本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種降低細(xì)菌內(nèi)毒素的人尿激肽原酶制備方法。

背景技術(shù)：

1、人尿激肽原酶(urinary?kallidinogenase)，是從人尿中分離提取的一種由238個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，等電點(diǎn)在4.3左右，分子量約43000±4000da，屬于絲氨酸蛋白酶。它能夠激活人血漿激肽原轉(zhuǎn)化為激肽、擴(kuò)張血管增加血流量、改善血液循環(huán)的作用，促進(jìn)缺血區(qū)新生血管生成。目前，已經(jīng)被開發(fā)成用于治療急性腦梗死的藥物。

2、國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)ws1-(x-076)-2012z-2021，明確規(guī)定“本品在生產(chǎn)過程中需經(jīng)60℃加熱10小時(shí)，以使病毒滅活”；且細(xì)菌內(nèi)毒素要求每0.15pna單位尤瑞克林中內(nèi)毒素含量應(yīng)小于25eu。

3、細(xì)菌內(nèi)毒素屬于熱原的一種，而熱原系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。它包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。這里所指的“熱原”，主要是指細(xì)菌性熱原，是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌尸體及內(nèi)毒素。致熱能力最強(qiáng)的是革蘭氏陰性桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭陽性桿菌類，革蘭陽性球菌則較弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。當(dāng)含有熱原的物質(zhì)進(jìn)入人體以后，人體會(huì)產(chǎn)生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時(shí)體溫可升至40℃以上，嚴(yán)重者甚至昏迷、虛脫，如不及時(shí)搶救，可危及生命。因此去熱原是本品生產(chǎn)工序中不可缺少的一步。

4、目前，公開的制備尿激酶的制備工藝主要解決的是產(chǎn)品純度，比活等問題，如專利cn101134952a公開了一種人尿激肽原酶及其制備方法，其采用脫乙酰甲殼素吸附男性尿液后，硫酸銨沉淀得人尿激肽原酶粗品，該人尿激肽原酶粗品經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱層析、疏水層析、60℃加熱10小時(shí)病毒滅活、親和層析制備人尿激肽原酶；其制備方法獲得的人尿激肽原酶為單一成分的蛋白質(zhì)物質(zhì)。

5、但是針對(duì)人尿激肽原酶產(chǎn)品中熱原的去除，還有待進(jìn)一步優(yōu)化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種高效價(jià)、低細(xì)菌內(nèi)毒素的人尿激肽原酶制備方法。

2、技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種降低細(xì)菌內(nèi)毒素的人尿激肽原酶制備方法，包括如下步驟：

3、1)將人尿激肽原酶粗品溶解，依次經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱層析、疏水層析柱層析、病毒滅活以及親和層析柱層析，得到人尿激肽原酶中間體溶液；

4、2)將步驟1)得到的人尿激肽原酶中間體溶液經(jīng)強(qiáng)陽離子交換柱層析，洗脫得到單位效價(jià)≥15pna單位/ml、細(xì)菌內(nèi)毒素含量<0.16eu/pna單位的人尿激肽原酶。

5、其中，步驟1)疏水層析柱層析的步驟如下：用ph6.5±0.5含硫酸銨的平衡溶液沖洗疏水層析柱，將強(qiáng)陰離子交換柱洗脫峰收集液加入硫酸銨，調(diào)節(jié)電導(dǎo)率高于平衡溶液2～4ms/cm，調(diào)節(jié)ph值至6.5±0.5，上樣疏水層析柱，用沖洗i液沖洗，再用低于沖洗i液濃度的沖洗ii液沖洗柱子，最后用低于沖洗ii液濃度的洗脫溶液洗脫柱子，收集洗脫峰溶液，用超濾膜濃縮得到濃縮液。

6、其中，所述平衡溶液和沖洗i液均為1.25～1.5mol/l硫酸銨溶液，ph6.5±0.1，所述沖洗ii液為1.0～1.2mol/l硫酸溶液，ph6.5±0.1，所述洗脫溶液為0.65～0.8mol/l硫酸銨溶液，ph6.5±h銨1。

7、其中，步驟1)的具體步驟包括如下：

8、a、人尿激肽原酶粗品的制備；

9、b、將人尿激肽原酶粗品溶解，過濾得到人尿激肽原酶粗品溶解液調(diào)節(jié)ph值至7.5±0.5，上樣已經(jīng)平衡的強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)柱，收集洗脫峰得到洗脫峰收集液；

10、c、用含硫酸銨的ph6.5±0.5平衡溶液沖洗疏水層析柱，將強(qiáng)陰離子交換柱洗脫峰收集液加入硫酸銨調(diào)節(jié)電導(dǎo)率高于平衡溶液2～4ms/cm，用冰醋酸調(diào)節(jié)ph值至6.5±.55，上樣疏水層析柱，用沖洗i液沖洗，再用低于沖洗i液濃度的沖洗ii液沖洗柱子，最后用低于沖洗ii液濃度的洗脫溶液洗脫柱子，收集洗脫峰溶液，用超濾膜濃縮得到濃縮液；

11、d、將濃縮液加入保護(hù)劑，調(diào)節(jié)ph值至7.5±0.5，然后60℃恒溫加熱10h；

12、e、將加熱后溶液上樣已經(jīng)平衡的親和層析填料柱，收集洗脫峰，用超濾膜濃縮得到人尿激肽原酶中間體溶液。

13、步驟a，人尿激肽原酶粗品的具體制備方法為：吸附劑吸附尿液中的尿蛋白一定時(shí)間后，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液濃縮后上已經(jīng)平衡好的金屬螯合親和層析柱；用平衡液沖洗該金屬螯合親和層析柱后，繼續(xù)用沖洗液沖洗該金屬螯合親和層析柱，再用洗脫液洗脫，收集洗脫峰；收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2-10小時(shí)后，收集沉淀，得到人尿激肽原酶粗品。

