本發(fā)明屬于小麥活性肽以及鈣補(bǔ)充劑制備，涉及谷朊粉活性肽制備方法以及小麥多肽螯合鈣(鈣螯合肽)制備方法。

背景技術(shù)：

1、小麥(triiccum?aestivuml.)屬于禾本科小麥屬，是越年生(冬小麥)或一年生(春小麥)草本植物。小麥?zhǔn)鞘澜缟戏植挤秶头N植面積極廣，總產(chǎn)量極高的糧食作物。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(fao)的預(yù)測(cè)，2023/24年度全球谷物產(chǎn)量28.41億噸，小麥產(chǎn)量7.88億噸，全球小麥消費(fèi)量7.95億噸。根據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局的發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2023年我國(guó)糧食總產(chǎn)量13908.2億斤，谷物播種面積14.99億畝，其中小麥播種面積3.54億畝，比上年增加163.2萬畝，增長(zhǎng)0.5％。小麥穎果磨粉后成為面粉，可以制作饅頭、蛋糕等食物，經(jīng)發(fā)酵可得到酒精等飲品或調(diào)味料，還可以用于飼料、生物燃料等，用途廣泛。小麥蛋白俗稱谷朊粉，是從小麥粉中提取出來的天然蛋白質(zhì)，屬于小麥淀粉生產(chǎn)的副產(chǎn)物。利用谷朊粉酶解蛋白質(zhì)制備的小麥肽具有多種生物活性，是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

2、人體正常的生物過程涉及22種無機(jī)元素，這些元素可以通過日常飲食補(bǔ)充。鈣是人體必需的營(yíng)養(yǎng)素，占體重的1.5％-2.2％。鈣在各種生理和代謝活動(dòng)中具有重要作用，如肌肉收縮、凝血、神經(jīng)傳遞和骨骼發(fā)育。鈣攝入不足經(jīng)常導(dǎo)致代謝性骨疾病，如軟骨病、骨軟化癥、骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松。鈣補(bǔ)充劑和鈣強(qiáng)化食品的攝入可以緩解鈣缺乏因而備受人們關(guān)注。

3、鈣補(bǔ)充劑的發(fā)展經(jīng)歷了四個(gè)階段：無機(jī)鈣鹽、有機(jī)酸鈣鹽、氨基酸螯合鈣和肽螯合鈣。第一代無機(jī)鈣鹽主要由碳酸鈣、磷酸鈣和氯化鈣組成。鈣以離子的形式存在，在胃腸道消化過程中容易形成沉淀，鈣的吸收和生物利用度存在明顯缺陷，長(zhǎng)期使用可能產(chǎn)生副作用，增加人體負(fù)擔(dān)。第二代有機(jī)鈣主要包括乳酸鈣、檸檬酸鈣和葡萄糖酸鈣，雖然更易溶解，但仍具有容易形成沉淀物和鈣補(bǔ)充劑效率低的缺點(diǎn)。第三代氨基酸螯合鈣克服了離子鈣生物利用度低但易在胃腸道環(huán)境中沉淀的主要限制，但反應(yīng)實(shí)現(xiàn)成本極高，并可能產(chǎn)生不需要的顯色反應(yīng)和脂質(zhì)氧化反應(yīng)。第四代鈣螯合肽具有許多優(yōu)點(diǎn)，如反應(yīng)低能耗、可以與鈣離子形成可溶性穩(wěn)定螯合物等。目前，研究人員已經(jīng)從許多不同的食物來源中分離出具有鈣螯合活性的肽，如牛骨膠原蛋白、太平洋鱈魚皮蛋白、蛋清蛋白、花生蛋白。從小麥蛋白中分離出具有鈣螯合活性的多肽也有研究，然而其一般是將酶解得到的多肽混合物直接與鈣離子螯合得到的小麥多肽螯合鈣螯合率低。此外，酶解條件是影響小麥蛋白得到小麥多肽的關(guān)鍵因素，現(xiàn)有技術(shù)中的酶解條件往往不是最佳酶解條件，影響多肽的產(chǎn)率，最終降低小麥多肽螯合鈣螯合率。為此，本發(fā)明提供了一種螯合率更高的小麥多肽螯合鈣的制備方法，該方法通過響應(yīng)面法確定谷朊粉酶解肽過程的酶解條件，提高了多肽的產(chǎn)率，通過分離篩選出最佳的小麥多肽，制備出螯合率較高、在人體消化ph環(huán)境中穩(wěn)定性好，消化吸收好的小麥多肽螯合鈣。最為重要的是現(xiàn)有技術(shù)中沒有從疏水性、活性等方面篩選最適合制備小麥多肽螯合鈣的小麥多肽，為多肽螯合鈣的研究和設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于一種小麥多肽螯合鈣的制備方法，解決現(xiàn)有小麥蛋白直接酶解得到的多肽混合物與鈣鹽螯合率低，現(xiàn)有酶解條件不是最佳條件，以及不知最適合制備小麥多肽螯合鈣的小麥多肽的結(jié)構(gòu)。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、一種小麥多肽螯合鈣的制備方法，具體包括以下步驟：

4、(1)稱取谷朊粉，加入蛋白酶進(jìn)行酶解，所述蛋白酶由堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成；

