本發(fā)明涉及基因檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌的引物組合物、試劑盒及其雙信號(hào)通道檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：根據(jù)實(shí)際情況，在反應(yīng)容器中可以實(shí)現(xiàn)任何以bstdna聚合酶為介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(包括交叉引物等溫?cái)U(kuò)增cpa；環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增lamp；智能等溫核酸擴(kuò)增smap；多自配引發(fā)擴(kuò)增imsa等技術(shù))。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增利用鏈置換dna聚合酶以及特異性引物，保證引物在等溫條件下順利與模板結(jié)合并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，有別于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)需要變溫才能進(jìn)行擴(kuò)增，可實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下的連續(xù)快速擴(kuò)增，具有較高的靈敏度、特異性和擴(kuò)增效率。核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液通常為無(wú)色透明，在實(shí)際操作過(guò)程中，經(jīng)常出現(xiàn)漏加、遺漏、移液混勻的不方面。需要一種能夠方便的確定反應(yīng)液充滿的顏色指示劑以便于實(shí)際的操作過(guò)程。專利文獻(xiàn)(cn104312913a)公開(kāi)了在反應(yīng)液中加入熒光染料鈣黃綠素作為顏色指示劑，不需要儀器在1小時(shí)內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的可視化檢測(cè)。但是該方法中每個(gè)反應(yīng)室體系為25μl，鈣黃綠素陰性結(jié)果為黃色，陽(yáng)性結(jié)果為綠色，在微小體積比如小于10μl反應(yīng)下顏色不易區(qū)分。專利文獻(xiàn)(cn106520517a)公開(kāi)了微流控芯片lamp可視化檢測(cè)儀，同樣利用熒光染料鈣黃綠素作為顏色指示劑，這套檢測(cè)系統(tǒng)包括微型攝像機(jī)和微型紫外熒光燈，利用陽(yáng)性反應(yīng)紫外下有熒光，陰性反應(yīng)無(wú)熒光進(jìn)行判定，但該套系統(tǒng)需要借助該外部?jī)x器。核酸擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)的建立是目前分子生物學(xué)和產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域重要的一個(gè)內(nèi)容，然而當(dāng)前反應(yīng)體系統(tǒng)存在工作液通常為透明，在移液、混勻、加樣等操作過(guò)程中，存在疏忽、漏加、操作不便等情況。因此建立一種具有顏色體系的核酸擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)，對(duì)于方便操作，避免漏加等具有一定實(shí)際意義。另外當(dāng)前的核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系的結(jié)果判定通常借助于熒光分析儀(如熒光定量pcr儀等)，不利于在門急診、現(xiàn)場(chǎng)等進(jìn)行快速的結(jié)果判讀，需要引進(jìn)一種特異性好、靈敏度高、操作方便的顏色變化顏色指示劑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提出一種金黃色葡萄球菌的引物組合物、試劑盒及其雙信號(hào)通道檢測(cè)方法，其在反應(yīng)體系中加入肉眼可見(jiàn)顏色指示劑，可提高加樣準(zhǔn)確度，同時(shí)在反應(yīng)體系中加入dna嵌入式染料在擴(kuò)增結(jié)束時(shí)依靠?jī)x器s型曲線判定結(jié)果，其與顏色指示劑肉眼可視化判定結(jié)合構(gòu)成雙信號(hào)通道檢測(cè)，更有利于實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的引物組合物，其包括seqidno：1所示序列的外引物1，seqidno：2所示序列的外引物2，seqidno：3所示序列的內(nèi)引物1以及seqidno：4所示序列的內(nèi)引物2。