及鑒定。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：所述步驟一中光肩星天牛觸角感器的總rna的提取及純化的具體過程為：

利用trizol試劑提取光肩星天牛觸角總rna，利用非酶dna清除-a(dna-be-gone-a)清除總rna中殘留的dna，并利用0.01瓊脂糖凝膠電泳檢測總rna完整性；利用smartivoligonucleotide和cdsⅲ/3′pcrprimer(引物)反轉(zhuǎn)錄，42℃繁育1h，生成cdna第一鏈。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：所述步驟二中獲取光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白全長的具體過程為：

agla-obp1、agla-obp2的引物設(shè)計，

agla-obp1引物序列：

forward：5'-atgaaactttttgtattcgtcc-3'

reverse：5'-ttagggcaagaaataattcgag-3'

agla-obp2引物序列：

forward：5'-atgtcgctcagaatcgttatcg-3'

reverse：5'-ctataccaggaaccagttctcc-3'

光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白agla-obp1和agla-obp2cdna的擴增、克隆和測序。以反轉(zhuǎn)錄酶合成cdna第一鏈為模板，用引物對其進(jìn)行pcr擴增；反應(yīng)體系：pfu0.5μl，pfubuffer+mg²⁺(so4^2-)5.0μl，dntp4.0μl，cdna1.0μl，agla-obp1-forward1.0μl，agla-obp1-reverse1.0μl，ddh2o37.5μl；pcr擴增程序：95℃3min；95℃30s、62.1℃30s、72℃40s，35個循環(huán)；72℃10min；將pcr產(chǎn)物4℃保存，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并割膠純化，克隆于pmd18-tvector載體內(nèi)，鑒定并送生物公司進(jìn)行測序，從而獲得目的基因序列。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一或二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是：所述步驟三中構(gòu)建光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白的原核表達(dá)載體的具體過程為：

光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白agla-obp1和agla-obp2屬于氣味結(jié)合蛋白minusc亞蛋白家族，含有6個保守的cys，形成3對二硫鍵。利用原核表達(dá)載體構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)方法，對pet-32a(+)載體進(jìn)行改造，去除載體自帶的thrombin酶切位點；設(shè)計帶有xhai和xhoi兩個酶切位點的引物，利用橋式pcr的方法將含有thrombin的一段堿基去除，重新克隆出一段不含thrombin的載體序列。然后將從xbai-xhoi目的片段(不含thrombin)搭橋pcr擴增；對擴增的cdna片段使用xbai和xhoi對pet-32a(+)和cdna片段進(jìn)行酶切，后與經(jīng)過相同酶切處理的pet-32a(+)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化宿主菌trans5α后，挑取單菌落、提質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：所述光肩星天牛重組氣味結(jié)合蛋白的誘導(dǎo)及純化的具體過程為：

通過iptg誘導(dǎo)光肩星天牛重組氣味結(jié)合蛋白表達(dá)，并通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對其進(jìn)行純化；

目的蛋白的原核表達(dá)：將構(gòu)建好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆或甘油菌接種至5ml含相應(yīng)抗生素的lb培養(yǎng)液中，37℃，230r/min震蕩培養(yǎng)過夜；取1ml過夜培養(yǎng)物接入50ml含適量相應(yīng)抗生索的lb培養(yǎng)液中，37℃，搖床230r/min培養(yǎng)，3h后取培養(yǎng)物20ml轉(zhuǎn)接至1l含適量相應(yīng)抗生素的lb培養(yǎng)液中，37℃，搖床230r/min培養(yǎng)至od6000.6-0.8；在篩選出的誘導(dǎo)條件16℃，iptg濃度為0.5mm，誘導(dǎo)過夜，誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白；于4℃以6000r/min離心15min收集細(xì)胞，將濕菌體保存于-80℃繼續(xù)后面的純化；

目標(biāo)蛋白pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2的純化：將400ml誘導(dǎo)好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2菌體重懸于裂解液buffera中，buffera由ph7.0，40mmtris，300mmnaci，5％glycerol組成，按照菌液:buffera＝2l：50ml的比例溶解菌體；再加入psmf(100mm),50ml菌體溶液加入50μlpsmf，mgc12(1m)，5oml溶液加入50μlmgci2，和dnase(24mg/ml)，1l菌加入10μldnase混勻后高壓破菌，壓力為1200bar，直至菌液呈水滴狀流出即可(3-4遍)，再于4℃，6000r/min，1h，取上清至平衡好的鎳nta瓊脂糖凝膠柱，并依次用不同咪唑梯度(0mm,10mm,50mm，100mm,250mm,500mm(100％bufferb)的溶液進(jìn)行洗脫，共計七次，收集7管洗脫液后，每管各取10ul進(jìn)行sds-page分析，檢測目的蛋白的純度；

