本發(fā)明涉及一種核酸檢測，尤其涉及的是一種核酸檢測流控卡盒及方法。

背景技術(shù)：

1、微流控芯片技術(shù)因其具有將核酸提取、擴(kuò)增、檢測等步驟集成到幾個(gè)平方厘米的芯片上的能力，以及易于集成化、自動(dòng)化、流體可控和所需樣本量小的特點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用在核酸檢測領(lǐng)域。微流控卡盒是微流控芯片的一種，復(fù)雜的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，結(jié)合配套的儀器設(shè)備，使其能夠在密閉的空間中完全自動(dòng)化的進(jìn)行包括樣本提取、核酸擴(kuò)增和結(jié)果檢測的整個(gè)核酸檢測流程。實(shí)現(xiàn)簡化實(shí)驗(yàn)操作步驟、降低操作人員感染風(fēng)險(xiǎn)的目的。

2、微流控技術(shù)在基于數(shù)字pcr的液體活檢中發(fā)揮著重要作用。微流控芯片在液滴生成、放大和熒光檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用。目前已經(jīng)有很多有關(guān)數(shù)字pcr芯片的發(fā)明創(chuàng)造，但是他們并不具備核酸提取功能，因此僅能應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cn?109746058a；cn202110918931)。

3、如cn?114292734?a公開了一種包含核酸純化的全流程集成液滴數(shù)字pcr芯片，屬于核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，所述pcr芯片包括芯片本體，所述芯片本體包括樣品處理單元、液滴生成結(jié)構(gòu)和液滴平鋪腔室，所述樣品處理單元包括依次連通的裂解腔室、一個(gè)或多個(gè)洗滌腔室和混合腔室，所述混合腔室通過所述液滴生成結(jié)構(gòu)與所述液滴平鋪腔室連通，位于所述混合腔室中的液滴在外加正壓或負(fù)壓下，經(jīng)過所述液滴生成結(jié)構(gòu)后形成多個(gè)微液滴，多個(gè)微液滴平鋪于所述液滴平鋪腔室內(nèi)。該專利(cn?114292734?a)使用磁珠法提取核酸，但是該發(fā)明并不具備核酸提取試劑存儲(chǔ)功能，且不同試劑腔室是通過密封油進(jìn)行隔離的，操作非常繁瑣，難以實(shí)際推廣應(yīng)用。

4、如cn?110575852?a公開了一種集成樣品前處理的多重?cái)?shù)字rpa微流控芯片，具有六層結(jié)構(gòu)，分為樣品前處理區(qū)域和多重?cái)?shù)字rpa檢測區(qū)域，2個(gè)區(qū)域之間通過通道連接，并通過螺桿微閥控制開合。所述樣品前處理是基于磁珠法進(jìn)行核酸提取，具有4個(gè)反應(yīng)腔室，通過中間區(qū)域的礦物油將裂解，清洗，洗脫三個(gè)部分分隔開，所述多重?cái)?shù)字rpa區(qū)域由4個(gè)獨(dú)立的進(jìn)樣口進(jìn)行反應(yīng)組分預(yù)包埋，具有1個(gè)陰性對照區(qū)域以及3個(gè)陽性對照區(qū)域，可以同時(shí)檢測3種目的基因。同樣，該專利使用磁珠法提取核酸，但是該發(fā)明并不具備核酸提取試劑存儲(chǔ)功能，且不同試劑腔室是通過密封油進(jìn)行隔離的，操作非常繁瑣，難以實(shí)際推廣應(yīng)用。更重要的是，該專利采用rpa進(jìn)行檢測，并沒精標(biāo)準(zhǔn)pcr檢測方法，可能造成檢測結(jié)果的假陽性。

5、公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息已構(gòu)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于：如何解決目前核酸檢測流程繁瑣、轉(zhuǎn)移過程中還可能造成假陽性的問題。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)解決上述技術(shù)問題的：

3、單分子核酸檢測流控卡盒，包括卡盒本體以為位于卡盒本體中部的旋轉(zhuǎn)閥，所述卡盒本體內(nèi)包括沿旋轉(zhuǎn)閥圓周分布的多個(gè)腔室，腔室包括裂解腔、提取腔、多個(gè)清洗液腔、洗脫腔、多個(gè)反應(yīng)液存儲(chǔ)腔、硅油存儲(chǔ)腔；提取腔中預(yù)埋有用于吸附核酸的磁珠；

4、通過外接動(dòng)力源給卡盒本體，使得裂解腔、提取腔、多個(gè)清洗液腔、洗脫腔、多個(gè)反應(yīng)液存儲(chǔ)腔、硅油存儲(chǔ)腔在所述旋轉(zhuǎn)閥過程中任意兩個(gè)或兩個(gè)以上個(gè)腔室的通過管道連通且卡盒本體內(nèi)試劑流動(dòng)；

