本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及asprv1作為生物標(biāo)志物在喉鱗癌診療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科最常見的惡性腫瘤之一，占全身癌癥的5.7％-7.6％。喉癌中96％～98％為鱗狀細(xì)胞癌，其他病理類型的癌如：腺癌，肉瘤較少見。喉癌好發(fā)于四十到六十歲，男性病人居多。近年來經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展，生活環(huán)境的惡化，人民生活方式的改變，喉癌的發(fā)病率在逐步上升。手術(shù)切除腫瘤是喉癌的首選治療，加上放射治療、化療及基因靶向治療等的配合，喉癌病人的5年生存率及喉功能的恢復(fù)有了較大的提高，但是晚期喉癌的患者治療效果不理想，一旦伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其5年存活率為50％，腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年生存率僅為20％左右。近幾十年里，喉癌的診療理念發(fā)生了很大的變化，診療方案的選擇取決于疾病所處的階段。目前喉癌的發(fā)病原因考慮與不良的生活習(xí)慣(吸煙、飲酒)，成人型喉乳頭狀瘤病毒，長(zhǎng)期接觸放射線，某些微量元素的缺乏等有關(guān)，其病因仍不明確。因此，如何從分子水平闡明喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋求理想的分子標(biāo)志物對(duì)喉癌病人進(jìn)行早期診斷，對(duì)其治療的預(yù)后效果非常重要。

隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量技術(shù)的出現(xiàn)為疾病發(fā)病機(jī)理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，采用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析，尋找與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要基因，并結(jié)合定向的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，為實(shí)現(xiàn)疾病精準(zhǔn)化治療提供了新途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種與喉鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物，通過檢測(cè)樣本中生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，可以判斷患者是否患有喉鱗癌或者患喉鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)的大小，通過靶向于生物標(biāo)志物，改變生物標(biāo)志物的表達(dá)水平或活性，可以實(shí)現(xiàn)喉鱗癌患者的精準(zhǔn)靶向治療。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測(cè)asprv1的試劑在制備診斷喉鱗癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述檢測(cè)asprv1的試劑包括：通過測(cè)序技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)或免疫測(cè)定的方法檢測(cè)樣本中asprv1基因的表達(dá)水平用試劑。

進(jìn)一步，所述試劑選自：

特異性識(shí)別asprv1基因的探針；或

特異性擴(kuò)增asprv1基因的引物；或

特異性結(jié)合asprv1編碼的蛋白的抗體或配體。

進(jìn)一步，所述試劑至少包括一對(duì)特異性擴(kuò)增asprv1的引物，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述特異性擴(kuò)增asprv1基因的引物序列如seqidno.3～4所示。

本發(fā)明中，可以采用任何方法檢測(cè)asprv1的表達(dá)水平。

本發(fā)明提供了一種診斷喉鱗癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括檢測(cè)樣品中asprv1表達(dá)水平的制劑、芯片或試劑盒，其中芯片包括基因芯片、蛋白芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)asprv1基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)asprv1基因的寡核苷酸探針；所述蛋白芯片包括固相載體以及固定在固相載體的針對(duì)asprv1蛋白的特異性抗體；試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒、蛋白檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明所述的產(chǎn)品可用于檢測(cè)包括asprv1在內(nèi)的多個(gè)基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平(與喉鱗癌相關(guān)的多個(gè)基因或其表達(dá)產(chǎn)物)，將喉鱗癌的多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可大大提高喉鱗癌診斷的準(zhǔn)確率。

本發(fā)明提供了asprv1在篩選預(yù)防或治療喉鱗癌的候選化合物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述篩選候選化合物的步驟如下：

測(cè)試組中，在培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察所述測(cè)試組的細(xì)胞中asprv1的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，在相同的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組的所述細(xì)胞中asprv1的表達(dá)量和/或活性；

其中，如果測(cè)試組中細(xì)胞的asprv1的表達(dá)量和/或活性低于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)asprv1的表達(dá)和/或活性有抑制作用的治療癌癥的候選化合物。

在本發(fā)明中，所述的步驟還包括：對(duì)獲得的候選化合物進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選化合物中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于預(yù)防、緩解或治療喉鱗癌有用的物質(zhì)。

在本發(fā)明中，篩選預(yù)防或治療喉鱗癌的候選化合物的體系不限于細(xì)胞體系，還包括細(xì)胞體系、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體系等，所述體系不局限于上述形式，只要所述體系可以檢測(cè)測(cè)試化合物可以降低asprv1的表達(dá)和/活性即可。

所述候選化合物包括但不限于：針對(duì)asprv1基因或其編碼的蛋白或其上游或下游基因或蛋白設(shè)計(jì)的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子(如抗體或配體)、小分子化合物等。

