本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體來說是一種葉酸代謝相關(guān)基因的檢測方法。
背景技術(shù)：
葉酸又稱蝶酰谷氨酸，由喋啶核、對氨苯甲酸及谷氨酸3個部分組成。人和哺乳動物都只能通過腸道吸收外源的葉酸而不能自身合成葉酸。葉酸主要被小腸上段吸收，在十二指腸和空腸上皮黏膜細胞內(nèi)含葉酸還原酶，在該酶的作用下葉酸甲基化生成二氫葉酸，再甲基化后生成四氫葉酸。甲基四氫葉酸為一碳單位的載體，參與組成dna和rna的嘌呤和嘧啶等重要物質(zhì)的生物合成。葉酸代謝還具有很高的個體差異，而且受到生物體內(nèi)多種因素的影響，尤其是受葉酸代謝過程中重要的酶如亞甲基四氫葉酸還原酶(mthfr)和甲硫氨酸合成酶多態(tài)性的影響。葉酸在細胞內(nèi)需要代謝轉(zhuǎn)化才能發(fā)揮其生物學(xué)作用，亞甲基四氫葉酸還原酶是葉酸代謝通路中的關(guān)鍵酶，mthfr基因核苷酸多態(tài)(677c→t和1298a→c)使其編碼的酶功能活性降低，從而影響葉酸的生物轉(zhuǎn)化和功能。
葉酸是指具有相關(guān)生物活性的一類通效維生素，有蝶啶、對氨基苯甲酸和一個或多個谷氨酸結(jié)合而成，即由α-氨基-4-羥基蝶啶與對氨基苯甲酸相連接，在以-nh-co-鍵與谷氨酸鏈接組成，其不同的輔酶形成可以作為一碳單位的供體或載體而發(fā)揮作用，主要參與以下幾類反應(yīng)：①蛋氨酸合成；②嘌呤和嘧啶的合成；③絲氨酸和甘氨酸的相互轉(zhuǎn)化和組氨酸的降解。大量研究表明，葉酸攝入絕對或相對的缺乏，是引起高同型半胱氨酸血癥的直接原因。高同型半胱氨酸血癥可能導(dǎo)致新生兒神經(jīng)管缺陷(ntds)、唐氏綜合征(ds)、先天性心臟病(chd)、唇腭裂；孕婦妊娠高血壓、早產(chǎn)、自發(fā)性流產(chǎn)。
目前了解到涉及葉酸代謝能力的關(guān)鍵基因包括亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶(mtrr),這兩種酶的基因出現(xiàn)位點變異導(dǎo)致酶活性降低，會顯著影響機體的葉酸代謝能力,目前，葉酸代謝相關(guān)基因的檢測方法普遍存在檢測精確度差、速度慢的缺陷，需要進行有效的改進。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的檢測精確度差、速度慢的缺陷，而提供一種葉酸代謝相關(guān)基因的檢測方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是：本發(fā)明公開了一種葉酸代謝相關(guān)基因的檢測方法，具體步驟如下：
(1)、對檢測者的口腔黏膜細胞提取dna；
(2)、分別用seqno1和seqno2擴增mthfr基因c677t，用seqno3和seqno4擴增mthfr基因a1298c，用seqno5和seqno6擴增mtrr基因a66g，以口腔黏膜細胞提取dna為模板進行pcr反應(yīng)，取25ul體系，其包括:
模板：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno5:1ul、seqno6：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；
(3)、將上述3對引物進行普通pcr擴增產(chǎn)物1％的瓊脂糖凝膠電泳；
(4)、將1％的瓊脂糖凝膠電泳條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶；
(5)、測序反應(yīng)：
測序反應(yīng)5ul體系：引物1ul，膠回收產(chǎn)物為模板和水共3ul，bigdye1ul，測序反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存；
(6)、測序反應(yīng)產(chǎn)物純化，變性，上3730測序儀測序；
(7)、將測序結(jié)果用chromas軟件分析3個snp基因型即可。
作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，采用口腔拭子dna提取試劑盒對檢測者的口腔黏膜細胞提取dna；
作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，提取的dna濃度不低于10ng/ul，260/280＝1.8；
作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，所述的提供葉酸代謝能力基因檢測的特異性擴增的引物seqno1、seqno2、seqno3、seqno4、seqno5和seqno6，其堿基序列如下所示：
seqno1：cctctcctgactgtcatccc
seqno2：gccttcacaaagcggaagaa
seqno3：gtgggacgagttccctaacg
seqno4：cactccagcatcactcactttg
seqno5：gccttgaagtgatgaggagg
seqno6：ccactgtaacggctctaacc。
作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，其反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點：
本發(fā)明提供一種檢測葉酸代謝能力基因的方法，包括如下步驟：獲取受檢者核酸，所述核酸包含dna片段，所述的dna片段使用口腔拭子刮取口腔黏膜細胞，用天跟口空拭子提取試劑盒提取dna；檢測一下葉酸代謝能力基因的的snp位點的基因型，mthfr基因c677t、mthfr基因a1298c和mtrr基因a66g，其中包括3對引物擴增包含所述snp位點的dna片段，確定所述snp位點的堿基類型。受檢者可以是人或者其他哺乳動物。亞甲基四氫葉酸還原酶的c667t位點和a1298c位點催化產(chǎn)生5-甲基四氫葉酸，參與甲基傳遞及核苷酸合成通路，mthfr酶活性降低，同型半胱氨酸在體內(nèi)積累。甲硫氨酸合成酶(mtrr)的a66g位點將失活的甲硫氨酸合成酶還原成活性狀態(tài)，維持甲基傳遞通路繼續(xù)進行，mtrr酶的活性降低，易致同型半胱氨酸血癥、神經(jīng)管缺陷等疾病。上述snp位點根據(jù)hgvs命名法標注該位點在參考cdna上的位置來表示的，是為簡便指代某個特定snp位點，一個snp位點還可以有其它表示方式，如以下會出現(xiàn)的以“rs”開頭的snp位點表示方式，rs1801133與mthfr基因c677t表示同一個位點，該方式是genbanksnp數(shù)據(jù)庫的命名方法，以“rs”加7位阿拉伯數(shù)字來表示一個snp。根據(jù)數(shù)據(jù)庫如snp數(shù)據(jù)庫中確定并獲得特定snp位點基因序列上的位置信息的同時，也能獲得其前后序列、分布頻率等。本發(fā)明利用3個snp位點，確定了3個位點的3對引物，用pcr擴增sanger測序獲得3個位點的基因型。該方法是一種成本低，速度快、高準確度的葉酸代謝相關(guān)基因分型的方法。
