本發(fā)明涉及一種利于蘋果愈傷的蘋果mdarf5基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：鋁離子對(duì)植物具有毒害作用，是植物生長(zhǎng)的主要限制因子。鋁脅迫下植物通過(guò)根分泌有機(jī)酸螯合根際活性鋁是其一種抗鋁離子脅迫的主要方式。近幾十年來(lái)，我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)中由于過(guò)量施氮，導(dǎo)致土壤酸化，在酸性土壤中,鋁離子被活化，易被植物吸收利用，從而抑制了果樹的生長(zhǎng)發(fā)育，降低了園藝產(chǎn)品食用的安全性。因此，亟待研究植物提高鋁離子脅迫抗性的機(jī)理，對(duì)于果樹的抗性和品質(zhì)起到關(guān)鍵作用。最近研究表明，h+-atp酶活性提高有助于有機(jī)酸的外泌，進(jìn)而抑制鋁離子的吸收，ahas屬于一類h+-atp酶，它們?cè)谟袡C(jī)酸分泌和鋁離子抗性方面起到重要作用，前期研究也發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素信號(hào)在調(diào)控有機(jī)酸外泌上也發(fā)揮重要作用，但是其機(jī)理不清楚。我們?cè)谘芯窟^(guò)程中克隆了蘋果mdarf5基因，研究表明了mdmiel1響應(yīng)多種激素信號(hào)和脅迫響應(yīng)，過(guò)量表達(dá)mdmiel1提高了轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷和轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽和抗旱能力。我們的研究發(fā)現(xiàn)，蘋果mdarf5能夠促進(jìn)aha基因表達(dá)，提高h(yuǎn)+-atpase活性，進(jìn)而增加了根系中有機(jī)酸的外泌，最終提高蘋果愈傷對(duì)鋁離子脅迫的抗性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明首次通過(guò)植物基因工程技術(shù)改善植物抗鹽、抗旱性和其他有益生產(chǎn)性狀，從蘋果組培苗中分離克隆出的抗逆相關(guān)基因完整編碼區(qū)段的dna片段，并驗(yàn)證了該基因的功能，利用其功能最終發(fā)現(xiàn)采用超量表達(dá)之后轉(zhuǎn)基因植株抗鹽和抗干旱能力明顯提高。本發(fā)明的目的之一，是提供一種利于蘋果愈傷的蘋果mdarf5基因。本發(fā)明的申請(qǐng)人從蘋果中分離克隆出的抗鹽相關(guān)基因完整編碼區(qū)段的dna片段，并命名為mdarf5。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種利于蘋果愈傷的蘋果mdarf5基因，所述mdarf5基因的核苷酸序列如seq.id.no.1所示。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。進(jìn)一步，所述mdarf5基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列如seq.id.no.2所示。本發(fā)明的目的之二，是提供上述利于蘋果愈傷的蘋果mdarf5基因的操作方法。本操作方法的技術(shù)流程成熟，適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種利于蘋果愈傷的蘋果mdarf5基因的操作方法，包括以下步驟：(1)提取蘋果組培葉片中的rna及反轉(zhuǎn)錄；(2)cdna全長(zhǎng)序列的獲得：根據(jù)ncbi查到的蘋果愈傷中miel1基因保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)兼并引物mdarf5-f、mdarf5-r，然后以反轉(zhuǎn)錄合成的蘋果基因組cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到cdna全長(zhǎng)序列；其中，mdarf5-f序列如seq.id.no.3所示，mdarf5-r序列如seq.id.no.4所示；(3)pcr產(chǎn)物進(jìn)行回收、載體連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，即得到所述蘋果mdarf5基因。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。進(jìn)一步，步驟(2)中，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：pcr反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；循環(huán)參數(shù)為94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸90s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10min。本發(fā)明的目的之三，是提供上述利于蘋果愈傷的蘋果mdarf5基因在轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷中的應(yīng)用。