5、(2)酶解完成后滅活，離心取上清液，即為酶解物溶液；

6、(3)采用截留分子量為10000da的超濾膜對(duì)酶解物溶液進(jìn)行過濾分離，一次濾液中小麥多肽分子量小于10000kda，然后再采用截留分子量為3000da的超濾膜對(duì)一次濾液進(jìn)行過濾分離，得到二次濾液中小麥多肽分子量小于3000da,最后采用截留分子量為500da的超濾膜過濾分離，三次濾液和三次過濾得到的濃縮液分別經(jīng)冷凍干燥得到分子量小于500da的小麥多肽和分子量為500～3000da的小麥多肽；

7、(4)將分子量小于500da、500～3000da或小于3000da的小麥多肽分別溶于去離子水，然后加入鈣鹽溶液，調(diào)節(jié)ph＝7，恒溫進(jìn)行螯合反應(yīng)，將反應(yīng)混合物離心，取上清液，乙醇沉淀后離心，沉淀即為鈣螯合肽。

8、需要說明的是，步驟(1)中酶解條件為：酶解溫度為45～65℃，酶解ph為5～10，酶解時(shí)間為3～5h，堿性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為1：3～3：1，去離子水與谷朊粉的液料比為13：1～22.5：1，蛋白酶用量為5000u/g。

9、較佳地，步驟(1)中較優(yōu)酶解條件為：酶解溫度50℃，酶解ph為9.0，酶解時(shí)間4h，堿性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為為3:1，去離子水與谷朊粉的液料比17.5:1，加酶量5000u/g。

10、優(yōu)選地，步驟(1)中最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度為55℃，酶解ph為8.5，堿性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為2.63：1，去離子水與谷朊粉的液料比為20：1。

11、步驟(1)中最優(yōu)酶解條件確定過程為：

12、(101)首先通過單因素實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解ph、加酶量、堿性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比、酶解液料比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定較優(yōu)酶解條件：酶解溫度50℃、酶解ph為9.0、堿性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為為3:1、液料比17.5:1、酶解時(shí)間4h、加酶量5000u/g；

13、(102)然后在較優(yōu)酶解條件的基礎(chǔ)上選取酶解溫度、酶解ph、堿性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶比值、液料比，以表征酶解肽與金屬離子鈣能力的螯合率為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到響應(yīng)面因素編碼及水平參數(shù)表；

14、(103)將響應(yīng)面因素編碼及水平參數(shù)表輸入軟件design?expert?13，設(shè)計(jì)生成表2中15列實(shí)驗(yàn)條件，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)后將所測(cè)得到螯合率輸入軟件，軟件自動(dòng)分析得到最優(yōu)酶解條件，最優(yōu)酶解條件：酶解溫度為55℃，酶解ph為8.5，堿性蛋白酶：風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為2.63：1，液料比為20：1。

15、需要說明的是，步驟(2)酶解反應(yīng)結(jié)束后，水浴加熱90℃滅酶10min，冷卻至室溫，8000r/min轉(zhuǎn)速，離心10min，收集上清液。

16、需要說明的是，步驟(3)中，先將酶解物溶液通過預(yù)先清洗的纖維膜初步除去雜質(zhì)后，再進(jìn)行超濾分離。

17、需要說明的是，步驟(4)中，小麥多肽溶液濃度為13.5％，螯合反應(yīng)鈣源為2mol/l的cacl2溶液，螯合反應(yīng)溫度為38℃，搖床條件設(shè)置為轉(zhuǎn)速200r/min，螯合反應(yīng)時(shí)間為12min，離心取上清液加入9倍體積的無水乙醇，靜置35min醇沉結(jié)束后離心，取沉淀醇洗2次后于42℃烘箱烘干。

18、需要說明的是，步驟(4)中多肽溶液與cacl2溶液的體積比為5：1，兩次離心條件為8000r/min轉(zhuǎn)速，離心10min。

19、需要說明的是，采用lc-ms/ms對(duì)步驟(3)中二次濾液進(jìn)行分析，得到1224條多肽序列，采用toxinpred預(yù)測(cè)多肽是否具有毒性，采用peptideranker預(yù)測(cè)多肽活性，依據(jù)毒性、有利螯合氨基酸占比、活性、疏水性對(duì)多肽進(jìn)行篩選，依據(jù)無毒原則篩選得到1200條無毒序列，依據(jù)含有有利氨基酸多肽序列得到782條序列，根據(jù)活性篩選得到41條多肽，根據(jù)疏水性篩選得到21條多肽，最后這些序列依據(jù)活性高低篩選得到以下四條序列：

20、seq?id?no1：val?tyr?ile?pro?pro?tyr?cys；

21、seq?id?no2：tyr?ser?met?leu?asp?ser?met?tyr?lys?glu?his?gly；

22、seq?id?no3：cys?asn?val?asn?val?pro?leu?tyr?glu；

23、seq?id?no4：cys?asn?val?asn?val?pro?leu?tyr?glu。

24、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)與有益效果：(1)本發(fā)明從谷朊粉酶解產(chǎn)物中分離純化得到的小于3000da的小麥多肽混合物形成的小麥多肽螯合鈣螯合率高，在腸模擬中穩(wěn)定性良好，具有一定程度的抗消化性，耐酸堿性能好，容易被機(jī)體吸收，具有較好的溫度耐受性能，是第四代鈣補(bǔ)充劑的良好來源；(2)從小麥多肽混合物中篩選出四條無毒，活性好，螯合率高的多肽序列，為多肽的研制設(shè)計(jì)提供依據(jù)。