本發(fā)明提供了asprv1功能性表達(dá)的抑制劑在制備預(yù)防或治療喉鱗癌的藥物組合物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述asprv1功能性表達(dá)的抑制劑選自：核酸抑制物，蛋白抑制劑，蛋白水解酶，蛋白結(jié)合分子，優(yōu)選的所述抑制劑為核酸抑制物sirna。

在本發(fā)明中，所述asprv1的抑制劑還可用于抑制喉鱗癌細(xì)胞的侵襲和增殖。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述sirna的序列如seqidno.11～12所示。

本發(fā)明提供了一種治療喉鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括asprv1功能性表達(dá)的抑制劑。

所述抑制劑選自：以asprv1或其轉(zhuǎn)錄本為靶序列、且能夠抑制asprv1基因表達(dá)或基因轉(zhuǎn)錄的干擾分子，包括：shrna(小發(fā)夾rna)、小干擾rna(sirna)、dsrna、微小rna、反義核酸，或能表達(dá)或形成所述shrna、小干擾rna、dsrna、微小rna、反義核酸的構(gòu)建物；或特異性與asprv1編碼的蛋白結(jié)合的結(jié)合分子(如能夠抑制asprv1蛋白活性的抗體或配體)。

進(jìn)一步，所述藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括(但不限于)稀釋劑、賦形劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、致濕劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑、螯合劑、ph控制劑。

附圖說明

圖1是利用qpcr檢測(cè)asprv1基因在喉鱗癌組織中的表達(dá)情況圖；

圖2是利用westernblot檢測(cè)asprv1蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)情況圖；

圖3是利用qpcr檢測(cè)sirna轉(zhuǎn)染對(duì)喉鱗癌細(xì)胞中asprv1基因表達(dá)的影響圖；

圖4是利用westernblot檢測(cè)sirna轉(zhuǎn)染對(duì)喉鱗癌細(xì)胞中asprv1蛋白表達(dá)的影響圖；

圖5是用mtt法檢測(cè)asprv1基因?qū)眵[癌細(xì)胞增殖的影響圖；

圖6是用流式細(xì)胞儀檢測(cè)asprv1基因?qū)眵[癌細(xì)胞凋亡的影響圖；

圖7是利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)asprv1對(duì)喉鱗癌細(xì)胞遷移的影響圖；

圖8是利用transwell小室檢測(cè)asprv1對(duì)喉鱗癌細(xì)胞侵襲的影像圖。

具體的實(shí)施方式

本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過高通量測(cè)序方法，檢測(cè)喉鱗癌標(biāo)本中基因在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中具有明顯表達(dá)差異的基因，探討其與喉鱗癌的發(fā)生之間的關(guān)系，從而為喉鱗癌的早期檢測(cè)及靶向治療尋找更好的途徑和方法。通過篩選，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了喉鱗癌中asprv1顯著性上調(diào)。實(shí)驗(yàn)證明，通過降低asprv1的表達(dá)水平，能夠有效地抑制喉鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，提示檢測(cè)asprv1基因的表達(dá)水平可成為喉鱗癌早期診斷的輔助診斷指標(biāo)之一，干擾asprv1基因表達(dá)可成為預(yù)防或治療喉鱗癌或喉鱗癌轉(zhuǎn)移的新途徑。

標(biāo)志物

標(biāo)志物(單獨(dú)使用或與其他定性術(shù)語組合例如喉鱗癌標(biāo)志物、喉鱗癌特異性標(biāo)志物、對(duì)照標(biāo)志物、外源標(biāo)志物、內(nèi)源標(biāo)志物)指可測(cè)量、可計(jì)算或可以其他方式獲得的，與任何分子或分子組合相關(guān)，可用作生物和/或化學(xué)狀態(tài)的指示物的參數(shù)。在本發(fā)明中，“標(biāo)志物”指與一個(gè)或多個(gè)生物分子相關(guān)的參數(shù)(即“生物標(biāo)志物”)例如天然或人工合成產(chǎn)生的核酸(即個(gè)體基因，以及編碼和非編碼dna和rna)和蛋白(例如肽、多肽)。本發(fā)明中的“標(biāo)志物”還包括指可通過考慮來自兩個(gè)或多個(gè)不同標(biāo)志物的表達(dá)數(shù)據(jù)計(jì)算或以其他方式獲得的單個(gè)參數(shù)。

