本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查的基因標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
藥物引起過敏反應(yīng)主要分為i型(速發(fā)型)、ii型(細(xì)胞毒型)、iii型(免疫復(fù)合物型)、iv型(遲發(fā)型)過敏反應(yīng)及類過敏反應(yīng)。類過敏反應(yīng)的臨床癥狀與過敏反應(yīng)類似。但其反應(yīng)機(jī)理與i型過敏反應(yīng)并不相同。當(dāng)藥物進(jìn)入體內(nèi)后，可直接導(dǎo)致肥大細(xì)胞釋放內(nèi)容物，觸發(fā)過敏反應(yīng)，且臨床癥狀嚴(yán)重。過敏性休克發(fā)生于極少數(shù)接受治療劑量藥物的個體，沒有致敏過程，患者血清ige濃度也未見升高，但表現(xiàn)為典型的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)癥狀，因此又被稱為假藥物變態(tài)反應(yīng)。類過敏反應(yīng)與抗原特異性免疫反應(yīng)無關(guān)，在初次接觸該類藥物時發(fā)生，且與劑量、注射速度有一定的相關(guān)性。作為過敏主要效應(yīng)器的肥大細(xì)胞，不僅可被特異性ige附著而活化導(dǎo)致脫顆粒，引起i型過敏，也可被炎癥因子、藥物等多種促分泌物質(zhì)直接激活導(dǎo)致細(xì)胞脫顆粒，引起臨床常見的類過敏反應(yīng)，使患者出現(xiàn)皮損癥狀，即表現(xiàn)出紅斑、蕁麻疹、水腫等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致哮喘、休克等癥狀。目前類過敏反應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)理尚未完全認(rèn)識，可能與致敏物質(zhì)直接刺激肥大細(xì)胞釋放組胺，或直接由c5a、c3a、c4a等過敏毒素與肥大細(xì)胞特異性膜受體結(jié)合后介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒有關(guān)。
類過敏反應(yīng)的臨床表現(xiàn)為局部皮膚癥狀，如頭面部、胸部及四肢的血管擴(kuò)張、紅斑、水腫、眼結(jié)膜充血；消化系統(tǒng)癥狀，如流涎、惡心、嘔吐、腹瀉、厭食；呼吸循環(huán)系統(tǒng)癥狀，如胸悶、心悸、血壓升高、呼吸困難，嚴(yán)重的可發(fā)生呼吸循環(huán)衰竭，導(dǎo)致患者休克、死亡。其癥狀特點與藥物靜脈注射的速度有關(guān)，注射速度越快，組胺的釋放量越大，機(jī)體反應(yīng)越嚴(yán)重，即低劑量、低濃度，可無或僅出現(xiàn)輕微癥狀；大劑量、高濃度可誘發(fā)嚴(yán)重的藥品不良反應(yīng)。但是，機(jī)體的反應(yīng)癥狀會隨著重復(fù)給藥逐漸減弱甚至自行消退，而過敏反應(yīng)則不具有此特點。
類過敏反應(yīng)近年來在臨床中的發(fā)生頻率不斷升高，約占急性過敏反應(yīng)的77％，在中藥注射劑引起的過敏性休克中，約3/4屬于類過敏反應(yīng)，由于其臨床危害性大，日益成為醫(yī)療工作者關(guān)注的熱點。但是，目前臨床上并沒有監(jiān)控類過敏反應(yīng)的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，更沒有提前檢測患者發(fā)生類過敏反應(yīng)風(fēng)險的相關(guān)研究。常規(guī)的標(biāo)志物組胺、類胰蛋白酶和ige都存在各種各樣的問題，并不適用于臨床檢測類過敏反應(yīng)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種用于藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查的基因標(biāo)志物及其應(yīng)用，以解決目前患者發(fā)生類過敏反應(yīng)風(fēng)險篩查技術(shù)手段欠缺的問題。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
一種用于藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查的基因標(biāo)志物，所述基因標(biāo)志物為mrgprx2受體的特征基因序列。
所述mrgprx2受體的特征基因序列如seqidno.1所示。
所述的用于藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查的基因標(biāo)志物在制備藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查產(chǎn)品中的應(yīng)用。
所述藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查產(chǎn)品包括用實時定量pcr方法篩查藥物類過敏反應(yīng)敏感人群的產(chǎn)品。
所述用實時定量pcr方法篩查藥物類過敏反應(yīng)敏感人群的產(chǎn)品包含特異性擴(kuò)增mrgprx2受體的特征基因序列的引物。