經(jīng)過反復(fù)的實驗與推敲，本發(fā)明選出了3對特異性很好的引物，第一對用于檢測mthfr基因c677t基因型，第二對用于檢測mthfr基因a1298c基因型，第三對引物用于檢測mtrr基因a66g基因型。并且建立了穩(wěn)定的反應(yīng)體系，摸索出理想的反應(yīng)條件，應(yīng)用敏感度較高的丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)作為結(jié)果檢出手段，因此得出可靠地實驗結(jié)果。
附圖說明
圖1為實施例1的對3對引物進行普通pcr擴增產(chǎn)物1％的瓊脂糖凝膠電泳圖。
附圖標記為：m:marker2000；1:mthfr基因c677t；2:mthfr基因a1298c；3:mtrr基因a66g。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例進一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。
本發(fā)明公開了一種葉酸代謝相關(guān)基因的檢測方法，具體步驟如下：
(1)、對檢測者的口腔黏膜細胞提取dna；
(2)、分別用seqno1和seqno2擴增mthfr基因c677t，用seqno3和seqno4擴增mthfr基因a1298c，用seqno5和seqno6擴增mtrr基因a66g，以口腔黏膜細胞提取dna為模板進行pcr反應(yīng)，取25ul體系，其包括:
模板：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno5:1ul、seqno6：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；
(3)、將上述3對引物進行普通pcr擴增產(chǎn)物1％的瓊脂糖凝膠電泳；
(4)、將1％的瓊脂糖凝膠電泳條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶；
(5)、測序反應(yīng)：
測序反應(yīng)5ul體系：引物1ul，膠回收產(chǎn)物為模板和水共3ul，bigdye1ul，測序反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存；
(6)、測序反應(yīng)產(chǎn)物純化，變性，上3730測序儀測序；
(7)、將測序結(jié)果用chromas軟件分析3個snp基因型即可。
分析如下：表1
表2
作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，采用口腔拭子dna提取試劑盒對檢測者的口腔黏膜細胞提取dna；
作為優(yōu)選，所述的步驟(1)中，提取的dna濃度不低于10ng/ul，260/280＝1.8；
作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，所述的提供葉酸代謝能力基因檢測的特異性擴增的引物seqno1、seqno2、seqno3、seqno4、seqno5和seqno6，其堿基序列如下所示：
seqno1：cctctcctgactgtcatccc
seqno2：gccttcacaaagcggaagaa
seqno3：gtgggacgagttccctaacg
seqno4：cactccagcatcactcactttg
seqno5：gccttgaagtgatgaggagg
seqno6：ccactgtaacggctctaacc。
作為優(yōu)選，所述的步驟(2)中，其反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存。
實施例1
將孕婦唐某進行葉酸代謝相關(guān)基因檢測
(1)、用口腔拭子dna提取試劑盒對唐某的口腔黏膜細胞提取dna，確保dna濃度25ng/ul，260/280＝1.91；
(2)、分別用seqno1和seqno2擴增mthfr基因c677t；用seqno3和seqno4擴增mthfr基因a1298c；用seqno5和seqno6擴增mtrr基因a66g。以口腔黏膜細胞提取dna為模板進行pcr反應(yīng)，取25ul體系，其包括:
模板：2ul、seqno1:1ul、seqno2：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno3:1ul、seqno4：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；
模板：2ul、seqno5:1ul、seqno6：1ul、10×mspbuffer：2.5ul、20mmdntp：2ul、hotstarttaq：0.3ul、去離子水：16.2ul；
其反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存；
(3)、將上述3對引物進行普通pcr擴增產(chǎn)物1％的瓊脂糖凝膠電泳；
(4)、將1％的瓊脂糖凝膠電泳條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收mthfr基因c677t目的條帶168bp、mthfr基因a1298c目的條帶226bp和mtrr基因a66g目的條帶159bp；
(5)、測序反應(yīng)
測序反應(yīng)5ul體系：引物1ul，膠回收產(chǎn)物為模板和水共3ul，bigdye1ul。
測序反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，接著進入循環(huán)，95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25個循環(huán)，之后，繼續(xù)72℃延伸5min，4℃保存。
(6)、測序反應(yīng)產(chǎn)物純化，變性，上3730測序儀測序。
(7)、將測序結(jié)果用chromas軟件分析3個snp基因型。
檢測結(jié)果如表3
結(jié)果分析
上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。