喉鱗癌標(biāo)志物指可以用作(單獨(dú)或與其他標(biāo)志物組合)受試者中喉鱗癌指示物的特定類型的標(biāo)志物，在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，喉鱗癌標(biāo)志物可用于提供(單獨(dú)或與其他標(biāo)志物組合)受試者中喉鱗癌臨床評(píng)估的標(biāo)志物。

asprv1基因

asprv1是位于人2號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶上，本發(fā)明中的asprv1包括野生型、突變型或其片段。一種代表性的asprv1基因seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列和氨基酸序列。本發(fā)明的人asprv1核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂胮cr擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。

檢測(cè)技術(shù)(方法))

本發(fā)明的基因使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，這些技術(shù)包括但不限于：核酸測(cè)序、核酸雜交、核酸擴(kuò)增技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)。

核酸測(cè)序技術(shù)的示例性非限制性實(shí)例包括但不限于鏈終止子(sanger)測(cè)序和染料終止子測(cè)序。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，由于rna在細(xì)胞中不太穩(wěn)定并且在實(shí)驗(yàn)中更易受到核酸酶攻擊，因此在測(cè)序前通常將rna逆轉(zhuǎn)錄成dna。

核酸測(cè)序技術(shù)的另一示例性非限制性實(shí)例包括下一代測(cè)序(深度測(cè)序/高通量測(cè)序)，高通量測(cè)序技術(shù)是一種基于單分子簇的邊合成邊測(cè)序技術(shù)，基于專有的可逆終止化學(xué)反應(yīng)原理。測(cè)序時(shí)將基因組的dna的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面，這些dna片段經(jīng)過延伸和橋式擴(kuò)增后，在玻璃表面形成數(shù)以億計(jì)的簇，每個(gè)簇是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇，然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性的邊合成邊測(cè)序技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板dna進(jìn)行測(cè)序。

核酸雜交技術(shù)的示例性非限制性實(shí)例包括但不限于原位雜交(ish)、微陣列和southern或northern印跡。原位雜交(ish)是一種使用標(biāo)記的互補(bǔ)dna或rna鏈作為探針以定位組織一部分或切片(原位)或者如果組織足夠小則為整個(gè)組織(全組織包埋ish)中的特異性dna或rna序列的雜交。dnaish可用于確定染色體的結(jié)構(gòu)。rnaish用于測(cè)量和定位組織切片或全組織包埋內(nèi)的mrna和其他轉(zhuǎn)錄本(例如，ncrna)。通常對(duì)樣本細(xì)胞和組織進(jìn)行處理以原位固定靶轉(zhuǎn)錄本，并增加探針的進(jìn)入。探針在高溫下與靶序列雜交，然后將多余的探針洗掉。分別使用放射自顯影、熒光顯微術(shù)或免疫組織化學(xué)，對(duì)組織中用放射、熒光或抗原標(biāo)記的堿基標(biāo)記的探針進(jìn)行定位和定量。ish也可使用兩種或更多種通過放射性或其他非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針，以同時(shí)檢測(cè)兩種或更多種轉(zhuǎn)錄本。

本發(fā)明可在檢測(cè)前或與檢測(cè)同時(shí)地對(duì)核酸(例如，ncrna)進(jìn)行擴(kuò)增。核酸擴(kuò)增技術(shù)的示例性非限制性實(shí)例包括但不限于：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)、鏈置換擴(kuò)增(sda)和基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，某些擴(kuò)增技術(shù)(例如，pcr)需要在擴(kuò)增前將rna逆轉(zhuǎn)錄成dna(例如，rt-pcr)，而其他擴(kuò)增技術(shù)則直接擴(kuò)增rna(例如，tma和nasba)。

通常稱為pcr的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用變性、引物對(duì)與相反鏈的退火以及引物延伸的多個(gè)循環(huán)，以指數(shù)方式增加靶核酸序列的拷貝數(shù)；tma的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(在基本上恒定的溫度、離子強(qiáng)度和ph的條件下自身催化地合成靶核酸序列的多個(gè)拷貝，其中靶序列的多個(gè)rna拷貝自身催化地生成另外的拷貝；lcr的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用與靶核酸的相鄰區(qū)域雜交的兩組互補(bǔ)dna寡核苷酸；其他擴(kuò)增方法包括例如：通常稱為nasba的基于核酸序列的擴(kuò)增；使用rna復(fù)制酶(通常稱為qβ復(fù)制酶)擴(kuò)增探針分子本身的擴(kuò)增；基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增方法；以及自我維持的序列擴(kuò)增。