各引物的序列如下所示：外引物1(seqidno：1)：ttagcatctgcatggtttg；外引物2(seqidno：2)：gcaaagaagatggcaacaa；內(nèi)引物1(seqidno：3)：attgctgcagataacaaattagctggttgcttcttatcaacaacaagt；內(nèi)引物2(seqidno：4)：agcagtagtgccgtttgcttggtaacggagtacatgtcg。另一方面，本發(fā)明提供一種含有權(quán)利要求1所述的引物組合物的的試劑盒。為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：優(yōu)選地，該試劑盒包括所述試劑盒包括反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系包括seqidno：1-seqidno：4所示序列的引物、模板dna、顏色指示劑、dna嵌入式染料。優(yōu)選地，該試劑盒還包括bstdna聚合酶、dntps、mg2+、緩沖液和水。優(yōu)選地，每100μl反應(yīng)體系中，含有2μl外引物1、2μl外引物2、16μl內(nèi)引物1、16μl內(nèi)引物2、4μlbstdna聚合酶、0.5～1.5μl顏色指示劑、2.5～5μldna嵌入式染料；其中，所述外引物1、外引物2、內(nèi)引物1和內(nèi)引物2的濃度均為10μm，bstdna聚合酶的濃度為8u/μl，顏色指示劑的濃度為10mm，所述dna嵌入式染料為20×dna嵌入式染料；更優(yōu)選地，每100μl反應(yīng)體系中，含有1μl顏色指示劑、4μldna嵌入式染料，采用該體積的顏色指示劑和dna嵌入式染料能夠更為準(zhǔn)確的進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果的判讀。應(yīng)當(dāng)理解的是，在滿足擴(kuò)增反應(yīng)的條件下，上述反應(yīng)體系中采用的所有試劑的濃度及體積均可進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。最后，本發(fā)明還提供一種采用上述試劑盒檢測(cè)金黃色葡萄球菌的用于非診斷和治療目的的雙信號(hào)通道檢測(cè)方法，其包括如下步驟：步驟1)待檢樣品核酸提??；步驟2)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：在預(yù)定體積的含有顏色指示劑、dna嵌入式染料、待檢樣品dna及其擴(kuò)增引物所示序列的引物的反應(yīng)體系中進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；步驟3)結(jié)果判讀：根據(jù)擴(kuò)增結(jié)束后顏色指示劑的顏色變化進(jìn)行直接肉眼判讀和/或利用dna嵌入式染料結(jié)合特定儀器檢測(cè)核酸擴(kuò)增曲線進(jìn)行判讀。。為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：優(yōu)選地，待檢樣品dna為金黃色葡萄球菌核酸，擴(kuò)增引物為seqidno：1-seqidno：4所示序列。優(yōu)選地，步驟2)中顏色指示劑包括hnb、calcein、甲酚紅、酚紅、間甲酚紫、溴甲酚紫、中性紅、萘酚酞、百里酚藍(lán)；更優(yōu)選地，所述顏色指示劑為中性紅，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各反應(yīng)體系中樣本的顏色變化確定所述待測(cè)樣本液中是否含有相應(yīng)靶標(biāo)基因組：若所述待測(cè)樣品的顏色為紅色，則所述待測(cè)樣本液中含有相應(yīng)靶標(biāo)的基因；若所述待測(cè)樣品的顏色為黃色，則所述待測(cè)樣本液中不含有相應(yīng)靶標(biāo)的基因。優(yōu)選地，步驟2)中dna嵌入式染料包括sybrgreen、evergreen、picogreen、syto系列；更優(yōu)選為sybrgreen。優(yōu)選地，該方法也可用于病原體檢測(cè)，所述病原體包括細(xì)菌、真菌、dna病毒等，還可用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，癌癥基因檢測(cè)等，當(dāng)該方法適用于其他檢測(cè)對(duì)象時(shí)，只需改變反應(yīng)體系內(nèi)的各試劑的種類，并替換目標(biāo)dna及其引物，其具體步驟與檢測(cè)金黃色葡萄球菌的雙信號(hào)通道檢測(cè)方法相同。優(yōu)選地，步驟2)中的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在微流控芯片或pcr反應(yīng)管中進(jìn)行；更優(yōu)選為微流控芯片，由于微流控芯片反應(yīng)體系體積較小，顏色指示劑及dna嵌入式染料的種類及用量就更為重要，發(fā)明人經(jīng)過(guò)種類及濃度配比之后，優(yōu)先選用中性紅顏色指示劑和sybrgreen染料，上述組合使得肉眼可視化及擴(kuò)增曲線的兩種判讀方式互不干擾，且判讀結(jié)果準(zhǔn)確性更高。