所述引物包括forward引物和reverse引物，其中forward引物的序列如seqidno.2所示，reverse引物的序列如seqidno.3所示。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明提供的用于藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查的基因標(biāo)志物為mrgprx2受體的特征基因序列。該基因標(biāo)志物能夠用于藥物類過敏反應(yīng)敏感人群的篩查，能夠在制備藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查產(chǎn)品等方面得到應(yīng)用，該基因標(biāo)志物可用于患者類過敏反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險的篩查和診斷，具有很高的敏感性和特異性，而且由于在篩查過程中采用臨床上最易采集的外周血進(jìn)行檢測，即用pcr擴(kuò)增的方法檢測外周血中mrgprx2受體特征基因序列的含量，即可評估類過敏反應(yīng)發(fā)生的風(fēng)險，使用方便，適于患者用藥前大規(guī)模人群篩查，對促進(jìn)類過敏反應(yīng)易發(fā)生人群的提前發(fā)現(xiàn)，提高用藥的安全性有重要意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。
進(jìn)一步的，本發(fā)明提供的用于藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查的基因標(biāo)志物包含seqidno.2和seqidno.3所示的外周血mrgprx2受體的特征基因序列。本發(fā)明還提供了所述基因標(biāo)志物在制備藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查產(chǎn)品中的應(yīng)用。藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查產(chǎn)品(即篩查類過敏反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險的產(chǎn)品)包括用實時定量pcr方法篩查藥物類過敏反應(yīng)敏感人群的產(chǎn)品。而用實時定量pcr方法篩查類過敏反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險的產(chǎn)品包含特異性擴(kuò)增外周血mrgprx2基因序列的引物，其序列如seqidno.2和seqidno.3所示。
具體實施方式
研究發(fā)現(xiàn)：類過敏刺激物首先激活細(xì)胞膜上的g蛋白，進(jìn)而激活蛋白激酶c和ca2+通道，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。伴隨著細(xì)胞內(nèi)ca2+濃度增加，肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞內(nèi)的顆粒囊泡向胞漿膜移動并釋放生物介質(zhì)，從而引發(fā)類過敏反應(yīng)。類過敏刺激物所激活的g蛋白為mrgprs(mas-relatedgprotein-coupledreceptors)，該受體不依賴ige，可直接介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒。此類受體在各種屬、組織和器官的表達(dá)類型并不相同：其中mrgprx2在人源肥大細(xì)胞中表達(dá)；該受體胞外區(qū)為感應(yīng)區(qū)，特異性不高，當(dāng)胞外被脫顆粒多肽、p物質(zhì)、compound48/80、β-防御素等多種物質(zhì)激活后，胞內(nèi)區(qū)信號觸發(fā)，引起肥大細(xì)胞激活，釋放組胺等顆粒物質(zhì)，刺激細(xì)胞旁分泌，從而影響到周圍細(xì)胞。mrgprx2是很多小分子藥物引起類過敏、假性過敏的作用靶點。因此通過對mrgprx2基因拷貝數(shù)的分析，從而推測出mrgprx2受體在不同患者中的表達(dá)量，有助于評價患者在用藥過程中發(fā)生類過敏反應(yīng)的風(fēng)險，對臨床上指導(dǎo)用藥的安全性具有重要意義。
本發(fā)明通過定量分析外周血總rna的基因表達(dá)狀況，比較隨機(jī)取樣患者和發(fā)生過藥物類過敏反應(yīng)患者兩組樣本中外周血mrgprx2基因的表達(dá)差異，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出mrgprx2基因在不同個體外周血中發(fā)生差異表達(dá)(基因表達(dá)量高于平均水平或低于平均水平)的基因信號，即外周血中mrgprx2特征性基因(生物標(biāo)志物)的表達(dá)信號。采用絕對定量的方法，基于外周血mrgprx2特征基因建立患者用藥發(fā)生類過敏反應(yīng)風(fēng)險預(yù)測的模型。最后，采用熒光定量rt-pcr定量檢測受檢者外周血中基因標(biāo)志物的相對表達(dá)量，利用建立的患者用藥發(fā)生類過敏反應(yīng)風(fēng)險預(yù)測模型判別受檢者是否再用藥后會發(fā)生類過敏反應(yīng)及相應(yīng)的風(fēng)險概率，指導(dǎo)臨床用藥。
下面對本發(fā)明發(fā)現(xiàn)所述用于藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查的基因標(biāo)志物的具體過程進(jìn)行詳細(xì)說明。
一、特征基因標(biāo)志物在人群中表達(dá)量基線的確定。
具體包括以下步驟：
1)采用paxgenetmbloodrnatube采血管收集300例經(jīng)檢查確定為沒有疾病和妊娠反應(yīng)的20-80歲健康的受檢者外周血樣本，每個樣本采集1.5-2ml外周血。
2)采用trizol提取上述外周血樣本的總rna。
(1)每1ml外周血標(biāo)本中加入1ml的trizol；