本發(fā)明中非擴(kuò)增或擴(kuò)增的核酸可通過任何常規(guī)的手段檢測(cè)。

芯片、試劑盒

在本發(fā)明中，“芯片”、“微陣列”、“陣列”可以等同替代，包括但不限于：dna微陣列(例如，cdna微陣列和寡核苷酸微陣列)、蛋白質(zhì)微陣列、組織微陣列、轉(zhuǎn)染或細(xì)胞微陣列、化學(xué)化合物微陣列和抗體微陣列。通常稱為基因芯片、dna芯片或生物芯片的dna微陣列是微觀dna點(diǎn)的集合，這些點(diǎn)連接到固體表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)上，形成用于對(duì)數(shù)千種基因同時(shí)進(jìn)行表達(dá)譜分析或表達(dá)水平監(jiān)測(cè)的陣列。固定的dna片段稱為探針，其數(shù)千個(gè)可用于單個(gè)dna微陣列中。微陣列可用于通過比較疾病和正常細(xì)胞中的基因表達(dá)而識(shí)別疾病基因或轉(zhuǎn)錄本(例如，ncrna)。微陣列可使用多種技術(shù)加以制造，包括但不限于：用細(xì)尖針印刷到載玻片上、使用預(yù)制的掩模進(jìn)行光刻、使用動(dòng)態(tài)微鏡器件進(jìn)行光刻、噴墨印刷或微電極陣列上的電化學(xué)方法。

本發(fā)明中的試劑盒可用于檢測(cè)asprv1的表達(dá)，優(yōu)選的，所述的試劑盒包括檢測(cè)有效量的檢測(cè)asprv1基因的試劑，選自下組的一種或多種物質(zhì)：容器、使用說明書、陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、緩沖劑、助劑或溶劑。例如用于混懸或固定細(xì)胞的溶液，可檢測(cè)的標(biāo)簽或標(biāo)記，使核酸易于雜交的溶液，用于裂解細(xì)胞的溶液，或用于核酸純化的溶液。

本發(fā)明的試劑盒中還可附有試劑盒的使用說明書，其中記載了如何采用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，和如何利用檢測(cè)結(jié)果對(duì)腫瘤發(fā)展進(jìn)行判斷、對(duì)治療方案進(jìn)行選擇。

采用本發(fā)明的試劑盒，可通過選自下組的各種方法(包括但不限于)檢測(cè)asprv1：實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄pcr、生物芯片檢測(cè)法、dna印跡法、或rna印跡法或原位雜交法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際條件和需要對(duì)檢測(cè)方式進(jìn)行調(diào)整和改變。

抑制劑和藥物組合物

基于發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種asprv1的抑制劑的用途，用于制備抑制喉鱗癌的藥物組合物。如本文所用，所述的asprv1的抑制劑包括但不限于抑制劑、拮抗劑、阻滯劑、阻斷劑、核酸抑制物等。

所述的asprv1基因或蛋白的抑制劑是指任何可降低asprv1蛋白的活性、降低asprv1基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)asprv1蛋白的表達(dá)、減少asprv1蛋白有效作用時(shí)間、或抑制asprv1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對(duì)于下調(diào)asprv1有用的物質(zhì)，從而可用于預(yù)防或治療喉鱗癌。例如，所述的抑制劑是：核酸抑制物，蛋白抑制劑，抗體，配體，蛋白水解酶，蛋白結(jié)合分子，只要其能夠在蛋白或基因水平上下調(diào)asprv1蛋白或其編碼基因的表達(dá)。

作為本發(fā)明的一種選擇方式，所述的asprv1的抑制劑是一種特異性與asprv1結(jié)合的抗體。所述特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體；本發(fā)明不僅包括完整的抗體分子，也包括抗體的任何片段或修飾，例如，嵌合抗體、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能夠保留與asprv1蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述asprv1的抑制劑是一種asprv1特異性的小干擾rna分子。如本文所用，所述的“小干擾rna”是指一種短片段雙鏈rna分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mrna為靶目標(biāo)降解特定的mrna，這個(gè)過程就是rna干擾(rnainterference)過程。小干擾rna可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個(gè)正義鏈和一個(gè)反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個(gè)雙鏈rna復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔瘜W(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈rna復(fù)合物。

在篩選有效的sirna序列時(shí)，本發(fā)明人通過大量的比對(duì)分析，從而找出最佳的有效片段。本發(fā)明人設(shè)計(jì)合成了多種sirna序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染喉鱗癌細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證，選出干擾效果最佳的sirna，它們分別具有seqidno.11、seqidno.12所示的序列，進(jìn)一步地在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明對(duì)于細(xì)胞試驗(yàn)而言抑制效率非常高。

本發(fā)明的核酸抑制物如sirna可以化學(xué)合成，也可以通過一個(gè)重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄成單鏈rna之后進(jìn)行制備。sirna等核酸抑制物，可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。