本發(fā)明的申請(qǐng)人利用強(qiáng)啟動(dòng)子(花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將mdarf5基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入蘋果愈傷中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)驗(yàn)證明，超量表達(dá)mdarf5基因的轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷在鹽和干旱脅迫下，死亡率相比于野生型明顯降低，說(shuō)明mdarf5基因在植株抗逆中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種如上所述的利于蘋果愈傷的蘋果mdarf5基因在轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：1.本發(fā)明首次通過(guò)植物基因工程技術(shù)改善植物抗鹽、抗旱性和其它有益生產(chǎn)性狀，從蘋果組培苗中分離克隆出的抗逆相關(guān)基因完整編碼區(qū)段的dna片段，并驗(yàn)證了該基因的功能，利用其功能最終發(fā)現(xiàn)采用超量表達(dá)之后轉(zhuǎn)基因植株抗鹽和抗干旱能力明顯提高。2.本發(fā)明的利于蘋果愈傷的蘋果mdarf5基因的操作方法的技術(shù)流程成熟，適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。3.本發(fā)明的利于蘋果愈傷的蘋果mdarf5基因可以應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷中，mdarf5基因在植株抗逆中發(fā)揮重要作用。附圖說(shuō)明圖1為mdarf5轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷對(duì)鋁離子脅迫抗性表型觀察圖。其中，a和b為表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mdarf5對(duì)外界鋁離子脅迫的表達(dá)響應(yīng)；c為生長(zhǎng)10天的野生型蘋果愈傷(wt)和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷(l1，l2)生長(zhǎng)曲線觀察；d為轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷與野生型蘋果愈傷相比，在al3+脅迫下生長(zhǎng)速率更快。圖2為蘋果愈傷轉(zhuǎn)mdarf5基因提高h(yuǎn)+-atp酶活性圖。其中，a為mdarf5轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷酸化實(shí)驗(yàn)；b為蘋果愈傷轉(zhuǎn)mdarf5促進(jìn)蘋果h+-atp酶活性。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1：蘋果mdarf5基因的克隆一、嘎啦組培葉片rna提取及反轉(zhuǎn)錄1、利用ctab法提取總rna：(1)取1.5g經(jīng)200mmnacl鹽處理24小時(shí)的嘎啦蘋果組培苗，放入預(yù)冷的研缽，加液氮磨碎，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50ml離心管中；(2)迅速加入10ml預(yù)熱到65℃的提取緩沖液(其中pvp和巰基乙醇現(xiàn)用現(xiàn)加)，輕輕混勻，65℃水浴中0.5小時(shí)，其中提取緩沖液組成見表1；表1提取緩沖液ctab20％(w/v)tris-hcl0.1mmol/ledta25mmol/lnacl2mmol/l巰基乙醇2％(w/v)pvp2％(w/v)rnasefreeddh2o定容到100ml(3)加入與上步離心管液等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振蕩0.5小時(shí)，4℃、12000rpm離心20分鐘；將上清液轉(zhuǎn)移到新的50ml離心管中；(4)加入1/3上清液體積的10mol/l預(yù)冷licl，-20℃放置3小時(shí)，12000rpm離心30分鐘，棄上清液；(5)加入500μlsste緩沖液充分懸浮沉淀后，平均分裝到2支1.5ml離心管中，其中sste緩沖液組成見表2；表2sste緩沖液nacl1mmol/lsds0.5％(w/v)edta10mmol/lrnasefreeddh2o定容到10ml(6)分別加入與懸浮液等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振蕩10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管；(7)分別加入與上清液等體積的氯仿/異戊醇(24:1)混合物，冰浴振蕩10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管；(8)加入2.5倍上清液體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，-20℃放置1-2小時(shí)；(9)于4℃、12000rpm離心20分鐘，70％乙醇洗2次；(10)于4℃、14000rpm離心10分鐘，超凈臺(tái)上風(fēng)干沉淀；加入20μldepc水溶解rna；(11)置-80℃儲(chǔ)藏,備用,或立即進(jìn)行以下反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。