(2)12000rpm/min離心10分鐘，取1ml上清至1.5mlep管中；
(3)加入0.2ml氯仿，加蓋好后用手劇烈搖晃15秒，室溫放置2-3分鐘，然后離心4℃，12000rpm/min，15min。離心后分成三層，下面的紅色為酚-氯仿相，一個中間層，上面是無色的水相。rna只存在于水相中。水相占總trizol的60％。
(4)將上層水相轉(zhuǎn)移到另一干凈的ep管中，加入0.5ml異丙醇，室溫靜置10min，然后離心4℃，12000rpm/min，10min。
(5)去上清，加入0.8ml體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇洗滌rna沉淀，離心4℃，10000rpm/min，1min，重復(fù)兩次。
(6)去上清，加入0.8ml無水乙醇洗滌rna沉淀，離心4℃，10000rpm/min，1min。
(7)去上清，置于真空或空氣中5-10分鐘，干燥rna沉淀。用無rnase水或0.5％sds溶液重懸rna沉淀，用槍頭反復(fù)吹打幾次，靜置10分鐘。
(8)測濃度：取5μl儲存液加入另一個ep管中，以無rnase水作為空白對照，測od260/280值。1od＝40μgrna。od260/280值在1.8-2.0視為純度很高。一般濃在1000ng/ml較準(zhǔn)。濃度太高要稀釋以后再測定。
(9)rna鑒定：甲醛變性瓊脂糖電泳，確定抽提rna完整性和dna污染情況。
3)用bio-tekepoch微孔板分光光度計檢測rna樣本的純度。所有rna樣本必須符合以下質(zhì)控條件：rna產(chǎn)率大于2微克，28s/18s峰的比值大于1，rin值大于7，260nm/280nm的吸光度比值大1.8。
4)利用takara公司的primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)試劑盒去除總rna中的基因組，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
5)利用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行實時熒光定量pcr檢測樣品循環(huán)數(shù)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對擴(kuò)增后的樣品進(jìn)行拷貝數(shù)檢測，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品的拷貝數(shù)。
其中熒光定量pcr條件如表1所示。
表1熒光定量pcr條件
其中，forward引物的序列為：5'-caggacattgctgaggtgga-3'；
reverse引物的序列為：5'-agttcagcaaatcagacagacagg-3'。
6)利用統(tǒng)計學(xué)方法，對300例樣品進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算95％置信區(qū)間以及正態(tài)分布情況。
二、特征基因標(biāo)志物在過敏人群中表達(dá)量的確定。
具體包括以下步驟：
1)收集20-30例在臨床上確定發(fā)生類過敏反應(yīng)患者的外周血樣本，每個樣本采集1.5-2ml外周血。
2)按照上述“一、特征基因標(biāo)志物在人群中表達(dá)量基線的確定”中的步驟，提取樣品總rna并檢測mrgprx2基因的拷貝數(shù)。
3)利用統(tǒng)計學(xué)的方法計算過敏人群基因拷貝數(shù)的95％置信區(qū)間以及正態(tài)分布情況。
4)利用統(tǒng)計學(xué)的方法，對比兩類人群中mrgprx2基因的拷貝數(shù)，找出拷貝數(shù)的差異性。
三、結(jié)果。
1、對常規(guī)人群及過敏病人人群采集血樣數(shù)目分析，結(jié)果如表2所示。
表2常規(guī)人群及過敏病人人群血樣數(shù)目分析
2、序列表
mrgprx2受體的特征基因序列如seq.id.no.1所示。
引物序列如下：
seq.id.no.2：forward引物：5'-caggacattgctgaggtgga-3'；
seq.id.no.3：reverse引物：5'-agttcagcaaatcagacagacagg-3'。
3、嗜堿性粒細(xì)胞mrgprx2受體表達(dá)檢測
提取全血中嗜堿性粒細(xì)胞總rna，利用rt-pcr的方法檢測mrgprx2基因表達(dá)量，結(jié)果如表3顯示，測得mrgprx2基因拷貝數(shù)約為(1.1±0.23)×104，說明mrgprx2受體在全血嗜堿性粒細(xì)胞上得到表達(dá)。
表3嗜堿性粒細(xì)胞基因拷貝數(shù)
此外，進(jìn)行了westernblot檢測以及全血免疫熒光檢測分析。結(jié)果如表4所示，從表4中westernblot結(jié)果可以看出，全血中的嗜堿性粒細(xì)胞能夠檢測到mrgprx2受體蛋白的表達(dá)。
表4全血中mrgprx2受體蛋白含量westernblot檢測
另外，免疫熒光結(jié)果顯示，利用特異性的抗體cd63能夠定位全血中嗜堿性粒細(xì)胞，進(jìn)一步利用mrgprx2受體特異性的抗體進(jìn)行標(biāo)記，明確了嗜堿性粒細(xì)胞中mrgprx2受體是確實存在的。
4、嗜堿性粒細(xì)胞功能性分析
利用血液中嗜堿性粒細(xì)胞ku812細(xì)胞株進(jìn)行鈣成像和組胺釋放的功能性實驗。結(jié)果顯示，mrgprx2受體特異性的激動劑，c48/80、環(huán)丙沙星、嗎啡以及阿曲庫銨均能激活兩種細(xì)胞的鈣動員，引起細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。同時，組胺釋放表明，4種激動劑均能引起ku812細(xì)胞釋放組胺，且釋放量與給藥劑量成正相關(guān)。