作為本發(fā)明的一種可選方式，所述的asprv1的抑制劑也可以是一種“小發(fā)夾rna(smallhairpinrna，shrna)”，其是能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小rna分子，小發(fā)夾rna能夠通過rna干擾途徑來抑制基因的表達(dá)。如上述，shrna可以由雙鏈dna模板來表達(dá)。雙鏈dna模板被插進(jìn)一個(gè)載體，例如質(zhì)粒或病毒載體，然后在體外或體內(nèi)連接到一個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)。shrna在真核細(xì)胞內(nèi)dicer酶的作用下，可被切割成小干擾rna分子，從而進(jìn)入rnai途徑?！皊hrna表達(dá)載體”是指一些本領(lǐng)域常規(guī)用于構(gòu)建shrna結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，通常該質(zhì)粒上存在“間隔序列”以及位于“間隔序列”兩邊的多克隆位點(diǎn)或供替換序列，從而人們可以將shrna(或類似物)相應(yīng)的dna序列通過正向和反向的方式插入多克隆位點(diǎn)或替換其上的供替換序列，該dna序列轉(zhuǎn)錄后的rna可形成shrna(shorthairpin)結(jié)構(gòu)。所述的“shrna表達(dá)載體”目前已經(jīng)完全可以通過商購(gòu)的途徑購(gòu)買獲得，例如一些病毒載體。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量的所述的asprv1的抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可用于抑制喉鱗癌。任何前述的asprv1的抑制劑均可用于組合物的制備。所述載體包括(但不限于)稀釋劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、致濕劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌劑、等滲劑、螯合劑、ph控制劑。

其中，稀釋劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；賦形劑如乳糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合劑如單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；崩解劑如干淀粉、海藻酸鈉、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑季銨化合物、十二烷基硫酸鈉等；表面活性劑如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、十六烷醇等；致濕劑如甘油、淀粉等；吸附載體如淀粉、乳糖、斑脫土、硅膠、高嶺土和皂粘土等；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇、硼酸粉末等；緩沖劑可以包括硼酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、谷氨酸及相應(yīng)的鹽(它們的堿金屬或堿性稀土金屬鹽，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽)；穩(wěn)定劑包括人類血清蛋白、l-氨基酸、糖及纖維素衍生物；抑菌劑包括但不限于有效濃度(例如<1％w/v)的芐醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和/或?qū)αu基苯甲酸丙酯；等滲劑包括氯化鉀、氯化鈉、糖及甘油；螯合劑包括乙二胺四乙酸鈉及檸檬酸；

如本文所用，所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于：所述的asprv1基因的抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。

本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。

本發(fā)明的藥物組合物還可以與其他治療喉鱗癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時(shí)給藥，甚至在同一組合物中同時(shí)給藥。還可以以單獨(dú)的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨(dú)給予其它治療性化合物。

優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進(jìn)行。比如，可直接將asprv1的抑制劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶asprv1的抑制劑的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等，或sirna或shrna)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá)活性的asprv1抑制劑，具體情況需視所述的抑制劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。

本發(fā)明中，術(shù)語“樣本”以其最廣泛的含義使用。意欲包括任何源自活或死亡的人的組織或材料，其可包括本發(fā)明的標(biāo)志物。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，樣品可以是腫瘤或肺腫瘤組織，并且可包括例如含有來自其的與喉組織相關(guān)的細(xì)胞或標(biāo)志物的任何組織或材料。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選與喉鱗癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集6例喉鱗癌組織及對(duì)應(yīng)的正常黏膜組織樣本，組織樣本的取得獲得患者的知情同意，并且取得均通過組織倫理委員會(huì)的同意。

2、rna樣品的制備

1)加入液氮研磨組織至粉末，加入1mltrizol(invitrogen)溶液，吹打混勻，使組織充分裂解，靜置5min；

2)12000rpm4℃離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mlrnasefreeep管中；

3)加入200μl氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置15min；

4)4℃環(huán)境中12000g離15min，溶液離心為三層，rna在上層水相，移至另一個(gè)新的rnasefreeep管；

5)加入0.5ml異丙醇，輕柔充分混勻，室溫靜置10min；

6)4℃下，12000g離心10min，加入與rnaisoplus等體積的75％乙醇沉淀rna，7500g4℃離心5min，去上清；

7)用75％乙醇洗滌兩次，超凈臺(tái)風(fēng)干；加入30μldepc水溶解沉淀。

8)rna樣品的質(zhì)量分析

利用nanodrop2000對(duì)所提取的rna濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)rna完整性，agilent2100測(cè)定rin值。濃度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之間。

3、去除rrna

使用ribo-zero試劑盒除去總rna中的核糖體rna。

4、構(gòu)建cdna文庫(kù)