5、將待測樣本和位于裂解液腔中的裂解液混合，轉(zhuǎn)移進(jìn)入提取腔，隨后完成樣本裂解、磁珠吸附核酸、磁珠清洗、核酸洗脫、反應(yīng)體系配置、液滴生成的操作。

6、本發(fā)明提供的集成核酸提取、液滴生成和數(shù)字pcr檢測的微流控卡盒及應(yīng)用，根據(jù)檢測對象，更換核酸提取和擴(kuò)增試劑，同時(shí)配合外圍機(jī)械結(jié)構(gòu)，以自動(dòng)化地方式實(shí)現(xiàn)核酸提取、反應(yīng)體系配置、液滴生產(chǎn)、液滴平鋪、擴(kuò)增反應(yīng)和熒光檢測；檢測過程完全標(biāo)準(zhǔn)化，避免試劑轉(zhuǎn)移過程中受到污染導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的問題。

7、優(yōu)選的，所述裂解液腔包括用于與旋轉(zhuǎn)閥連通的第一管道以及位于裂解腔上的裂解腔通氣口，所述旋轉(zhuǎn)閥包括第一公共管道，外接動(dòng)力源可以與裂解腔通氣口連通實(shí)現(xiàn)往裂解液腔內(nèi)施加壓力；所述提取腔包括用于與旋轉(zhuǎn)閥連通的第二管道以及位于提取腔上的提取腔通氣口；

8、旋轉(zhuǎn)閥旋轉(zhuǎn)到第一位置時(shí)，將裂解液腔、第一管道、第一公共管道、第二管道、提取腔、提取腔通氣口連通；外接動(dòng)力源提供動(dòng)力給予提取腔通氣口負(fù)壓力，位于裂解液腔中的待測樣本和裂解液混合液進(jìn)入提取腔的操作；采用磁鐵吸附磁珠，同時(shí)外接動(dòng)力源持續(xù)不斷地提供動(dòng)力給予提取腔通氣口正壓力，把提取腔中廢液反向推回裂解液腔。

9、優(yōu)選的，所述提取腔包括用于與旋轉(zhuǎn)閥連通的第二管道以及位于提取腔上的提取腔通氣口；所述清洗腔包括第一清洗腔，第一清洗液腔上設(shè)置第一清洗液通氣口；

10、外接動(dòng)力源提供動(dòng)力給予提取腔通氣口負(fù)壓力，位于第一清洗液腔中的清洗液注入提取腔；當(dāng)外接動(dòng)力源持續(xù)不斷地提供動(dòng)力給予提取腔通氣口負(fù)壓力，使含有待測樣本的第一清洗液與磁珠充分混合，進(jìn)而使磁珠充分吸附核酸；采用磁鐵吸附磁珠，同時(shí)外接動(dòng)力源持續(xù)不斷地提供動(dòng)力給予提取腔通氣口正壓力，將會(huì)把提取腔中廢液反向推回第一清洗液腔。

11、優(yōu)選的，所述提取腔包括用于與旋轉(zhuǎn)閥連通的第二管道以及位于提取腔上的提取腔通氣口；所述清洗腔包括第二清洗腔，第二清洗液腔上設(shè)置第二清洗液通氣口；

12、外接動(dòng)力源提供動(dòng)力給予提取腔通氣口負(fù)壓力，位于第二清洗液腔中的清洗液注入提取腔；當(dāng)外接動(dòng)力源持續(xù)不斷地提供動(dòng)力給予提取腔通氣口負(fù)壓力，使含有待測樣本的第二清洗液與磁珠充分混合，進(jìn)而使磁珠充分吸附核酸；采用磁鐵吸附磁珠，同時(shí)外接動(dòng)力源持續(xù)不斷地提供動(dòng)力給予提取腔通氣口正壓力，將會(huì)把提取腔中廢液反向推回第二清洗液腔。

13、優(yōu)選的，所述提取腔包括用于與旋轉(zhuǎn)閥連通的第二管道以及位于提取腔上的提取腔通氣口；所述洗脫液腔包括第一五管道以及位于洗脫液腔上的洗脫液腔通氣口；

14、外接動(dòng)力源提供動(dòng)力給予提取腔通氣口負(fù)壓力，位于洗脫液腔中的洗脫液注入提取腔；當(dāng)外接動(dòng)力源持續(xù)不斷地提供動(dòng)力給予提取腔通氣口負(fù)壓力，使含有待測樣本的洗脫液與磁珠充分混合，進(jìn)而使磁珠充分吸附核酸，遺留在提取腔中磁珠完成洗脫核酸操作，用磁鐵實(shí)現(xiàn)磁珠和核酸洗脫液分離。