優(yōu)選地，所述微流控芯片的制作包括如下步驟：a)微流控芯片采用經(jīng)過(guò)表面處理的高透明材料制備；b)對(duì)步驟a)制備的微流控芯片采用等離子清洗機(jī)沖洗其表面，用惰性氣體風(fēng)干；c)對(duì)步驟b)中風(fēng)干后的微流控芯片采用壓敏鍵合膜進(jìn)行封裝。優(yōu)選地，所述高透明材料包括pc、pmma或coc。優(yōu)選地，采用等離子清洗和壓敏鍵合膜的封裝一方面有利于黏貼的更加牢固，另一方面起到芯片表面清洗的作用。上述微流控芯片包括底片、反應(yīng)檢測(cè)部分、通孔及封膜，所述通孔位于微流控芯片的中心，并與配套的設(shè)備相連接；所述反應(yīng)檢測(cè)部分包括加樣孔、儲(chǔ)液區(qū)、預(yù)留區(qū)、反應(yīng)孔、球閥、廢液缸、排氣孔、第一通道和第二通道，所述預(yù)留區(qū)為凹凸線紋通道，一端連接加樣孔，另一端連接排氣孔，所述第一通道和第二通道位于底片上，第一通道連接預(yù)留區(qū)、廢液缸和排氣孔，第二弧形通道連接排氣孔、廢液缸和預(yù)留區(qū)，所述球閥位于預(yù)留區(qū)與反應(yīng)孔之間；該微流控芯片的結(jié)構(gòu)可以根據(jù)需要做相應(yīng)變化；進(jìn)一步地，該微流控芯片本身自帶內(nèi)部質(zhì)控功能(陽(yáng)性質(zhì)控、陰性質(zhì)控)，質(zhì)控位點(diǎn)可以根據(jù)需要靈活調(diào)整，以彌補(bǔ)恒溫?cái)U(kuò)增無(wú)法進(jìn)行質(zhì)控的缺點(diǎn)；反應(yīng)體系首先加入微流控芯片的加樣孔中，液體在離心力作用下流入反應(yīng)孔內(nèi)，于微流控芯片核酸分析儀進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。優(yōu)選地，檢測(cè)對(duì)象為金黃色葡萄球菌時(shí)，所述步驟3)中恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為60～70℃15～60min；更優(yōu)選為60℃60min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明實(shí)現(xiàn)以下三個(gè)功能：1)反應(yīng)液的顏色化；2)擴(kuò)增反應(yīng)最終結(jié)果的肉眼判讀法；3)肉眼判讀法和熒光法的雙信號(hào)系統(tǒng)。本發(fā)明的反應(yīng)體系中加入肉眼可見(jiàn)顏色指示劑，該顏色指示劑可在反應(yīng)前加入，不影響擴(kuò)增，同時(shí)可以指示反應(yīng)結(jié)果，陰性為黃色，陽(yáng)性為紅色，同時(shí)利用該顏色指示劑使得反應(yīng)混合物具有一定顏色，有利于快速、方便的操作和移取液體。本發(fā)明在基于bst酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增系統(tǒng)中，同步使用兩種信號(hào)通道，一種為dna擴(kuò)增子嵌入式染料；另外一種為顏色指示劑染料。通過(guò)優(yōu)化其濃度，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)信號(hào)通道不相互干擾的效果。根據(jù)本發(fā)明的定性檢測(cè)方法，可以依據(jù)顏色變化(陽(yáng)性為紅色，陰性為黃色)目測(cè)對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行定性分析，也可以依據(jù)s型曲線ct值進(jìn)行判定，實(shí)現(xiàn)雙信號(hào)判定。本發(fā)明可根據(jù)不同使用場(chǎng)景，使用不同信號(hào)通道來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果的判定。在有條件的場(chǎng)所進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光判讀，在沒(méi)條件的地方實(shí)現(xiàn)肉眼直接判讀，擴(kuò)大該反應(yīng)體系的應(yīng)用和使用場(chǎng)所。本發(fā)明所提供的基于bst酶鏈置換特性的雙信號(hào)通道檢測(cè)方法，可以根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景需要，選定其中一種信號(hào)通道進(jìn)行結(jié)果的判定，可以在三甲等大醫(yī)院進(jìn)行應(yīng)用，也可以在基層醫(yī)院進(jìn)行廣泛的應(yīng)用。