2、反轉(zhuǎn)錄cdna第一鏈的合成(1)在0.2ml的微量離心管中配制表3混合液(其中表3中rna為步驟1提取獲得的；如果用的是-80℃儲(chǔ)藏rna，必須讓其在冰上緩慢融解)：表3混合液rna2μgoligo(dt)primer(50μm)1μldntpsmixture(10mmeach)1μlrnasefreeddh2o定容到10μl(2)用槍頭輕輕混勻，將微量離心管放在pcr儀上(65℃,5分鐘)進(jìn)行變性、退火反應(yīng)，然后冰上急冷；(3)在上述微量離心管中繼續(xù)配制表4反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液；表4反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液上述變性、退火后反應(yīng)液10μl5×primerscripttmbuffer4μlrnaseinhibitor(40u/μl)0.5μlprimerscripttmrtase(200u/μl)1μlrnasefreeddh2o4.5μl共計(jì)20μl(4)在pcr儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：30℃，10分鐘；42℃，60分鐘；70℃，15分鐘；4℃保存。合成的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna，用于進(jìn)行后面的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。3、cdna末端加尾利用tdt末端轉(zhuǎn)移酶，步驟2中反轉(zhuǎn)錄合成的cdna3’末端加上poly(c)尾巴，以此為模板進(jìn)行5’race擴(kuò)增。在1.5ml離心管中依次加入表5所示的pcr反應(yīng)試劑，終體積為50μl。表5pcr反應(yīng)試劑純化cdna產(chǎn)物25μl5×tdtbuffer10μl0.1％bsa5μl10mmol/ldctp(終濃度0.5mmol/l)2.5μltdt15uddh2o定容到50μl(1)37℃反應(yīng)30分鐘；(2)加入50μl(等體積)的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，充分混勻；離心，取上層(水層)至另一新的1.5ml離心管中；(3)加入50μl(等體積)的氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻；離心，取上層(水層)至另一新的1.5ml離心管中；(4)加入5μl(1/10體積)3mnaac(ph5.2)，再加入125μl(2.5倍體積)預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20℃放置30-60分鐘；(5)4℃、12000rpm離心15分鐘，70％乙醇洗2次；(6)4℃、12000rpm離心10分鐘，超凈臺(tái)上風(fēng)干沉淀；用20μl無(wú)菌水溶解dna，4℃保存，獲得的加尾cdna作為模板用于后面的5’race擴(kuò)增。二、cdna全長(zhǎng)序列的獲得根據(jù)ncbi查到的蘋果愈傷中miel1基因保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)兼并引物(mdarf5-f,mdarf5-r)，以反轉(zhuǎn)錄合成的cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增。mdarf5-f：5’-atgatgggttcggtgga-3’，其序列如seq.id.no.3所示；mdarf5-r：5’-ttagggacggccaccctc-3’，其序列如seq.id.no.4所示；其中，pcr擴(kuò)增體系見表6。表6pcr擴(kuò)增體系10×pcr含mg2+的buffer2.5μl2.5mmol/l的dntp2.0μl10μmol/l引物mdarf5-f1.0μl10μmol/l引物mdarf5-r1.0μlcdna或基因組dna模板1.0μltaq酶0.2μlddh2o定容至25.0μlpcr反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；循環(huán)參數(shù)為94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸90s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10min。pcr反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)是否有適當(dāng)大小的條帶，并將pcr產(chǎn)物回收(回收根據(jù)takara公司“agarosegeldnapurificationkit”操作)、載體連接(取3.0μlpcr回收產(chǎn)物與pmd18-t載體連接，操作步驟按pmd18-tvector說(shuō)明書進(jìn)行)、轉(zhuǎn)化(連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α，在表面涂有iptg/x-gal的lb平板培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12-20小時(shí)；挑取白色菌落，在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜)、序列測(cè)定(將搖好的菌取1ml放到1.5ml離心管中，密封，在北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定后，得到mdarf5基因)，其核苷酸序列如seq.id.no.1所示；其氨基酸序列如seq.id.no.2所示。