利用利用illumina的truseqrnasampleprepkit進(jìn)行cdna文庫(kù)的構(gòu)建，具體操作按說明書進(jìn)行。

5、上機(jī)測(cè)序

使用hiseq4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)cdna文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，具體操作按說明書進(jìn)行。

6、高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用tophatv1.3.1進(jìn)行rna-seq讀段定位，通過cufflinksv1.0.3將rna-seq片段數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)豐度，利用cuffdiff檢測(cè)差異表達(dá)，當(dāng)p值<0.001，|log2(fold_change)normalized|>2時(shí)，認(rèn)為mrna顯著差異表達(dá)。

7、結(jié)果

rna-seq結(jié)果顯示，在喉鱗癌患者中差異表達(dá)的基因有665個(gè)，上調(diào)的450個(gè)，下調(diào)的215個(gè)，其中基因asprv1在喉鱗癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常癌旁黏膜組織中的表達(dá)量。

實(shí)施例2qpcr測(cè)序驗(yàn)證asprv1基因的差異表達(dá)

1、對(duì)asprv1基因差異表達(dá)進(jìn)行大樣本qpcr驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣本收集方式選擇喉鱗癌患者正常癌旁粘膜組織和喉鱗癌組織各50例。

2、rna提取具體步驟如實(shí)施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄

3、逆轉(zhuǎn)錄：采用fastquantcdna第一鏈合成試劑盒(貨號(hào)：kr106)進(jìn)行mrna反轉(zhuǎn)錄。具體步驟如下：

(1)加入5×gdnabuffer2.0μl，總rna1μg，加rnasefreeddh2o使總體積至10μl，水浴鍋中42℃加熱3min；

(2)構(gòu)建20μl反應(yīng)體系，10×fastrtbuffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl混合后加入(1)中的混合液中混勻；

(3)水浴鍋中42℃加熱15min，95℃加熱3min，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

4、qpcr擴(kuò)增

(1)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)genebank中asprv1基因和管家基因gapdh基因的編碼序列設(shè)計(jì)qpcr擴(kuò)增引物，由博邁德公司合成。

asprv1基因的引物序列：

正向引物序列為5’-aaccattgggaccatatc-3’(seqidno.3)；

反向引物序列為5’-actgagcctattgtagac-3’(seqidno.4)。

gapdh基因的引物序列：

正向引物序列為5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’(seqidno.5)；

反向引物序列為5’-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’(seqidno.6)。

(2)pcr反應(yīng)體系：正向引物和反向引物各0.6μl，2×superrealpremixplus10μl，dna模板2μl，ddh2o7.4μl，50×roxreferencedye^△2μl，滅菌蒸餾水4.8μl。

(3)pcr反應(yīng)條件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40個(gè)循環(huán)，95℃15s，60℃60s，95℃15s。在abi7300型熒光定量pcr儀上進(jìn)行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進(jìn)行相對(duì)定量。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，癌與癌旁組織的配對(duì)比較采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與喉鱗癌正常癌旁粘膜組織相比，asprv1在喉鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，同高通量測(cè)序結(jié)果一致。

實(shí)施例3蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)asprv1蛋白的差異表達(dá)

1、組織總蛋白的提取

用剪刀剪碎組織后將其放入置于冰內(nèi)的玻璃勻漿器內(nèi)，ripa裂解液和pmsf以100:1的比例混勻，按照每20mg組織標(biāo)本加入100μl裂解液的比例加入相應(yīng)量的ripa裂解液，玻璃勻漿器碾碎組織直至其充分裂解，將裂解后的液體吸至ep管中，4℃下14000rpm離心5min，收集上清。

2、總蛋白濃度測(cè)定

按照bca蛋白濃度測(cè)定試劑盒的說明書進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。

3、sds-page電泳

按照sds-page凝膠配制試劑盒的說明書配制8％的分離膠和5％的濃縮膠并進(jìn)行電泳。

4、western檢測(cè)

1)電轉(zhuǎn)移

將pvdf膜放入甲醇溶液中激活5min，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡20min。取出page膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，切下相應(yīng)的page膠，按照由下到上依次為濾紙、pvdf膜、page膠、濾紙的順序放到半干的轉(zhuǎn)膜儀中，恒壓25v轉(zhuǎn)膜1.5h；

2)免疫雜交

取出pvdf膜，pbs沖洗后置于5％bsa溶液中室溫下?lián)u動(dòng)封閉2h，將pvdf膜放入雜交袋中，加入一抗過夜，用tbst緩沖液洗滌pvdf膜，再加入相應(yīng)的二抗，室溫下孵育2h，tbst緩沖液洗滌。