14、其中，人尿激肽原酶粗品的制備方法中，所述平衡液ph6.0～9.0，由0.1～0.2mnacl及0.01～0.2mol/l磷酸鹽或者醋酸鹽緩沖液組成。

15、所述沖洗液ph5～6，由0.01～0.1mol/lnacl及0.01～0.2mol/l磷酸鹽或者醋酸鹽緩沖液組成。

16、所述洗脫液ph2.8～4.5，為0.01～0.2mol/l醋酸-醋酸鈉溶液。

17、洗脫出的尿蛋白溶液濃縮后，調(diào)節(jié)ph值至6～9和電導(dǎo)率至0.5～10ms/cm，再上已經(jīng)平衡好的金屬螯合親和層析柱。

18、其中，步驟2)具體過程為：用ph為3.0～4.2平衡緩沖溶液沖洗強(qiáng)陽離子交換柱，將人尿激肽原酶中間體溶液ph值調(diào)節(jié)至與平衡緩沖溶液ph值一致，上強(qiáng)陽離子交換柱，用所述平衡緩沖溶液沖洗，再利用高鹽或高ph洗脫緩沖溶液洗脫，收集洗脫峰；所述洗脫緩沖溶液ph值高于所述人尿激肽原酶等電點(diǎn)或所述洗脫緩沖溶液電導(dǎo)率高于所述平衡緩沖溶液的電導(dǎo)率。

19、具體地，所述洗脫緩沖溶液包含鹽和緩沖溶液，其中當(dāng)洗脫緩沖溶液包含緩沖液ph值高于所述人尿激肽原酶等電點(diǎn)時(shí)，所述緩沖液可與低于所述平衡液電導(dǎo)率的低濃度鹽組合形成洗脫緩沖溶液，當(dāng)所述洗脫緩沖溶液包含緩沖溶液ph值低于所述人尿激肽原酶等電點(diǎn)時(shí)，所述緩沖溶液需與高于所述平衡緩沖溶液電導(dǎo)率的高濃度鹽組合形成洗脫緩沖溶液。

20、其中，步驟2)中，所述平衡緩沖溶液為濃度0.05～0.2mol/l的醋酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液或檸檬酸鈉緩沖溶液，ph為3.0～4.2，進(jìn)一步優(yōu)選為醋酸鹽緩沖溶液，ph優(yōu)選為3.6～4.2；因步驟1)親和層析洗脫所用緩沖體系為tris-hcl，不利于制劑產(chǎn)品的開發(fā)，本發(fā)明采用醋酸鹽緩沖溶液或檸檬酸鈉緩沖溶液的平衡緩沖溶液沖洗柱子，進(jìn)行緩沖體系的置換，后續(xù)可直接開發(fā)成相應(yīng)的人尿激肽原酶制劑。

21、其中，步驟2)中，所述洗脫緩沖溶液ph值為3.0～8.0，由0.01～1.0mol/l鹽及緩沖溶液組成。

22、優(yōu)選地，步驟2)中，所述洗脫緩沖溶液ph值為4.3～5.8，由0.05～0.2mol/l?nacl及緩沖溶液組成；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述人尿激肽原酶效價(jià)≥18pna單位/ml、細(xì)菌內(nèi)毒素含量＜0.16eu/pna單位。

23、優(yōu)選地，步驟2)中，所述洗脫緩沖溶液ph值為3.6～4.2，由0.2～0.5mol/l?nacl及緩沖溶液組成。

24、其中，所述緩沖溶液為濃度0.05～0.2mol/l的醋酸鹽緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液或檸檬酸鈉緩沖溶液。

25、其中，步驟2)中，所述強(qiáng)陽離子交換柱包括所述強(qiáng)陽離子交換柱包括sp強(qiáng)陽離子交換柱。

26、作為優(yōu)選，所述強(qiáng)陽離子交換柱包括但不僅限于sp?sepharosetm?fast?flow柱。

27、本發(fā)明采用ph為3.0～4.2平衡緩沖溶液平衡陽離子交換柱，并將人尿激肽原酶中間體溶液ph值調(diào)節(jié)至與平衡緩沖溶液ph值一致，使人尿激肽原酶分子帶正電荷，能夠與帶有負(fù)電荷的陽離子交換劑相結(jié)合，并達(dá)到高度富集和濃縮，使所分離樣品單位效價(jià)大大得到提高；在此條件下，細(xì)菌內(nèi)毒素在ph3.0～4.2時(shí)剛好帶有負(fù)電荷，不能與帶有負(fù)電荷的陽離子交換劑相結(jié)合而隨沖洗緩沖流動(dòng)相流出層析柱，從而使樣品內(nèi)細(xì)菌內(nèi)毒素含量反而大大得到去除。

28、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下優(yōu)點(diǎn)：

29、本發(fā)明制備方法得到高純度人尿激肽原酶(電泳法和hplc測(cè)定純度均為100％)，其由人尿激肽原酶粗品依次經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱層析、疏水層析柱層析、病毒滅活以及親和層析柱層析后，再經(jīng)強(qiáng)陽離子交換柱層析得到，該制備方法得到人尿激肽原酶在保證高收率(達(dá)到57％以上)、高純度的的同時(shí)，效價(jià)更高(單位效價(jià)≥15pna單位/ml)，且細(xì)菌內(nèi)毒素更低(細(xì)菌內(nèi)毒素含量＜0.16eu/pna單位)，便于后續(xù)下一步后處理和保存，臨床上使用時(shí)安全性更高。