本發(fā)明屬于植物抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種葉柄切面涂菌鑒定草莓炭疽病抗性的方法，適用于草莓抗炭疽病種質(zhì)資源的篩選和抗性評價。

背景技術(shù)：

草莓(fragarinananassa)屬薔薇科(rosaceae)草莓屬(fragaria)多年生草本植物，草莓漿果色澤鮮艷，是深受消費(fèi)者喜愛的水果，也是重要的食品工業(yè)原料。進(jìn)入21世紀(jì)后,草莓作為一種生產(chǎn)效益較高的經(jīng)濟(jì)作物,在市場的需求及效益的驅(qū)動下,我國草莓生產(chǎn)發(fā)展十分迅速，草莓產(chǎn)業(yè)已成為城郊農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整后的新興產(chǎn)業(yè)。

炭疽病是草莓生產(chǎn)上的一種主要病害，可造成草莓育苗困難、大量死苗，嚴(yán)重影響草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前生產(chǎn)上抗炭疽病的草莓品種一般品質(zhì)中下，而品質(zhì)優(yōu)良的品種對炭疽病的抗性較差。培育品質(zhì)優(yōu)良、兼顧抗炭疽病能力較強(qiáng)的品種是草莓育種的方向之一。建立一種簡單易行的草莓炭疽病抗性的評價方法，對草莓抗性育種很重要。

關(guān)于炭疽病對草莓的影響，國內(nèi)外均有相關(guān)學(xué)者進(jìn)行了一些研究。中國于1991年由葉正文首次發(fā)現(xiàn)草莓炭疽病。e.barclaypoling2008年研究了草莓炭疽病的病原學(xué)、流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)理及對草莓育苗的影響。韓永超等人2016年詳細(xì)研究了湖北省草莓炭疽菌的種類特征和分布特點(diǎn)。王豐2008年開展了草莓品種對炭疽病抗性的鑒定技術(shù)研究，表明點(diǎn)滴接種、菌片接種、噴霧接種3種方法均能使供試草莓植株感染炭疽病,其中以噴霧接種法發(fā)病率和病情指數(shù)最高。中國發(fā)明專利(cn103667427b)公開了一種用于鑒定草莓種質(zhì)資源炭疽病抗性的引物序列及其鑒定方法，建立了通過設(shè)計引物序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增來鑒定草莓炭疽病抗性的分子鑒定技術(shù)。中國發(fā)明專利(cn103060422b)公開了一種室內(nèi)鑒定草莓是否抗炭疽病的方法，通過室內(nèi)離體草莓匍匐莖浸入法來鑒定草莓炭疽病抗性。但關(guān)于葉柄切面涂菌鑒定草莓炭疽病抗性的方法尚未見報道。點(diǎn)滴接種和菌片接種的接種對象是葉片，點(diǎn)滴接種菌懸液滴易風(fēng)干、發(fā)病不穩(wěn)定；菌片接種中，菌片上殘存培養(yǎng)基容易腐生其它病菌影響試驗結(jié)果。噴霧接種，其發(fā)病主要是由炭疽菌孢子通過葉片氣孔侵入，而有的草莓品種葉片發(fā)病顯著但病菌并不向根莖部傳播，植株死苗率也較低，這對噴霧接種法鑒定的準(zhǔn)確性有影響。離體匍匐莖浸入法，由于脫離了活體植株，草莓品種因炭疽菌侵染逆境被誘發(fā)的自身防御系統(tǒng)——主動抗性無法體現(xiàn)，影響了鑒定準(zhǔn)確性。引物擴(kuò)增分子鑒定法，需要特定的分子生物學(xué)儀器設(shè)備，需要操作人員掌握一定的分子生物學(xué)技術(shù)，方法操作有一定難度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供了一種葉柄切面涂菌鑒定草莓炭疽病抗性的方法，技術(shù)鑒定準(zhǔn)確性穩(wěn)定性好，鑒定成本低，方法易行，操作簡單，易掌握，炭疽菌沿葉柄切面?zhèn)谇秩氡韧ㄟ^葉片氣孔侵入到達(dá)植株根莖部要容易和快速，不同草莓品種對從葉柄切面?zhèn)谇秩氲奶烤揖姆磻?yīng)更靈敏，葉柄切面涂菌法對不同草莓品種炭疽病抗性的分級更準(zhǔn)確。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種葉柄切面涂菌鑒定草莓炭疽病抗性的方法，其步驟是:

a、接種植株準(zhǔn)備：將5-7葉的待鑒定草莓植株10-20株分缽種植，在溫度20-30℃、1000-1500lx、15－17h/d的光照條件下培養(yǎng)備用。

b、炭疽菌孢子液的制備：將培養(yǎng)的炭疽菌孢子用無菌水懸浮，濾去菌絲后制成0.5-2.0×10⁶個/ml的孢子液。

c、葉柄切面涂菌：在草莓植株倒3葉或倒4葉葉柄上部剪去葉片，用鑷子夾住吸有炭疽菌孢子液的小棉球在葉柄切面涂抹，保鮮膜包住葉柄切面固定2天；薄膜覆蓋，80％以上的濕度保濕2-3天，利于炭疽菌孢子從葉柄侵入發(fā)病。

d、草莓炭疽病抗性評價：7-10天后按植株葉柄發(fā)病程度和植株死亡率評價草莓種質(zhì)資源的炭疽病抗性。

所述的葉柄切面應(yīng)保持平整，切面凹凸差異不超過0.5mm。

本發(fā)明的基于葉柄是衡量草莓炭疽病抗性的主要組織器官是創(chuàng)造性思想，利用本方法可將草莓品種紅顏、豐香、晶玉、甜查理對炭疽病的抗性分別劃分為：s、ms、mr、r，與生產(chǎn)實際高度吻合。本發(fā)明在室內(nèi)室外均可進(jìn)行鑒定，所需植株少，方法簡單易行，對草莓抗炭疽病種質(zhì)資源的篩選和抗性評價具有重要意義。

從田間生產(chǎn)觀察到，有些抗炭疽病能力較強(qiáng)的草莓品種，如甜查理，葉片上可以感染諸多炭疽病病斑，但葉柄上病斑較少，植株死苗率也很低；而抗炭疽病能力較弱的草莓品種，如紅顏，無論葉片上是否有病斑，只要葉柄上出現(xiàn)較大的病斑，植株一般都會發(fā)蔫直至逐步死亡。由此可以得出，草莓品種資源的炭疽病抗性水平與其葉柄對炭疽病的抗性水平密切相關(guān)。另外，傷口是炭疽病侵染的重要途徑之一?；诖耍ㄟ^實驗研究，本發(fā)明提出葉柄切面涂菌鑒定草莓炭疽病抗性的方法。如表1所示。

表1本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的比較表

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

本發(fā)明在室內(nèi)室外均可進(jìn)行鑒定，所需植株少，10株即可,鑒定成本較低。不同草莓品種對從葉柄切面?zhèn)谇秩氲奶烤揖磻?yīng)靈敏，一般7天即有癥狀；炭疽菌沿葉柄切面?zhèn)谇秩氡韧ㄟ^葉片氣孔侵入到達(dá)植株根莖部要容易和快速，葉柄切面涂菌法對不同草莓品種炭疽病抗性的分級準(zhǔn)確，紅顏、甜查理、豐香3個品種3次抗性重復(fù)試驗均分別歸為s、r、ms類型，技術(shù)鑒定準(zhǔn)確性穩(wěn)定性好。操作流程上，在制備好孢子液后，通過剪去葉片在葉柄上形成傷口，用吸有炭疽菌孢子液的小棉球在葉柄切面涂抹即可，方法操作簡單、易掌握，鑒定成本較低，對草莓抗炭疽病種質(zhì)資源的篩選和抗性評價具有重要意義。

具體實施方式

實施例1:

一種葉柄切面涂菌鑒定草莓炭疽病抗性的方法，其步驟是:

a、接種植株準(zhǔn)備：將5或6或7葉的紅顏、晶瑤、晶玉、章姬、甜查理、豐香、三公主、四公主、寧豐、越麗草莓植株10或15或20株分缽種植，在20或25或30℃、1000-1500lx、16h/d的光照條件下培養(yǎng)，獲得生長一致的待鑒定草莓植株，備用。

b、炭疽菌孢子液的制備：將培養(yǎng)的炭疽菌孢子用無菌水懸浮，濾去菌絲后制成0.5×10⁶或1.0×10⁶或2.0×10⁶個/ml的孢子液。

c、葉柄切面涂菌：在草莓植株倒3葉或倒4葉葉柄上部剪去葉片，用鑷子夾住吸有炭疽菌孢子液的小棉球在葉柄切面涂抹，保鮮膜包住葉柄切面固定2天；薄膜覆蓋，80％以上的濕度保濕2或3天。讓炭疽菌在合適的生長擴(kuò)繁條件下通過葉柄傷口侵入并向植株根莖部傳播，及時觀察不同草莓品種對接種炭疽菌的應(yīng)答反應(yīng)。

d、草莓炭疽病抗性評價：7或8或9或10天后按植株葉柄發(fā)病程度和植株死亡率評價草莓種質(zhì)資源的炭疽病抗性。

通過上述技術(shù)措施，使本發(fā)明鑒定的成本較低，方法操作簡單，易掌握，方法準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性更好，可以在短時間內(nèi)快速的鑒定多種草莓種質(zhì)資源的炭疽病抗性，適用于草莓抗炭疽病種質(zhì)資源的篩選和抗性評價。

草莓炭疽病發(fā)病率和病情指數(shù)的技術(shù)方法如下：

發(fā)病率(dr)(％)＝發(fā)病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)×100％；

病情指數(shù)(di)＝[(各級發(fā)病株數(shù)×病級數(shù))/(最高發(fā)病級數(shù)×調(diào)查株數(shù))]×100

葉柄病情分級標(biāo)準(zhǔn)：

0級：無??；

1級：病部出現(xiàn)淺紅色和褪色暈圈，或紅褐色斑點(diǎn)，病斑長度＜3.0mm；

2級：病斑擴(kuò)大呈梭形，黑褐色凹陷，病斑長度在3.0～10.0mm；

3級：典型的紡錘形病斑，病斑的長度在11.0～20.0mm，環(huán)繞葉柄或匍匐莖；

4級：葉柄變黑，干縮，病斑長度＞20.0mm，或整個葉柄干枯變黑壞死；

5級：根莖全部壞死，植株死亡。

品種群體抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn)di＝0:免疫(i)；0<di≤10:高抗(hr)；10<di≤20:抗(r)；20<di≤40:中抗(mr)；40<di≤60:中感(ms)；60<di≤80:感(s)；80<di≤100:高感(hs)。

通過上述實施例獲得如下結(jié)果：紅顏、晶瑤、晶玉、章姬、甜查理、豐香、三公主、四公主、寧豐、越麗10個草莓品種的炭疽病發(fā)病率依次為：100.0％、90.0％、70.0％、95.0％、35.0％、83.3％、70.0％、72.2％、68.4％、90.9％；紅顏、晶瑤、晶玉、章姬、甜查理、豐香、三公主、四公主、寧豐、越麗10個草莓品種的炭疽病病情指數(shù)依次為：78.4、69.5、31.6、77.3、16.2、52.8、35.2、33.9、36.7、72.5；紅顏、晶瑤、晶玉、章姬、甜查理、豐香、三公主、四公主、寧豐、越麗10個草莓品種的炭疽病抗性評價結(jié)果分別為：s、s、mr、s、r、ms、mr、mr、mr、s。本方法的炭疽病抗性鑒定結(jié)果表明，紅顏、晶瑤為感炭疽病品種，甜查理為抗炭疽病品種，與生產(chǎn)實際基本吻合。不同草莓品種的抗性評價匯總結(jié)果如表2所示。

表2不同草莓品種抗性評價結(jié)果

上例所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而非限制，凡依本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思所作的改進(jìn)或等效替換，均屬本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)的范圍。