以上實驗結(jié)果證明，全血中的嗜堿性粒細(xì)胞與肥大細(xì)胞在功能上具有一定的相關(guān)性，兩種細(xì)胞具有一定的同源性。因此可以對全血中嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行檢測來反映肥大細(xì)胞的受體表達(dá)情況。簡單、方便、快捷的評價患者mrgprx2受體表達(dá)的差異，為臨床用藥的風(fēng)險性進(jìn)行評價。
本發(fā)明的提供的用于患者發(fā)生類過敏反應(yīng)風(fēng)險篩查的基因標(biāo)志物，能夠用于類過敏發(fā)生反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險篩查，并在制備篩查早期藥物類過敏反應(yīng)敏感人群的產(chǎn)品等方面得到應(yīng)用，具有敏感性高、特異性強等優(yōu)點，而且由于是以臨床上最易采集的外周血作為檢測樣本，檢測方便，適用于用藥患者及藥物類過敏反應(yīng)敏感人群的大規(guī)模人群篩查和早期診斷，應(yīng)用前景廣闊。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結(jié)構(gòu)變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。
核苷酸序列表
<110>西安交通大學(xué)
<120>一種用于藥物類過敏反應(yīng)敏感人群篩查的基因標(biāo)志物及其應(yīng)用
<160>3
<210>1
<211>6227
<212>dna
<213>mrgprx2
<400>1
gtttgccagtcccaggaaagcacttctcaactcaccaactccagtagaaagaagggtgtt60
aaggtaagagtttgttcaagaaccatcttctttcaaaggcagttttggtttttaccttag120
tccacatcctgatgaattcattaggaaaagaagacaggaagctcctttgaggaagctttg180
gatgctggcagcttagatgctgggagatccgaatggggtcaagcaggttcgtcccacttc240
tcttctatctaccaatattctccccttctcttcgaccattcaaatctgaaactatggaga300
gaaagattttgctgattttaatttaggggcaggctagaatgaagtcattacttccctaag360
ctaaattgttatttaaaacctcaggttgcactgattttcttgttattcaaaaggtttttc420
cttcatatctgtcattgtcccagcagaaaacacacatcacacactctaaaggggtagttt480
agaggagtttagtgaagagactgtttacaacggcgtgaacagggattaaggaatgatgaa540
gccctcaaaggcaagtgatagtggagggctgttaccgttgctaggtctgaagtgataagg600
agaaagagaagttctgagaactcagaatgtgctgtagcggtaactgtaactgtaactata660
gctgtggctacaggaaagggccaccaggcagggctatgtccttaggtagaaaaacactgc720
cactgccaactcacagcccttcagggcgcagggagagagccaggaaatttttaaaaaatc780
atcccccaatctactgtcaatgtgtccctttggctgaaaaaaaaagtcaccctccaatct840
cctgtcaatgtgtaccctttggagcctgagtgaaagacagcccattgacgaggcacagac900
atgtctcctcccaggatgcaaaggcaggtagagaaggatggacatgagatcctaatagca960
aataggaaagtccatttcttcccatagcctcttctcagtttgtctttcctgagactttct1020
ctattaatgtgattgaatcaatttctcattctatcacctcccttttttttaattgtttga1080
ccttcccatctagtgtcacttctttggactagtctctcactatcatcataaatgccttga1140
gaatggaatgtggttgggaaaaaaagggattgggagtacataggtactcccagctataag1200
tacacaggtatgtgtaatgtaagtttatgattttggcttctctaaaaagaaacctattat1260
agtgataatcaaaaagaatgtttactagacttgggctgataactctaagacatcaaacat1320
caaggctccttccaatttctatttccccatccctaaagcggtacccttaccctcatggtc1380
ctacatggctcccaaacacatcagcattccagccagagagaagagaaaaaaagaaagagt1440
acaggagtagctggttatatcactttctctcacctccccttgaccatcacatatggttac1500
atggtgccattagcataaagggaagctgagaaatgggcctttttctgatctaagactcag1560
aattattatgtgtgagaaaaggagaatggcttttggggcaacaagcagtctctatagccc1620
gattctcttttagcatctgtgctcacctggagatttttctcaacactgcctcacaaatag1680
