本發(fā)明屬于基因工程。更具體地，涉及一種煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、煙酰胺單核苷酸(nicotinamide?mononucleotide，nmn)是一種天然的生物活性核苷酸，屬vb族衍生物，具有較高的食品安全性，可用于改善衰老和代謝性疾病。但當(dāng)前nmn的產(chǎn)量并不能滿足其日益增長的需要，亟需提供一種能夠提高nmn產(chǎn)量的方法。

2、目前，nmn的合成方法主要有化學(xué)合成和生物合成兩種?；瘜W(xué)合成在生產(chǎn)過程中存在能耗高、反應(yīng)條件苛刻、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題。因此，nmn的生物合成方法更受推崇?，F(xiàn)有的nmn的生物合成方法主要是以葡萄糖和煙酰胺為底物，利用煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行催化合成，或利用表達(dá)煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的重組菌進(jìn)行全細(xì)胞催化；前者直接使用酶進(jìn)行催化的方式因存在酶易失活等問題，不如后者利用重組菌進(jìn)行全細(xì)胞催化的方式有優(yōu)勢。

3、煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nampt)是nmn生物合成中的一種關(guān)鍵酶，但天然酶的活性不高，限制了nmn的規(guī)模化生產(chǎn)。為提高nmn產(chǎn)量，技術(shù)人員嘗試通過對煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行突變的方式使酶的催化活性得以提高，從而提高單位時(shí)間內(nèi)的nmn產(chǎn)量?，F(xiàn)有披露的突變方案中，針對煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的核心區(qū)域，第100～450區(qū)間位點(diǎn)的突變較多(針對200～400區(qū)間位點(diǎn)的突變最多)。但研究數(shù)據(jù)顯示，針對不同位點(diǎn)進(jìn)行突變所得突變體的效果差異顯著，目前披露的多數(shù)突變體的催化活性的提高程度有限，其催化活性較野生型提高不到1倍，并不能顯著提高nmn產(chǎn)量。因此，繼續(xù)探究突變位點(diǎn)和突變方式對nmn產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種提高煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性的方法。

3、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶突變體。

4、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種編碼所述突變體的基因。

5、本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種重組質(zhì)粒。

6、本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種重組菌。

7、本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供所述突變體、所述基因、所述重組質(zhì)?；蛩鲋亟M菌在生物合成煙酰胺單核苷酸中的應(yīng)用。

8、本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供所述突變體、所述基因、所述重組質(zhì)?；蛩鲋亟M菌在制備用于生物合成煙酰胺單核苷酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供一種高產(chǎn)煙酰胺單核苷酸的方法。

10、本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

11、本發(fā)明以煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nampt)野生型為親本，針對其進(jìn)行了酶的半理性設(shè)計(jì)，從中得到了能夠提高煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化活性的突變位點(diǎn)和相應(yīng)的突變體。

12、本發(fā)明請求保護(hù)一種提高煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性的方法，所述方法為：將煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的第75位纈氨酸突變?yōu)槌嚢彼嵬獾娜我庖环N氨基酸；

13、或?qū)燉０妨姿岷颂寝D(zhuǎn)移酶的第83為天冬氨酸突變?yōu)榱涟彼?、賴氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、組氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、酪氨酸、纈氨酸、谷氨酸或天冬酰胺。

14、具體地，本發(fā)明所述煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶在ncbi中的參考序列(ncbireference?sequence)為wp_012788281.1。

15、具體地，所述將煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的第75位纈氨酸突變?yōu)槌嚢彼嵬獾娜我庖环N氨基酸，是指將其突變?yōu)槌嚢彼嵬獾钠溆嗳我庖环N天然氨基酸。

16、本發(fā)明還請求保護(hù)一種煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶突變體，所述突變體是利用上述方法，對參考序列wp_012788281.1的特定氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變得到。

17、作為其中的一種實(shí)施方式，本發(fā)明構(gòu)建所述突變體時(shí)，是通過設(shè)計(jì)相應(yīng)的定點(diǎn)突變引物，通過反向pcr擴(kuò)增得到。其中，編碼野生型煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的基因序列如seqid?no.1所示。