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明一實(shí)施例中采用的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明一實(shí)施例中可采用的其他微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本發(fā)明用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌，在微流控芯片中擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后樣品的s型曲線檢測(cè)結(jié)果圖；圖4為圖3所述的樣品的肉眼可視化檢測(cè)結(jié)果圖；圖5為本發(fā)明用于檢測(cè)單增李斯特氏菌，在反應(yīng)試管中擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后樣品的肉眼可視化檢測(cè)結(jié)果圖和s型曲線檢測(cè)結(jié)果圖；圖6為圖5所述的樣品中的顏色指示劑的特異性和靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖；圖7為本發(fā)明用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆基因，在反應(yīng)試管中擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后樣品的肉眼可視化檢測(cè)結(jié)果圖和s型曲線檢測(cè)結(jié)果圖；圖中附圖標(biāo)記為：1、加樣孔；2、儲(chǔ)液區(qū)；3、預(yù)留區(qū)；4、反應(yīng)孔；5、球閥；6、廢液槽；7、排氣孔；8、第一弧形通道；9、第二弧形通道。1#～4#：反應(yīng)檢測(cè)部分；a～h：樣本dna的擴(kuò)增反應(yīng)孔。在下文中，反應(yīng)檢測(cè)部分1#的反應(yīng)孔a以1#-a表示，反應(yīng)檢測(cè)部分1#的反應(yīng)孔b以1#-b表示，依次類推。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一本實(shí)施例為用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的雙信號(hào)通道檢測(cè)方法，其與微流控芯片相結(jié)合。(1)本實(shí)施例采用的微流控芯片的結(jié)構(gòu)；如圖1所示，本發(fā)明采用的微流控芯片為圓盤形微流控芯片，其包括4個(gè)反應(yīng)檢測(cè)部分，每一反應(yīng)檢測(cè)部分包括加樣孔1、儲(chǔ)液區(qū)2、預(yù)留區(qū)3、反應(yīng)孔4、球閥5、廢液槽6、排氣孔7、第一弧形通道8和第二弧形通道9，其中球閥5為為毛細(xì)微閥，其尺寸大小非常關(guān)鍵，一方面利于完成液體的二次離心分配(50～300um)，第二方面防止液體蒸發(fā)和不同反應(yīng)孔之間的交叉污染；上述第一弧形通道8和第二弧形通道9位于底片上，第一弧形通道8連接預(yù)留區(qū)3和排氣孔7，第二弧形通道9連接加樣孔1、儲(chǔ)液區(qū)2和預(yù)留區(qū)3，上述球閥5位于預(yù)留區(qū)3與反應(yīng)孔2之間，每個(gè)反應(yīng)檢測(cè)部分具有8個(gè)反應(yīng)孔；其中，所述加樣孔1與排氣孔7處均貼有硅膠貼或者橡膠塞，等完成加樣后，利用橡膠塞塞住加樣孔，增加內(nèi)部氣壓，可以避免在加熱反應(yīng)過(guò)程中，液體的蒸發(fā)情況。如圖2所示，本發(fā)明也可采用其他結(jié)構(gòu)形式的微流控芯片，其可以根據(jù)需要做相應(yīng)的調(diào)整變化，如a×b型，其中a代表樣本數(shù)/盤；b代表靶點(diǎn)數(shù)。具體為2-1表示的2×16，2-2表示的4×8，2-3表示的8×4，2-4表示的16×2。上述微流控芯片通過(guò)不同加樣孔進(jìn)行進(jìn)樣離心，預(yù)留區(qū)通過(guò)球閥與儲(chǔ)液區(qū)相通，通過(guò)離心機(jī)的低速(1000rpm)離心，儲(chǔ)液區(qū)的液體在離心力作用下依次流入預(yù)留區(qū)中；預(yù)留區(qū)通過(guò)球閥與反應(yīng)孔相通，再通過(guò)高速(3000rpm)離心，預(yù)留區(qū)的液體在離心力作用下依次流入反應(yīng)孔中，多余液體流入廢液槽中；在反應(yīng)孔在一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)，加熱進(jìn)入反應(yīng)階段時(shí)，球閥防止加樣孔中的液體回流到預(yù)留區(qū)中進(jìn)而向周圍反應(yīng)孔擴(kuò)散，同時(shí)保證反應(yīng)孔中的液體是全滿狀態(tài)，保證反應(yīng)進(jìn)行并且防止污染。本發(fā)明所述的微流控芯片采用高透明材料制備，如pc，pmma，或者coc等，并經(jīng)過(guò)表面處理，避免生物大分子，如活性酶在芯片表面的附著，影響整體酶促反應(yīng)；將微流控芯片進(jìn)行等離子清洗，用等離子清洗機(jī)沖洗微流控基片表面，用惰性氣體風(fēng)干，并采用壓敏鍵合膜進(jìn)行封裝，此種方式一方面有利于黏貼的更加牢固，另一方面起到芯片表面清洗的作用，本發(fā)明采用的壓力鍵合膜粘性強(qiáng)度、能夠耐受常規(guī)加熱溫度、對(duì)所進(jìn)行的反應(yīng)沒(méi)有顯著不良影響；微流控芯片還可自帶內(nèi)部質(zhì)控功能(陽(yáng)性質(zhì)控、陰性質(zhì)控)，質(zhì)控位點(diǎn)可以根據(jù)需要靈活調(diào)整，以彌補(bǔ)恒溫?cái)U(kuò)增無(wú)法進(jìn)行質(zhì)控的缺點(diǎn)。