tgaatgatgtagacatggaacagaaataaacctaggacagggccccaggagactggagct1740
ggtattggacctgcttttcaccatgtgattcaggaaactcttttgtacacgttaagcctg1800
tctttctttgttaaatgagcgtattacaatagatggcctccaagggatatgtgttggagg1860
ctggggatataatagtgaacaaccacaacaaaaatgttgagcttaatgagggaagtaaaa1920
gaaaaaacagacatacacttaaaaatacaggtgcagggccgggcacggtggctcacgcct1980
gtaatcctggcactttgggaggccgaggcgggcagatcacaaggtcagaagttcgagacc2040
atcctggctaacacagtgaaaccccgtctctactgaaaaaaaaaatacaaaaaattagcc2100
agtcgtggtggtgggcacctgtagtcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatggc2160
gtgagcccaggaggcggagcttgcagtgagccgagatcgagccactgcactccagcctgg2220
gtgacagagcgagactccatctcaaaaaaaaaaaaaaatacaggtgcaaactgtgttcag2280
tgccacgaataaaaaggccaacctgccctgagggaggacaacagaagtggttttcttcca2340
tatcctcacaaggccaaccagggctacaggaactaagacagcatgtgatggatgcattca2400
gtccttgatgccaattctgcacccccatggaggacacattcactttccccttggaggcct2460
ccaacccatgagagttttctgcagtgtggagtgattgacggctgtttttctgaagcaaga2520
aagagctcttgcattcagttgcttattctcagttggcttctattcatatctcttctcctt2580
atttgattaatctctcttccttactgtttcttaaagttgcttaatctaggcttaaaaaac2640
tgcaatttcgacattccattttggatttgatatgagcattacttgttgcttttctccttt2700
cttcatgtgtagttggtattgaacccttgcaatggggctgcaaggctggttaagaacaag2760
ccctctgacacagacctgtgggttcaaatgcaggctctaccacttgtttgtgagacctga2820
agcatattactcaatacatttgtgctttaatctccttctctgtaaaatgggactaataat2880
agtactgacctcaccaggctctgaagaagatttaaagaggctatacctgaagagcattca2940
gccagctgctattattcaccccattatgagtaagggctccttcccaagtgtaatttgcat3000
aagcatctgccttttcccctcaaagccctgcacagtgtagacatggttcttttttctaat3060
ttcccactcctttccccaaataatcctgttcacaaatgctttaatttgcaaagaaagctc3120
aaaatcatctgggggaagtaatgggtccaccttagatgtattcataccacaacaccctct3180
agttacctctagacactagacactctcaattgctgcctctctctccttttcccaaattgc3240
ccccttttcctccaagatgcagagaaattcagataaaccctgaatcctctccataaactg3300
gaagtttaaactcttttgggtgctgagcaaaagccatatactagcccttcctggattgaa3360
gatatgacagtggccattattcactatctgtgtaggcagaagcaatcccttcaaatacac3420
cagagctttcccagaaggaaacatgaagaatgatgttttcttcatttctttacatgtgtg3480
ttttttagtgactaatttcattttaaaatgttggtgttccacttagcccaaattttcaac3540
tactcttggctccccatgcatgcatgcatgcattcattcattcatttatatgtggtacaa3600
acttcttgaccctccactatgccctcacattgagctaggcactgaggacacagaaatgga3660
taagagaaaaactctttctgttttcataaagctgacccactgagcaatttctagtctgac3720
aggcctggctgtcctcagacctgtcctagcaagaagtcacctctccgttatgaccctaaa3780
tcacaatctccattctgactgttgatggactcctctcagtcattaagggtggccatgggt3840
catggcctgggtcatttcttctggcccctgagaggaaatctgtatgccaggataaaaaga3900
atcctgaactcagagtactgtctcttgctgccccacatattctgcctagacttttctctt3960
cctgcctccaggagacatgacacagtgacagtgagtgggggtgtttgggccttagaatat4020