收集含有純pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2重組蛋白的洗脫液后，將其轉(zhuǎn)移至透析袋中，在500ml含濃度遞減尿素(初始濃度7mol/l)的pbs緩沖液(ph7.4)中，在4℃下透析72h，且每隔8h更換一次pbs緩沖液。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：所述步驟五中光肩星天牛引誘劑成分的篩選的具體過程為：

利用競爭性熒光結(jié)合方法獲得光肩星天牛重組氣味蛋白與糖槭揮發(fā)物及光肩星天牛聚集信息素?fù)]發(fā)物的結(jié)合反應(yīng)譜，篩選出高效引誘光肩星天牛的糖槭揮發(fā)物及聚集信息素成分，9種糖槭揮發(fā)物和光肩星天牛聚集信息素8種揮發(fā)物均能和光肩星天牛pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至五之一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至六之一不同的是：所述9種糖槭揮發(fā)物具體為：

順-3-己烯醇(3-hexen-1-o1,(z))、4-己烯，1-乙酸酯(4-hexen-1-o1,acetate)、十六烷酸甲酯(methylpalmitate)、乙酸己酯(aceticacid,hexylester)、3-己烯，1-乙酸酯((z)-3-hexen-1-olacetate)、4-己烯，1-丁酸酯(butanoicacid,4-hexen-1-ylester)、4-己烯，1-戊酸酯(pentanoicacid,4-hexen-1-ylester)、2-二丙基-己二酸酯(hexanedioicacid,bis(2-methylpropyl)ester)、鄰苯二甲酸二異辛酯(diisooctylphthalate)。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至六之一相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一至七之一不同的是：所述8種揮發(fā)物發(fā)物具體為：

2-甲基-二十二烷(2-methyldocosane)、順式-9-二十三烯((z)-9-tricosene)、順式-9-二十五烯((z)-9-pentacosene)、順式-7-二十五烯((z)-7-pentacosene)、順式-9-二十七烯((z)-9-heptacosene)、順式-7-二十七烯((z)-7-heptacosene)、4-庚氧基-丁醛(4-(heptyloxy)-butana)、4-庚氧基-正丁醇(4-(heptyloxy)-butan-1-ol)。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至七之一相同。

具體實施方式九：一種制備光肩星天牛引誘劑的方法的具體過程為：

選擇將相對熒光強度降低至50％以下，且結(jié)合常數(shù)在13-45umol/l的糖槭揮發(fā)物及光肩星天牛聚集信息素成分作為引誘劑的成分；通過不同比例的糖槭揮發(fā)物成分與聚集信息素成分的混合，通過gc-eag、室內(nèi)嗅覺趨性測定及野外誘捕試驗，確定最佳引誘劑配方。

按照篩選出的9種糖槭揮發(fā)物含量比例設(shè)定糖槭揮發(fā)物混合物、8種光肩星天牛聚集信息素?fù)]發(fā)物含量比例設(shè)定聚集信息素混合物；以糖槭揮發(fā)物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合后1:2溶于液體石蠟，形成不同比例配方，以液體石蠟為作為對照(ck)，利用gc-eag篩選出對光肩星天牛具有引誘作用最強的配方糖槭揮發(fā)物混合物：聚集信息素混合物＝2:1。室內(nèi)趨性測定：利用y型嗅覺儀以液體石蠟作為對照(ck)，測定引誘劑糖槭揮發(fā)物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合后1:2溶于液體石蠟對光肩星天牛的嗅覺趨性，結(jié)果顯示，對光肩星天牛具有引誘作用最強的配方為糖槭揮發(fā)物混合物：聚集信息素混合物＝2:1。

采用以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果

實施例一：

篩選(高效)光肩星天牛引誘劑成分及制備光肩星天牛引誘劑的方法包括以下步驟：

1)光肩星天牛觸角感器總rna的提取及純化：

①供試光肩星天牛成蟲采于哈爾濱市糖槭綠化樹，與7月中旬至8月期間，現(xiàn)采現(xiàn)用，利用trizol試劑提取光肩星天牛觸角總rna。

②利用非酶dna清除-a(dna-be-gone-a)清除總rna中殘留的dna，并利用0.01瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，如圖1所示。

③利用smartivoligonucleotide和cdsⅲ/3′pcrprimer反轉(zhuǎn)錄，42℃繁育1h，生成cdna第一鏈。

2)利用rt-pcr獲得光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白的具體步驟。

①光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白agla-obp1、agla-obp2的引物設(shè)計。根據(jù)genbank中光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白agla-obp1、agla-obp2(2010，王偉)的基因序列，利用軟件oligo7.0進(jìn)行引物設(shè)計。

②agla-obp1引物序列:

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③agla-obp2引物序列：

forward：5'-atgtcgctcagaatcgttatcg-3'.

reverse：5'-ctataccaggaaccagttctcc-3'.