(2)用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的雙信號(hào)通道檢測(cè)方法的建立；1)待檢測(cè)樣品核酸提取；用磁珠法核酸提取試劑盒提取金黃色葡萄球菌核酸，操作步驟如下：a)核酸提取純化準(zhǔn)備a.裂解液如有沉淀，請(qǐng)于56℃溫浴至沉淀完全溶解后使用。b.使用前，加24ml無(wú)水乙醇至洗液三中，混勻，并做好標(biāo)記(確保瓶蓋擰緊，防止乙醇揮發(fā))。c.將蛋白酶混合物充分混勻后，按照每管20μl分裝至各離心管中。d.按照每管分裝10μl內(nèi)標(biāo)的量至各離心管中。b)核酸提取純化步驟a.向上述已分好蛋白酶和內(nèi)標(biāo)的離心管中加入200μl臨床樣本和陰陽(yáng)性對(duì)照，輕輕混勻；然后再加入400μl裂解液，漩渦振蕩10s，56℃孵育10分鐘。b.然后加入300μl核酸共沉劑和2μl磁珠，上下顛倒離心管10次，使管內(nèi)磁珠分布均勻。c.靜置離心管10分鐘，期間每隔兩分鐘上下顛倒離心管5次，使管內(nèi)磁珠分布均勻。d.離心管置于離心機(jī)上，8000g離心1min，用移液器吸去管內(nèi)液體。e.加入500μl洗液一，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，漩渦振蕩10s，直至其分布均勻。f.將離心管置于離心機(jī)上，8000g離心1min，用移液器吸去管內(nèi)液體。g.加入500μl洗液二，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，漩渦振蕩10s，直至其分布均勻。h.將離心管置于離心機(jī)上，8000g離心1min，用移液器吸去管內(nèi)液體。i.加入500μl洗液三，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，漩渦振蕩10s，直至其分布均勻。j.將離心管置于離心機(jī)上，8000g離心1min，用移液器吸去管內(nèi)液體。k.將離心管置于離心機(jī)上，8000g離心30s，用移液器吸去管內(nèi)殘余液體。l.打開(kāi)管蓋，室溫干燥2分鐘。m.加入60μl洗脫液，用移液器槍頭打散管壁磁珠，直至其分布均勻。56℃孵育3分鐘。n.將離心管置于離心機(jī)上，10000g離心1min。將收集到的60μl上清液吸取至一個(gè)無(wú)核酸酶干凈的離心管中，即為純化后的核酸溶液用于恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增。將提取好的核酸進(jìn)行濃度測(cè)定。2)設(shè)計(jì)特定的金黃色葡萄球菌的特異性引物；金黃色葡萄球菌特異性引物包括：外引物1：ttagcatctgcatggtttg(seqidno：1)；外引物2：gcaaagaagatggcaacaa(seqidno：2)；內(nèi)引物1：attgctgcagataacaaattagctggttgcttcttatcaacaacaagt(seqidno：3)；內(nèi)引物2：agcagtagtgccgtttgcttggtaacggagtacatgtcg(seqidno：4)；上述引物用于核酸靶標(biāo)的檢測(cè)。1組8個(gè)反應(yīng)孔中，檢測(cè)的是同一濃度的靶標(biāo)；3)lamp恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：將待測(cè)樣本dna梯度稀釋至104，103，102copies/μl，ddh2o分別和顏色指示劑中性紅、dna嵌入式染料sybrgreen、引物、反應(yīng)試劑(酶，dntps和緩沖液)混合后，注入相應(yīng)芯片的加樣孔；備注：mix4模板：104copies/μl，mix3模板：103copies/μl，mix2模板：102copies/μl，mix1模板：ddh2o；10mm中性紅和20×sybrgreen的最佳體積分別為1ul和4ul。取80μl上述預(yù)混液通過(guò)加樣孔分別加樣，mix1加到1#反應(yīng)檢測(cè)部分的反應(yīng)孔，mix2加到2#反應(yīng)檢測(cè)部分的反應(yīng)孔，mix3加到3#反應(yīng)檢測(cè)部分的反應(yīng)孔，mix4加到4#反應(yīng)檢測(cè)部分的反應(yīng)孔，加樣后，加樣孔與排氣孔用封口硅膠，覆蓋在加樣孔與排氣孔上，對(duì)該微流控芯片進(jìn)行離心處理。將加樣且離心處理后的芯片放到配套儀器微流控芯片核酸分析儀內(nèi)，60℃60min完成擴(kuò)增反應(yīng)。