tcccataccagcagaggatctaccttgtaatagaaagagcccaggatttagagtcagcaa4080
gaaatgagtttgaatccaggtgctaggactccctggcccttaataaatgacttaatctct4140
tcaagcctctgatttcctctcctgtaaaacaggggcggtaattaccacataacaggctgg4200
tcatgaaaatcagtgaacatgcagcaggtgctcaagtcttgtttttgtttccaggggcac4260
cagtggaggttttctgagcatggatccaaccaccccggcctggggaacagaaagtacaac4320
agtgaatggaaatgaccaagcccttcttctgctttgtggcaaggagaccctgatcccggt4380
cttcctgatccttttcattgccctggtcgggctggtaggaaacgggtttgtgctctggct4440
cctgggcttccgcatgcgcaggaacgccttctctgtctacgtcctcagcctggccggggc4500
cgacttcctcttcctctgcttccagattataaattgcctggtgtacctcagtaacttctt4560
ctgttccatctccatcaatttccctagcttcttcaccactgtgatgacctgtgcctacct4620
tgcaggcctgagcatgctgagcaccgtcagcaccgagcgctgcctgtccgtcctgtggcc4680
catctggtatcgctgccgccgccccagacacctgtcagcggtcgtgtgtgtcctgctctg4740
ggccctgtccctactgctgagcatcttggaagggaagttctgtggcttcttatttagtga4800
tggtgactctggttggtgtcagacatttgatttcatcactgcagcgtggctgattttttt4860
attcatggttctctgtgggtccagtctggccctgctggtcaggatcctctgtggctccag4920
gggtctgccactgaccaggctgtacctgaccatcctgctcacagtgctggtgttcctcct4980
ctgcggcctgccctttggcattcagtggttcctaatattatggatctggaaggattctga5040
tgtcttattttgtcatattcatccagtttcagttgtcctgtcatctcttaacagcagtgc5100
caaccccatcatttacttcttcgtgggctcttttaggaagcagtggcggctgcagcagcc5160
gatcctcaagctggctctccagagggctctgcaggacattgctgaggtggatcacagtga5220
aggatgcttccgtcagggcaccccggagatgtcgagaagcagtctggtgtagagatggac5280
agcctctacttccatcagatatatgtggctttgagaggcaactttgcccctgtctgtctg5340
atttgctgaactttctcagtcctgattttaaaacagttaagagagtccttgtgaggatta5400
agtgagacagtgcctatgaaacaaacactaagtgcagtgtctctggaactgccttactca5460
caggcttccaccacagccctatgagagctttgccaactctgcggtccatgactgttccca5520
cttttaatgaatcctacctttcgcagaaggctgaaagcagggcagaaaagatctacattt5580
ctttggacactgcacttgatagggactcaaagaatgttatatttttaattaatttctttt5640
tctcttccgtacaatttctgtctcaacaaaattagaagaattaaatttaaaactagctcc5700
aaaagagcagtcgtctttcattttggcagaccttagaatatccccctagcttaataaatc5760
tttgttgaatggcttaatgaatgaataaactggttaatgtttaagttaaacctctgaaaa5820
gtctccatttaccagatttgagtcactaaatttattgctttcactacttttgaattttgc5880
aaacatgaaattaagttttataattagataaatcaatgtcaacacatatttaaagtttga5940
ggtacactgtcttcctgtggtttcctttcacatgccatcccttaaaatcccagctacacg6000
ccttcccattccttcccctttgcctttgttctaatcttccctctctgggggctctctaat6060
tcgtcctggaagtttccagtggtcttatagactccatgttcttggaggacaggctgtatg6120
tcagatttaccttttattccgaagaactcggagcatttattttgttaattaaattgcaca6180
tatttttaaaagttacgtgttccacagaataaaatactaattgtaaa6227
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>forward引物
<400>2
caggacattgctgaggtgga20
<210>3
<211>24
<212>dna
<213>reverse引物
<400>3
agttcagcaaatcagacagacagg24