④光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白agla-obp1和agla-obp2cdna的擴增、克隆和測序。以反轉(zhuǎn)錄酶合成cdna第一鏈為模板，用引物對其進(jìn)行pcr擴增。反應(yīng)體系：pfu0.5μl,pfubuffer+mg²⁺(so4^2-)5.0μl,dntp4.0μl,cdna1.0μl,agla-obp1-forward1.0μl,agla-obp1-reverse1.0μl,ddh2o37.5μl。pcr擴增程序：95℃3min；95℃30s、62.1℃30s、72℃40s，35個循環(huán)；72℃10min。

⑤將pcr產(chǎn)物4℃保存，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并割膠純化，克隆于pmd18-tvector載體內(nèi)，鑒定并送生物公司進(jìn)行測序，從而獲得目的基因序列，如圖1所示。

3)光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建。

①二硫鍵的異源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)：光肩星天牛氣味結(jié)合蛋白agla-obp1和agla-obp2屬于氣味結(jié)合蛋白minusc亞蛋白家族，含有6個保守的cys，形成3對二硫鍵。利用原核表達(dá)載體構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)方法，對pet-32a(+)載體進(jìn)行改造，去除載體自帶的thrombin酶切位點。

②設(shè)計帶有xhai和xhoi兩個酶切位點的引物，利用橋式pcr的方法將含有thrombin的一段堿基去除，重新克隆出一段不含thrombin的載體序列。然后將從xbai-xhoi目的片段(不含thrombin)搭橋pcr擴增；對擴增的cdna片段使用xbai和xhoi對pet-32a(+)和cdna片段進(jìn)行酶切，后與經(jīng)過相同酶切處理的pet-32a(+)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化宿主菌trans5α后，挑取單菌落、提質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。

4)通過iptg誘導(dǎo)光肩星天牛重組氣味結(jié)合蛋白表達(dá)，并通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對其進(jìn)行純化。

①目的蛋白的原核表達(dá)：將構(gòu)建好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆或甘油菌接種至5ml含相應(yīng)抗生素的lb培養(yǎng)液中，37℃,230r/min震蕩培養(yǎng)過夜。取1ml過夜培養(yǎng)物接入50ml含適量相應(yīng)抗生索的lb培養(yǎng)液中，37℃,搖床230r/min培養(yǎng)，3h后取培養(yǎng)物20ml轉(zhuǎn)接至1l含適量相應(yīng)抗生素的lb培養(yǎng)液中,37℃，搖床230r/min培養(yǎng)至od6000.6-0.8。在篩選出的最佳誘導(dǎo)條件16℃，iptg濃度為0.5mm，誘導(dǎo)過夜，誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白，如圖2和圖3所示。于4℃以6000r/min離心15min收集細(xì)胞，將濕菌體保存于-80℃繼續(xù)后面的純化。

②目標(biāo)蛋白pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2的純化：將400ml誘導(dǎo)好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2菌體重懸于裂解液buffera中，buffera由ph7.0,40mmtris，300mmnaci,5％glycerol組成，按照菌液:buffera＝2l：50ml的比例溶解菌體。再加入psmf(100mm),50ml菌體溶液加入50μlpsmf,mgc12(1m),5oml溶液加入50μlmgci2,和dnase(24mg/ml),1l菌加入10μldnase混勻后高壓破菌，壓力為1200bar，直至菌液呈水滴狀流出即可(3-4遍)，再于4℃,16000r/min,1h,取上清至平衡好的鎳nta瓊脂糖凝膠柱，并依次用不同咪唑梯度的溶液進(jìn)行洗脫，共計七次，收集7管洗脫液后，每管各取10ul進(jìn)行sds-page分析，檢測目的蛋白的純度，其中1-7為收集管位置，如圖4和圖5所示。