4)采用雙信號(hào)通道進(jìn)行結(jié)果判讀；在配套儀器微流控芯片核酸分析儀上陽(yáng)性反應(yīng)孔出現(xiàn)s形擴(kuò)增曲線，陰性反應(yīng)孔沒(méi)有擴(kuò)增曲線，若檢測(cè)到某反應(yīng)孔出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，則該反應(yīng)孔對(duì)應(yīng)的該樣本的檢測(cè)指標(biāo)為陽(yáng)性。如圖3所示，擴(kuò)增曲線對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔分別為4#-a(104copies/μl模板擴(kuò)增)，3#-a(103copies/μl模板擴(kuò)增)，2#-a(102copies/μl模板擴(kuò)增)，1#-a(ddh2o)，其中4#-a、3#-a、2#-a都有s型擴(kuò)增曲線，1#-a作為陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線。在芯片上陽(yáng)性反應(yīng)孔為紅色，陰性反應(yīng)孔為黃色，若檢測(cè)到某反應(yīng)孔出現(xiàn)紅色，則該反應(yīng)孔對(duì)應(yīng)的該樣本的該檢測(cè)指標(biāo)為陽(yáng)性。如圖4所示，1#反應(yīng)檢測(cè)區(qū)的8個(gè)反應(yīng)孔為ddh2o，顏色為黃色；2#反應(yīng)檢測(cè)區(qū)的8個(gè)反應(yīng)孔為102copies/μl模板擴(kuò)增，顏色為紅色；3#反應(yīng)檢測(cè)區(qū)的8個(gè)反應(yīng)孔為103copies/μl模板擴(kuò)增，顏色為紅色；4#反應(yīng)檢測(cè)區(qū)的8個(gè)反應(yīng)孔為104copies/μl模板擴(kuò)增，顏色為紅色。由上述結(jié)果可知，擴(kuò)增曲線的擴(kuò)增定性結(jié)果與中性紅顏色指示劑顏色變化判定一致，曲線判定方法與顏色終點(diǎn)法具有一致的檢測(cè)靈敏度。本實(shí)施例在微流控芯片中的反應(yīng)體系中加入肉眼可見(jiàn)顏色指示劑，該顏色指示劑可在反應(yīng)前加入，不影響擴(kuò)增，同時(shí)可以指示反應(yīng)結(jié)果；其結(jié)果采用雙信號(hào)通道判讀，采用配套儀器s型曲線ct值檢測(cè)同步結(jié)合顏色指示劑顏色變化肉眼判讀，有利于檢測(cè)結(jié)果判讀的準(zhǔn)確性，同時(shí)可在不同應(yīng)用場(chǎng)合進(jìn)行應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)可應(yīng)用配套儀器對(duì)擴(kuò)增ct值結(jié)合肉眼顏色變化進(jìn)行檢測(cè)，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)室，無(wú)特定檢測(cè)設(shè)備時(shí)可僅依靠顏色變化肉眼判定。本實(shí)施例所述的微流控芯片芯片通過(guò)緩沖區(qū)保障離心分配后反應(yīng)室里液體全滿，但凹凸線紋通道寬度極細(xì)，會(huì)導(dǎo)致離心時(shí)有部分反應(yīng)室液體未滿，透明的液體在透明的芯片中不易觀察，因此加入顏色指示劑后可以方便的確定液體充滿情況，也便于加樣，提高加樣的準(zhǔn)確度。根據(jù)本實(shí)施例的定性檢測(cè)方法，可以依據(jù)目測(cè)對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行定性分析，本發(fā)明的優(yōu)越之處在與兼顧微流控芯片檢測(cè)性能以及可操作性，既可以結(jié)合配套儀器，也可以根據(jù)肉眼觀測(cè)最終結(jié)果，因此該系統(tǒng)可以適應(yīng)高通量自動(dòng)化或簡(jiǎn)便操作的要求。實(shí)施例二本實(shí)施例為用于檢測(cè)單增李斯特氏菌的雙信號(hào)通道檢測(cè)方法。1)待檢測(cè)樣品核酸提?。徊捎么胖榉ㄌ崛卧隼钏固厥暇鷮?shí)際樣本(糞便樣本)的總基因組核酸，磁珠核酸提取步驟：a.取待檢樣本200μl，依次加入20μl蛋白酶k溶液、400μl裂解液，漩渦振蕩10s，56℃孵育10分鐘。b.加入300μl異丙醇和2μl磁珠，上下顛倒離心管10次，使管內(nèi)磁珠分布均勻。c.靜置離心管10分鐘，每隔兩分鐘上下顛倒離心管5次，使管內(nèi)磁珠分布均勻。d.將離心管置于離心機(jī)上，10000g離心1min，用移液器吸去管內(nèi)液體。e.加入500μl洗液一，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，漩渦振蕩10s，直至其分布均勻。f.將離心管置于離心機(jī)上，10000g離心1min。用移液器吸去管內(nèi)液體。g.加入500μl洗液二，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，漩渦振蕩10s，直至其分布均勻。