實(shí)施例2：轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷的獲得1)挑取農(nóng)桿菌單克隆菌落接種于10mlyep液體培養(yǎng)基(含50mg/l潮霉素)中，28℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)至od600為06-0.8(約48h)。取其中1ml菌液加入20mlyep液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃、200rpm，振蕩培養(yǎng)至od600為06-0.8(約5h)。離心收集菌體，ddh2o稀釋，配制侵染液。2)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的野生型蘋果愈傷組織，將愈傷組織置于侵染液中靜置孵育30min。吸收紙吸干后，預(yù)培養(yǎng)1天。3)將預(yù)培養(yǎng)1天后的蘋果愈傷平鋪到選擇性培養(yǎng)基(100mg·l-1hyg)上培養(yǎng)1-2月。4)通過(guò)基因檢測(cè)篩選轉(zhuǎn)基因愈傷組織。實(shí)施例3：轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷的al離子脅迫抗性觀察使用生長(zhǎng)3周左右、長(zhǎng)勢(shì)良好的蘋果組培幼苗，用不同濃度的al3+處理，表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證mdarf5對(duì)外界鋁離子脅迫的表達(dá)響應(yīng)，表達(dá)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，al3+明顯促進(jìn)mdarf5基因表達(dá)。同時(shí)將mdarf5遺傳轉(zhuǎn)化蘋果愈傷組織，在al3+脅迫下處理蘋果愈傷，觀察生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷與野生型蘋果愈傷相比，在al3+脅迫下生長(zhǎng)速率更快，如圖1所示。3、mdarf5轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷提高將繼代培養(yǎng)兩周左右、長(zhǎng)勢(shì)良好的蘋果mdarf5和野生型愈傷，在含有ph染色試劑的繼代培養(yǎng)基上生長(zhǎng)48h，觀察培養(yǎng)基h+外泌現(xiàn)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)mdarf5明顯促進(jìn)了h+外泌，為進(jìn)一步證明這一結(jié)果，同時(shí)檢測(cè)了mdarf5轉(zhuǎn)基因愈傷和野生型愈傷的，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，過(guò)表達(dá)mdarf5促進(jìn)了h+-atp酶活性，如圖2所示。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表〈110〉山東農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉一種利于蘋果愈傷的蘋果mdarf5基因及其應(yīng)用〈160〉2〈170〉patentinversion3.5〈210〉1〈211〉2691〈212〉dna〈213〉蘋果〈400〉1atgatgggttcggtggaggagaagctcaaaactggatgcttgcttgatgagatgaagctgctgaaagagctgcaggaccactctgggacccggaaggctataaattcggagctatggcacgcttgcgccggcccgcttgtttgcttgccgcaggttgggagtctctcgtactacttcccccaaggacatagcgaacaggtggcggtttcgacgaaaagaacggcaacctcacaaattccgaactatcccaatctcccttctcagttgctatgccaagttcaaaatgttacactgcatgcagacaaagaaaccgacgaaatctatgcacaaatgagccttaaaccagtgagctctgaaagggatgtcttcccggtaccggactttggaatgaggcctagtaaacatccatctgagtttttctgcaaaactttgactgcaagtgacacaagcacacatggagggttctccgtgccgcgtagggcagcggaaaagctctttcctccgctggatttcacaatgcagccaccaacccaagaacttgttgtccgagacttgcacgataatacctggacatttcgccacatttatcgcgggcagccgaaacgacaccttctcacaactggatggagtttgtttgttggtgcaaagaggcttagagcaggggattccgttctatttatcagggatgagaagtcgcagctattgatcggtgtgagacgagcaaatcgtcagcaaacaacattgccgtcatcagttctatctgctgatagcatgcacattggtgtccttgctgctgcggctcatgctgcagctaatcggagtccattcactatattctacaatccaagggcatgcccttcagaatttgtcatacctttggccaccttccaaaaggctgtatttgggacacagctctcgattggcataaggtttggaatggtgttcgagacagaggagtcgggcaagcgcagatatatgggcacgatagttggtattagtgatttagatccgctgagatggcctggttcaaaatggcgaaatcttcaggtagagtgggatgagccagggtgttgtgataaacagaacagggttagttcatgggaaatcgaaactccggaaagtcttttcatatttccttctctgacttcgagtcttaaaagaccgatgcactctggattcttgggagcagaaaccgaatggggaaatatgaccaaaagatcattcatccgggttcctgagattggaaacgggaactcttttccatacccgatttcaaatctatgttcggaacagctagtcaatatgctaatgaaacctcagcttgttaatcatgctggaacattagctactctacaacaggaatcggctgctaatgtagattcagtagatatgaaggccatgcaggccaaaatcaaccaaaagaatccagctgatggtgtaaacgcgaatgcaccatctcatggaattccaccgggaaatctgaacaccgtagccaagtttggaagccaagcaccagttggaagtagcactgagaagatgaaatcagaacctgaactttctgcagatcagttaagtcagttgagttcggcagggcaaggcatcgaggataaattagctgcagggtttgcgagtccctataaccttatgaatcagctgacatttgccaaccaaaaccccagttcagcgcaactacaaactagtccgcggcctatgcagcctttggattcactactctaccactctcaacaaactgaattacctcattcggatttcaatggcatgaacagttcacttccattcctagacaatgatgaatgcatgttttactcttcttgcctacctttttctggggcactcagatcaccgggtcctttgtctgctttcggtttaccagattcttcaactgttttaactgacgcaaatacttcctccctaacttcaatcggtcaggacatgtgggataatagcctcattaattcaagcagcctgagagatttgtcggatgagagcaacaatcaaagtgggatctacggctgtccgaacattgatgttggtagctgcttaagtactgtcgtcgacccttctgtctcaagcactatactcgatgacttctctacgctgaagaatgccaacttccagaattcttcggattgtttggttaaaaacttgagctcaagccaggatcttcagtcgcagattacctcggtgagccttggagactctcaggctttctctaggcaagacctggcagacgcctcaggcggtacatcctcgagcaatgtagaacttgatgagagcagtctactgcagaacagttcgtggcatccggtggttgcacctgtgcgaacctacacaaaggttcaaaagacgggatctgttgggcggtcaattgatgttactaatttcaaaaactacgaagaactatgctctgcaatcgaatgcatgttcggactggaagggctgctaaatgatccaagaggttcagggtggaaattggtttatgtagattatgagaacgacgttctacttgtcggggatgatccttgggaggaatttgttggttgtgtccgctgcatcagaatcctttcgcctactgaagttcagcagatgagcgaagaaggcatgaagcttctgaacagtgctgcgatgcaagggatgaatagcaccatgtccgagggtggccgtccctaa2691〈210〉2〈211〉896〈212〉prt〈213〉蘋果〈400〉1mmgsveeklktgclldemkllkelqdhsgtrkainselwhacagplvclpqvgslsyyfpqghseqvavstkrtatsqipnypnlpsqllcqvqnvtlhadketdeiyaqmslkpvsserdvfpvpdfgmrpskhpseffcktltasdtsthggfsvprraaeklfppldftmqpptqelvvrdlhdntwtfrhiyrgqpkrhllttgwslfvgakrlragdsvlfirdeksqlligvrranrqqttlpssvlsadsmhigvlaaaahaaanrspftifynpracpsefviplatfqkavfgtqlsigirfgmvfeteesgkrrymgtivgisdldplrwpgskwrnlqvewdepgccdkqnrvssweietpeslfifpsltsslkrlmhsgflgaetewgnmtkrsfirvpeigngnsfpypisnlcseqlvnmlmkpqlvnhagtlatlqqesaanvdsvdmkamqakinqknpadgvnanapshgippgnlntvakfgsqapvgsstekmksepelsadqlsqlssagqgiedklaagfaspynhmnqltfanqnpssaqlqtsprpmqpldsllyhsqqtelphsdfngmnsslpfldndecmfyssclpfsgalrspgplsafglpdsstvltdantssltsigqdmwdnslinssslrdlsdesnnqsgiygcpnidvgsclstvvdpsvsstilddfstlknanfqnssdclvknlsssqdlqsqitsvslgdsqafsrqdladasggtsssnveldessllqnsswhpvvapvrtytkvqktgsvgrsidvtnfknyeelcsaiecmfglegllndprgsgwklvyvdyendvllvgddpweefvgcvrcirilsptevqqmseegmkllnsaamqgmnstmseggrp896當(dāng)前第1頁(yè)12