3)dab顯色

pvdf膜稍干后滴加新鮮配制的dab顯色液，pvdf膜顯色后掃描記錄。以β-actin作為內(nèi)參照，采用quantityone凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行半定量灰度分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均灰度值；

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示的，采用繁多樣本均數(shù)的方差檢驗(yàn)(anova)進(jìn)行分析，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，asprv1蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常癌旁粘膜組織。

實(shí)施例4asprv1基因的沉默

1、細(xì)胞培養(yǎng)

人喉鱗癌細(xì)胞株hep2，以含10％胎牛血清和1％p/s的rpmi1640培養(yǎng)基在37℃、5％co2、相對(duì)濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈單層貼壁生長(zhǎng)。使用0.25％含edta的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、轉(zhuǎn)染

1)轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的處理

轉(zhuǎn)染前一天，6孔培養(yǎng)板上種3～5×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔，在無抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng)一天，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為30～50％，于轉(zhuǎn)染前換成無血清培養(yǎng)基。

2)sirna的設(shè)計(jì)

陰性對(duì)照sirna序列(sirna-nc)：

正義鏈為5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.7)

反義鏈為5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.8)

sirna1：

正義鏈為5’-ucauugaugacuucaaagcug-3’(seqidno.9)

反義鏈為5’-gcuuugaagucaucaaugacc-3’(seqidno.10)

sirna2：

正義鏈為5’-acucuuucaggaaccuuagcu-3’(seqidno.11)

反義鏈為5’-cuaagguuccugaaagagucc-3’(seqidno.12)

sirna3：

正義鏈為5’-cuaagguuccugaaagagucc-3’(seqidno.13)

反義鏈為5’-ccugaaagggaagaaguuucg-3’(seqidno.14)

將實(shí)驗(yàn)分為三組：對(duì)照組(hep2)、陰性對(duì)照組(sirna-nc)和實(shí)驗(yàn)組(sirna1、sirna2、sirna3)，其中陰性對(duì)照組sirna與asprv1基因的序列無同源性。

3)轉(zhuǎn)染

a.取濃度為50pmol的sirna3μl加入47μl的無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育5min；

b.取1μllipofectamine2000加入49μl無血清培養(yǎng)基。輕輕混勻，室溫孵育5min；

c.將上述兩種混合物混合(總體積100μl)，輕輕混勻，室溫下孵育25min，以使復(fù)合體形成；

d.在6孔板中每孔加入100μl的復(fù)合物及適量培養(yǎng)基，輕輕混勻；

e.孵育48～96h后觀察基因的沉默效應(yīng)。

5、qpcr檢測(cè)asprv1基因的轉(zhuǎn)錄水平

5.1細(xì)胞總rna的提取

采用qiagen的細(xì)胞rna提取試劑盒對(duì)細(xì)胞中的rna進(jìn)行提取，實(shí)驗(yàn)操作按照說明書進(jìn)行。

5.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實(shí)施例2。

5.3qpcr擴(kuò)增步驟同實(shí)施例2。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，asprv1基因?qū)嶒?yàn)組與對(duì)照組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、結(jié)果

結(jié)果如圖3顯示，與非轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染sirna-nc組相比，實(shí)驗(yàn)組sirna2表達(dá)水平降低最為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例5westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染sirna對(duì)asprv1蛋白表達(dá)的影響

1、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

步驟同實(shí)施例4

2、細(xì)胞總蛋白的提取

收集處于對(duì)數(shù)期的不同處理組的細(xì)胞，用預(yù)冷的pbs洗滌細(xì)胞。將ripa細(xì)胞裂解液和pmsf以100:1的比例混勻，向細(xì)胞中加入上述裂解液150μl，冰上放置30min，使用細(xì)胞刮刀將裂解的細(xì)胞刮下來，使用移液器將裂解后的液體吸至ep管中，4℃下14000rpm離心5min。小心收集離心后的上清。

3、總蛋白濃度測(cè)定

按照bca蛋白濃度測(cè)定試劑盒的說明書進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。

4、sds-page電泳

按照sds-page凝膠配制試劑盒的說明書配制8％的分離膠和5％的濃縮膠并進(jìn)行電泳。

5、western檢測(cè)

步驟詳見實(shí)施例3。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示的，采用繁多樣本均數(shù)的方差檢驗(yàn)(anova)進(jìn)行分析，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染sirna2組的細(xì)胞中的asprv1蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。

實(shí)施例6asprv1基因?qū)眵[癌細(xì)胞增殖的影響

采用mtt實(shí)驗(yàn)檢測(cè)asprv1基因?qū)眵[癌細(xì)胞增殖能力影響。

1、取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞，常規(guī)消化成單細(xì)胞懸液后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋成合適濃度的細(xì)胞懸液；