15、優(yōu)選的，所述提取腔包括用于與旋轉(zhuǎn)閥連通的第二管道以及位于提取腔上的提取腔通氣口；所述反應(yīng)液存儲(chǔ)腔包括第一反應(yīng)液存儲(chǔ)腔，第一反應(yīng)液存儲(chǔ)腔包括第六管道，第一反應(yīng)液存儲(chǔ)腔上設(shè)置第一反應(yīng)液通氣口；

16、外接動(dòng)力源提供動(dòng)力給予提取腔通氣口正壓力，位于提取腔中的核酸洗脫液注入第一反應(yīng)液存儲(chǔ)腔。

17、優(yōu)選的，所述提取腔包括用于與旋轉(zhuǎn)閥連通的第二管道以及位于提取腔上的提取腔通氣口；所述反應(yīng)液存儲(chǔ)腔包括第二反應(yīng)液存儲(chǔ)腔，第二反應(yīng)液存儲(chǔ)腔包括第六管道，第二反應(yīng)液存儲(chǔ)腔上設(shè)置第二反應(yīng)液通氣口；

18、外接動(dòng)力源提供動(dòng)力給予提取腔通氣口正壓力，位于提取腔中的核酸洗脫液注入第二反應(yīng)液存儲(chǔ)腔。

19、優(yōu)選的，所述反應(yīng)液存儲(chǔ)腔包括對稱布置的第一反應(yīng)液存儲(chǔ)腔和第二反應(yīng)液存儲(chǔ)腔；

20、第一反應(yīng)液存儲(chǔ)腔包括第六管道，第一反應(yīng)液存儲(chǔ)腔上設(shè)置第一反應(yīng)液通氣口，第六管道一端與第一反應(yīng)液存儲(chǔ)腔連接，另一端通過旋轉(zhuǎn)閥的第二公共通道與第一反應(yīng)液分樣通道連通，第一反應(yīng)液分樣通道末端為第一液滴出口；

21、第二反應(yīng)液存儲(chǔ)腔包括第七管道，第二反應(yīng)液存儲(chǔ)腔上設(shè)置第二反應(yīng)液通氣口，第七管道一端與第二反應(yīng)液存儲(chǔ)腔連接，另一端通過旋轉(zhuǎn)閥的第三公共通道與第二反應(yīng)液分樣通道連通，第二反應(yīng)液分樣通道末端為第二液滴出口。

22、優(yōu)選的，所述硅油存儲(chǔ)腔一側(cè)連通油腔通氣口，另一側(cè)通過內(nèi)部取油管道分別與第一進(jìn)油管道和第二進(jìn)油管道連接，第一進(jìn)油管道與第一液滴出口連通，第二進(jìn)油管道與第二液滴出口連通；對油腔通氣口與第一反應(yīng)液存儲(chǔ)腔通氣口和第二反應(yīng)液存儲(chǔ)腔通氣口同時(shí)施加壓力，第一反應(yīng)液存儲(chǔ)腔和第二反應(yīng)液存儲(chǔ)腔中的反應(yīng)液分別在第一液滴出口處和第二液滴出口處生成液滴。

23、優(yōu)選的，所述卡盒本體內(nèi)還包括清洗液冗余腔，清洗液冗余腔包括清洗液冗余腔進(jìn)樣管道和清洗液冗余腔通氣口；

24、在提取復(fù)雜樣本時(shí)清洗液冗余腔裝載第三清洗液或者作為廢液存儲(chǔ)腔使用。

25、清洗液冗余腔可以根據(jù)需要實(shí)現(xiàn)多次清洗或廢液儲(chǔ)存。

26、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

27、(1)本發(fā)明提供的集成核酸提取、液滴生成和數(shù)字pcr檢測的微流控卡盒及應(yīng)用，根據(jù)檢測對象，更換核酸提取和擴(kuò)增試劑，同時(shí)配合外圍機(jī)械結(jié)構(gòu)，以自動(dòng)化地方式實(shí)現(xiàn)核酸提取、反應(yīng)體系配置、液滴生產(chǎn)、液滴平鋪、擴(kuò)增反應(yīng)和熒光檢測；檢測過程完全標(biāo)準(zhǔn)化，避免試劑轉(zhuǎn)移過程中受到污染導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的問題。

28、(2)本發(fā)明提供的集成核酸提取、液滴生成和數(shù)字pcr檢測的微流控卡盒及應(yīng)用可以在卡盒上同時(shí)完成核酸提取與數(shù)字pcr。完成核酸提取時(shí)間＜15min，完成全流程核酸檢測時(shí)間＜60min。

29、(3)本發(fā)明提供的集成核酸提取、液滴生成和數(shù)字pcr檢測的微流控卡盒及應(yīng)用，配合自動(dòng)檢測儀，可以自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化地給出目標(biāo)基因的絕對拷貝數(shù)，與傳統(tǒng)pcr或者傳統(tǒng)液滴數(shù)字pcr相比，整合了核酸提取和擴(kuò)增檢測，無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，直觀給出檢測結(jié)果，降低成本。