③收集含有純pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2重組蛋白的洗脫液后，將其轉(zhuǎn)移至透析袋中，在500ml含濃度低減尿素(初始濃度7mol/l)的pbs緩沖液(ph7.4)中，在4℃下透析72h，且每隔8h更換一次pbs緩沖液。然后利用bradford法對透析好的融合蛋白測定濃度，轉(zhuǎn)移至1.5mleppendorf微量離心管內(nèi)，保存于-80℃冰箱備用。

5)利用競爭性熒光結(jié)合方法獲得光肩星天牛重組氣味蛋白與糖槭揮發(fā)物及光肩星天牛聚集信息素?fù)]發(fā)物的結(jié)合反應(yīng)譜，篩選出高效引誘光肩星天牛的糖槭揮發(fā)物及聚集信息素成分。

①將熒光配基1-npn溶于甲醇中，配制成1mmol/l的溶液，4℃條件下避光保存，取1.5μmol/lpet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2置于1cm四通的熒光比色皿中，向比色皿中逐次加入1mmol/l的1-npn溶液進(jìn)行熒光掃描，每次加入后反應(yīng)2min，在282波長下激發(fā)，記錄熒光發(fā)射光譜，及最大發(fā)射波長328nm處的熒光強度根據(jù)scatchard方程(1)線性化光譜數(shù)據(jù)：

其中dt和d分別表示總的和體系中游離的1-npn濃度，pt為pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2重組蛋白的濃度，k為1-npn與pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2的結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點數(shù)?？傻玫?-npn與agla-obp1/agla-obp2的解離常數(shù)。

其中ic50為競爭配基能替換50％的1-npn時的濃度，1-npn為未結(jié)合1-npn的濃度，k1-npn為pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2與1-npn的解離常數(shù)。

②選取不同糖槭葉片氣味揮發(fā)物及光肩星天牛聚集信息素?fù)]發(fā)物進(jìn)行競爭性熒光結(jié)合試驗，對利用gcsm鑒定出的26種糖槭揮發(fā)物，篩選出9種糖槭揮發(fā)物和光肩星天牛聚集信息素8種揮發(fā)物均能和光肩星天牛pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)，具體結(jié)果如1、表2。

表1糖槭揮發(fā)物配基與1-npn和重組pet-32a(+)-agla-obp1、pet-32a(+)-agla-obp2(a1/a2)蛋白的競爭結(jié)合

表2光肩星天牛聚集信息素配基與1-npn和重組pet-32a(+)-agla-obp1、pet-32a(+)-agla-obp2(a1/a2)蛋白的競爭結(jié)合

6)光肩星天牛引誘劑配方的提出：

①gc-eag篩選最佳配方：按照上述篩選出的高效的9種糖槭揮發(fā)物含量比例設(shè)定糖槭揮發(fā)物混合物、8種光肩星天牛聚集信息素?fù)]發(fā)物含量比例設(shè)定聚集信息素混合物；而后以糖槭揮發(fā)物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合后1:2溶于液體石蠟，形成不同比例配方，以液體石蠟為作為對照(ck)，利用gc-eag篩選出對光肩星天牛具有引誘作用最強的配方糖槭揮發(fā)物混合物：聚集信息素混合物＝2:1，如圖6。

②室內(nèi)趨性測定：利用y型嗅覺儀以液體石蠟作為對照(ck)，測定引誘劑糖槭揮發(fā)物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合后1:2溶于液體石蠟對光肩星天牛的嗅覺趨性，結(jié)果顯示，對光肩星天牛具有引誘作用最強的配方為糖槭揮發(fā)物混合物：聚集信息素混合物＝2:1，如圖7所示。

7)野外誘捕試驗：利用上述所得到的的引誘劑配方，采用實用新型專利cn201620147068.7中誘捕器及誘捕方法，于2016年7月下旬于9月上旬進(jìn)行野外誘捕光肩星天牛，分別調(diào)查對照區(qū)(ck)和誘捕區(qū)(yb)30株糖槭樹上光肩星天牛成蟲數(shù)量，對照區(qū)共計11頭，而誘捕區(qū)共計189頭，平均單株蟲口數(shù)降低了5.93頭，說明本發(fā)明所獲得的引誘劑配方對光肩星天牛的防治效果明顯，如圖8所示。與現(xiàn)有單純的以性信息素及植物揮發(fā)物作為光肩星天牛引誘劑比較，具有明顯的引誘效果。

本發(fā)明還可有其它多種實施例，在不背離本發(fā)明精神及其實質(zhì)的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)可根據(jù)本發(fā)明作出各種相應(yīng)的改變和變形，但這些相應(yīng)的改變和變形都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。