18、本發(fā)明還請求保護(hù)一種編碼所述突變體的基因。

19、本發(fā)明雖未給出各突變體的氨基酸或基因序列，但在親本氨基酸序列已知的基礎(chǔ)上，知道突變位點(diǎn)突變后的氨基酸即可獲得對應(yīng)突變體的氨基酸序列，進(jìn)而得到其對應(yīng)的基因序列。除對親本進(jìn)行突變外，也可以依據(jù)突變體的序列，通過人工合成等方法獲得相應(yīng)突變體。因此，本發(fā)明還請求保護(hù)編碼所述突變體的基因。利用所述基因，可通過重組表達(dá)獲得相應(yīng)的突變體。

20、本發(fā)明還請求保護(hù)一種重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒用于表達(dá)本發(fā)明所述突變體。

21、具體地，所述重組質(zhì)粒中含有編碼本發(fā)明所述突變體的基因。

22、可選地，構(gòu)建所述質(zhì)粒所用載體為prs306。

23、本發(fā)明還請求保護(hù)一種重組菌，所述重組菌能夠表達(dá)本發(fā)明所述突變體。

24、作為其中的一種實(shí)施方式，所述重組菌中含有用于表達(dá)本發(fā)明所述突變體的重組質(zhì)粒。

25、可選地，構(gòu)建重組菌時(shí)，可以選擇大腸桿菌或釀酒酵母作為出發(fā)菌株。

26、本發(fā)明還請求保護(hù)所述突變體、所述基因、所述重組質(zhì)?；蛩鲋亟M菌在生物合成煙酰胺單核苷酸中的應(yīng)用。

27、本發(fā)明還請求保護(hù)所述突變體、所述基因、所述重組質(zhì)?；蛩鲋亟M菌在制備用于生物合成煙酰胺單核苷酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

28、本發(fā)明還提供了一種高產(chǎn)煙酰胺單核苷酸的方法，所述方法為：將生產(chǎn)煙酰胺單核苷酸所使用的煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶替換為本發(fā)明所述煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶突變體，或?qū)⑸a(chǎn)煙酰胺單核苷酸所使用的表達(dá)煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的重組菌替換為本發(fā)明所述重組菌。

29、作為其中的一種具體實(shí)施方式，所述方法為：以葡萄糖和煙酰胺為底物，利用本發(fā)明所述重組菌進(jìn)行全細(xì)胞催化。

30、具體地，所述方法中，底物葡萄糖的濃度為50～90g/l，底物煙酰胺的濃度為10～20g/l。

31、優(yōu)選地，所述方法中，底物葡萄糖的濃度為60～80g/l，底物煙酰胺的濃度為10～15g/l。

32、更優(yōu)選地，所述方法中，底物葡萄糖的濃度為70g/l，底物煙酰胺的濃度為10～15g/l。此底物濃度條件下，利用所述重組菌進(jìn)行全細(xì)胞催化制備所得nmn的產(chǎn)量相對最高。

33、具體地，所述方法中，重組菌的od600為28～32。

34、更具體地，所述方法中，重組菌的od600為30。

35、具體地，所述重組菌為能夠表達(dá)本發(fā)明所述突變體的重組釀酒酵母。

36、本發(fā)明具有以下有益效果：

37、本發(fā)明公開了一種煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明的突變方案為：以煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶野生型第1～100區(qū)間位點(diǎn)內(nèi)的第75位氨基酸或第83位氨基酸進(jìn)行單點(diǎn)突變，獲得活性較野生型顯著提高的突變體?；谒鐾蛔兎桨福景l(fā)明同時(shí)還構(gòu)建得到了能夠表達(dá)所述突變體的重組釀酒酵母。相較于野生型，利用本發(fā)明所述突變體，可以顯著提高nmn產(chǎn)量。其中，對第75位氨基酸進(jìn)行突變所得突變體的nmn產(chǎn)量最高比野生型提高了4.3倍，對第83位氨基酸進(jìn)行突變所得突變體的nmn產(chǎn)量最高比野生型提高了5.3倍。本發(fā)明為進(jìn)一步提高nmn產(chǎn)量提供了理論基礎(chǔ)，有利于nmn的規(guī)模化生產(chǎn)，促進(jìn)nmn產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。