h.將離心管置于離心機(jī)上，10000g離心1min。用移液器吸去管內(nèi)液體。i.加入500μl洗液三，用移液器槍頭輕柔打散管壁磁珠，漩渦振蕩10s，直至其分布均勻。j.將離心管至于離心機(jī)上，10000g離心1min。用移液器吸去管內(nèi)液體。k.將離心管至于離心機(jī)上，10000g離心30s。用移液器吸去管內(nèi)殘余液體。l.打開(kāi)管蓋，室溫干燥2分鐘。m.加入80μl洗脫液，用移液器槍頭打散管壁磁珠，直至其分布均勻。56℃孵育3分鐘。n.將離心管置于離心機(jī)上，10000g離心1min。吸取上清液至一個(gè)干凈的無(wú)核酶離心管中，此即為純化后的核酸溶液。2)設(shè)計(jì)特定的單增李斯特氏菌的特異性引物；單增李斯特氏菌特異性引物包括：外引物1：tgatcactctggaggctac(seqidno：5)；外引物2：ccattcccaagctaaacca(seqidno：6)；內(nèi)引物1：tgaacaatttcgttaccttcaggatgttgctcaattcaacatctctt(seqidno：7)；內(nèi)引物2：agcaagttagctcatttcacatcggtgcattctttggcgtaa(seqidno：8)；3)配置恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系(50μl體系)20mmtris-hcl(ph8.8@25℃)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，8mmmgs04,0.1％tween-20，20×dna嵌入式染料(sybrgreen)，肉眼顏色指示劑(中性紅)。f3/b3＝0.2um；fip/bip＝1.6um；lf/lb＝0.8um。bst酶8u。4)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：將混好的反應(yīng)液加入pcr反應(yīng)管中，再加入100μl礦物油封閉，用封板膜蓋好孔口，放入熒光定量pcr儀中(abi7500)中60℃60mins。5)結(jié)果判定：如圖5中的5-1所示，同時(shí)利用肉眼顏色指示劑，反應(yīng)液變成紅色的判定為陽(yáng)性結(jié)果，反應(yīng)液為陰性的判定為陰性結(jié)果；如圖5中的5-2所示，出現(xiàn)s型曲線的判定為陽(yáng)性結(jié)果，沒(méi)有出現(xiàn)s型曲線的判定為陰性結(jié)果。如圖6所示，采用6個(gè)反應(yīng)體系來(lái)驗(yàn)證顏色指示劑的特異性和靈敏度，由圖可知擴(kuò)增曲線的擴(kuò)增定性結(jié)果與中性紅顏色指示劑顏色變化判定一致，曲線判定方法與顏色終點(diǎn)法具有一致的檢測(cè)靈敏度。實(shí)施例三本實(shí)施例為用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆基因的雙信號(hào)通道檢測(cè)方法。1)mon87701品系體系配制：20mmtris-hcl(ph8.8@25℃)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，8mmmgs04,0.1％tween-20，20×dna嵌入式染料(sybrgreen)，顏色指示劑(中性紅)。f3/b3＝0.2um；fip/bip＝1.6um；lf/lb＝0.8um。bst酶8u。mon87701品系體系特異性引物包括：外引物1：cacgcttagtgtgtgtgt(seqidno：9)；外引物2：cgaccacggaaaaaaaacac(seqidno：10)；內(nèi)引物1：cgatatcaagcttgatggggatcacaaacactgatagtttaaactgaag(seqidno：11)；內(nèi)引物2：cgggggatccactagttctagtgaattcgagctcggtac(seqidno：12)；2)試驗(yàn)樣本準(zhǔn)備：mon87701陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照；mon87701質(zhì)粒稀釋。稀釋后終濃度1×1061×1051×1045×1031×1035×1021×102dna15μl20μl100μl40μl100μl40μlh2o135μl180μl100μl160μl100μl160μl3)加樣及恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：將reactionmix震蕩混勻后按每管21μl分裝，每管依次加入稀釋好的樣本4μl，加樣順序見(jiàn)下表。1211109876543211041045x1035x1031031035x1025x102102102nn將混好的反應(yīng)液加入pcr反應(yīng)管中，再加入10μl礦物油封閉，用封板膜蓋好孔口，放入熒光定量pcr儀中(abi7500)中60℃60mins。