2、于96孔培養(yǎng)板中，將稀釋后的不同處理組細(xì)胞每孔接種2000細(xì)胞，至少設(shè)3個(gè)平行孔，37℃、5％co2培養(yǎng)24h；

3、于接種后1、2、3、4、5天每天取出3孔細(xì)胞以mtt法檢測(cè)其490nm的od值，進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值；

4、檢測(cè)前棄去上清液，培養(yǎng)液洗3次，每孔加入mtt無血清培養(yǎng)基溶液(0.2mg/ml)100μl，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h；

5、終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150μldmso，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上用波長(zhǎng)為490nm測(cè)定光密度(od)值，以時(shí)間為橫軸，光密度值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，與對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染sirna2后，細(xì)胞的增殖明顯受到了抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)說明asprv1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

實(shí)施例7asprv1基因?qū)眵[癌細(xì)胞凋亡的影響

使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)asprv1基因?qū)?xì)胞凋亡的影響。

1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例3。

2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。

3、步驟

1)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同處理組的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后吹打成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。取10⁶量的細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min；

2)棄上清，加入195μlannexinv-fitc結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；

3)加入5μl的annexinv-fitc，輕柔混勻，室溫下避光孵育10min；

4)1000rpm離心5min，棄上清，加入190μl的annexinv-fitc結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞；

5)加入10μl碘化丙啶(pi)染色液，輕柔混勻，冰浴避光放置，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示的，采用繁多樣本均數(shù)的方差檢驗(yàn)(anova)進(jìn)行分析，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5、結(jié)果：

結(jié)果如圖6所示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞的凋亡率無明顯變化(p<0.05)。

實(shí)施例8細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

1、向6孔板中每孔加入1ml50μg/ml的纖連蛋白，并置于4℃冰箱中過夜；

2、棄去剩余的纖連蛋白溶液，用無血清培養(yǎng)基清洗，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同處理組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化重懸后，接種于鋪有纖連蛋白的6孔板中，每組細(xì)胞設(shè)2個(gè)復(fù)孔，每孔5×10⁵個(gè)細(xì)胞；

3、置入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；

4、待細(xì)胞長(zhǎng)至約90％融合時(shí)，用10μl的tip頭劃出一條無細(xì)胞的細(xì)痕，pbs溶液洗去脫落的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

5、分別于劃痕后0h、48h觀察細(xì)胞劃痕處的愈合情況并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示的，采用繁多樣本均數(shù)的方差檢驗(yàn)(anova)進(jìn)行分析，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、結(jié)果

結(jié)果如圖7所示，轉(zhuǎn)染sirna2組的細(xì)胞相比對(duì)照組而言，細(xì)胞體外劃痕后的遷移距離明顯降低，而對(duì)照組之間無顯著差異，說明asprv1過表達(dá)可以促進(jìn)喉癌細(xì)胞的遷移。

實(shí)施例9細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

1、transwell小室制備

將50mg/l的matrigel膠用4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基以1:8的比例稀釋、混勻，包被transwell小室的底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。取60μl～80μl稀釋的matrigel膠(3.9μg/μl)置于孔徑為8μm的transwell上室的聚碳酸脂膜上，使膜上的所有的微孔均被matrigel覆蓋，置于37℃30min使matrigel聚合成凝膠。

2、配置細(xì)胞懸液

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同處理組的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，無血清培養(yǎng)基重懸后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴個(gè)/ml。

3、細(xì)胞接種

在transwell上室加入2ml的細(xì)胞懸液，下室加入1ml的含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，放置于配套的6孔板上，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)20-24h；取出transwell小室，棉簽擦盡上室面的matrigel膠和未穿透膜的細(xì)胞。

4、染色

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出transwell小室，棉簽擦盡上室面的matrigel膠和未穿透膜的細(xì)胞，下室面用95％酒精固定15min后，蘇木素染色2min，倒置顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野觀察、計(jì)數(shù)并拍照。計(jì)數(shù)小室下室面的細(xì)胞數(shù)即為穿透matrigel膠的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并以該細(xì)胞數(shù)代表腫瘤細(xì)胞的侵襲力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示的，采用繁多樣本均數(shù)的方差檢驗(yàn)(anova)進(jìn)行分析，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖8所示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞穿過transwell小室聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，而對(duì)照組之間無明顯差異，結(jié)果說明asprv1過表達(dá)可以促進(jìn)喉鱗癌的侵襲。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

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<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>asprv1作為生物標(biāo)志物在喉鱗癌診療中的應(yīng)用

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