4)結(jié)果判讀：如圖7的7-1所示，顏色指示擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物強(qiáng)陽(yáng)性為紅色，陰性和弱陽(yáng)性為黃色，顏色指示擴(kuò)增結(jié)果，肉眼可見(jiàn)，區(qū)分強(qiáng)陽(yáng)性和陰性(弱陽(yáng))；如圖7的7-2所示，出現(xiàn)s型曲線的判定為陽(yáng)性結(jié)果，沒(méi)有出現(xiàn)s型曲線的判定為陰性結(jié)果。由上述結(jié)果可知，擴(kuò)增曲線的擴(kuò)增定性結(jié)果與顏色指示劑顏色變化判定一致，曲線判定方法與顏色終點(diǎn)法具有一致的檢測(cè)靈敏度。通過(guò)上述實(shí)施例表明，本發(fā)明所述的檢測(cè)金黃色葡萄球菌的雙信號(hào)通道檢測(cè)方法，在反應(yīng)體系中加入肉眼可見(jiàn)顏色指示劑避免操作人員不易辨認(rèn)是否加樣成功的問(wèn)題，同時(shí)兼顧各場(chǎng)地的可操作性，采用雙信號(hào)通道檢測(cè)方法，既可以利用dna嵌入式染料結(jié)合配套儀器進(jìn)行擴(kuò)增曲線的檢測(cè)，也可以根據(jù)顏色指示劑的可視化肉眼觀測(cè)最終結(jié)果，本發(fā)明可根據(jù)不同使用場(chǎng)景，使用不同信號(hào)通道來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果的判定，這使本發(fā)明在實(shí)際應(yīng)用中更加簡(jiǎn)便、快捷、并且容易操作、適用于現(xiàn)場(chǎng)操作；該雙信號(hào)通道檢測(cè)方法也適用于其他病原微生物的檢測(cè)。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。sequencelisting<110>上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司<120>一種檢測(cè)金黃色葡萄球菌的引物組合物、試劑盒及其雙信號(hào)通道檢測(cè)方法<130>ipi171686<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>金黃色葡萄球菌外引物1<400>1ttagcatctgcatggtttg19<210>2<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>金黃色葡萄球菌外引物2<400>2gcaaagaagatggcaacaa19<210>3<211>48<212>dna<213>artificialsequence<220><223>金黃色葡萄球菌內(nèi)引物1<400>3attgctgcagataacaaattagctggttgcttcttatcaacaacaagt48<210>4<211>39<212>dna<213>artificialsequence<220><223>金黃色葡萄球菌內(nèi)引物2<400>4agcagtagtgccgtttgcttggtaacggagtacatgtcg39<210>5<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>單增李斯特氏菌外引物1<400>5tgatcactctggaggctac19<210>6<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>單增李斯特氏菌外引物2<400>6ccattcccaagctaaacca19<210>7<211>47<212>dna<213>artificialsequence<220><223>單增李斯特氏菌內(nèi)引物1<400>7tgaacaatttcgttaccttcaggatgttgctcaattcaacatctctt47<210>8<211>42<212>dna<213>artificialsequence<220><223>單增李斯特氏菌內(nèi)引物2<400>8agcaagttagctcatttcacatcggtgcattctttggcgtaa42<210>9<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>mon87701品系外引物1<400>9cacgcttagtgtgtgtgt18<210>10<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>mon87701品系外引物2<400>10cgaccacggaaaaaaaacac20<210>11<211>49<212>dna<213>artificialsequence<220><223>mon87701品系內(nèi)引物1<400>11cgatatcaagcttgatggggatcacaaacactgatagtttaaactgaag49<210>12<211>39<212>dna<213>artificialsequence<220><223>mon87701品系內(nèi)引物2<400>12cgggggatccactagttctagtgaattcgagctcggtac39當(dāng)前第1頁(yè)12