本發(fā)明涉及動(dòng)物基因工程，具體地說，涉及一種靶向編輯豬hnf1a基因的sgrna及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、青少年發(fā)病的成年型糖尿病(maturity-onset?diabetes?of?the?young，mody)是一種單基因型糖尿病，其特征是早發(fā)、呈常染色體顯性遺傳且胰腺β細(xì)胞功能缺陷。mody3是以β細(xì)胞功能缺陷為特征的單基因糖尿病，在已確診為糖尿病的人群中約有1％～2％的患者是mody3，該病的發(fā)病年齡從10～60歲不等，臨床表現(xiàn)也有較大異質(zhì)性，易被誤診為t1dm或t2dm。在臨床表現(xiàn)上，mody3患者有明顯的糖尿病家族史，非胰島素依賴，胰島素自身抗體多為陰性。已知引起mody的基因主要包括肝細(xì)胞核因子(hnf1a、hnf4a和hnf1b)、葡萄糖激酶(gck)、胰島素(ins)、b淋巴細(xì)胞激酶(blk)及neurod1等14種基因。gck、hnf1a、hnf4a和hnf1b基因的突變是引起mody最常見的原因。其中，hnf1a突變導(dǎo)致進(jìn)行性β細(xì)胞功能障礙，從而導(dǎo)致成年早期的糖尿病，是亞洲、歐洲以及北美m(xù)ody的最常見原因。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過200種hnf1a的基因突變導(dǎo)致mody3發(fā)生。hnf1a突變表現(xiàn)出高外顯率：63％的攜帶者在25歲時(shí)患上糖尿病，幾乎所有攜帶者在55歲前患上糖尿病。由于腎葡萄糖重吸收減少，攜帶者甚至在糖尿病之前患上糖尿。此外，由于高血糖癥嚴(yán)重并隨著時(shí)間的推移而惡化，微血管和大血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)與1型糖尿病(t1dm))和t2dm相似。因此，患者需嚴(yán)格控制血糖并密切監(jiān)測糖尿病并發(fā)癥。

2、hnf轉(zhuǎn)錄因子家族具有相似的結(jié)構(gòu)，包括二聚化域、dna結(jié)合域和反式激活結(jié)構(gòu)域。對這些基因的突變進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，它們主要是功能缺失性突變，導(dǎo)致二聚化能力(1-31aa)、dna結(jié)合親和力(91-181aa，198-279aa)、轉(zhuǎn)錄活性(280-631aa)或亞細(xì)胞定位的缺陷，這取決于突變的位置。hnf1a也稱tcf1，該基因位于12號染色體長臂上(12q24.2)，主要分布在肝臟、胰腺、腎臟和腸道等部位，具有調(diào)節(jié)肝臟的脂質(zhì)代謝及蛋白質(zhì)合成、胰腺的胰島素分泌、腎臟的葡萄糖重吸收等功能，如胰腺中的hnf1a與dna結(jié)合以調(diào)節(jié)靶基因如胰島素(ins)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(glut2)在成熟β細(xì)胞中的表達(dá)；hnf1a參與調(diào)節(jié)糖異生和相關(guān)途徑中許多中心限速步驟，結(jié)合其產(chǎn)物對正常肝功能至關(guān)重要的基因，包括碳水化合物合成和儲存、脂質(zhì)代謝(膽固醇和脂蛋白的合成)、解毒(細(xì)胞色素p450單加氧酶的合成)和血清蛋白的合成(白蛋白、補(bǔ)體和凝血因子)；此外，肝臟中的hnf1a與去乙酰化酶互作調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。包括hnf1a在內(nèi)的hnf家族參與肝臟的發(fā)育、功能和腫瘤的生長。hnf-1a全身性敲除、組織特異性敲除或移碼突變均能導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝紊亂，編碼基因第131位精氨酸突變?yōu)榻z氨酸的個(gè)體表現(xiàn)出代謝紊亂，但目前尚無該氨基酸突變的動(dòng)物模型。

3、豬在體型大小、解剖學(xué)、生理學(xué)和易于肥胖等方面與人類具有相似性，是一種有吸引力的模式生物，以其建立的診斷方法和治療措施可以直接應(yīng)用于人類。豬作為雜食動(dòng)物，其消化系統(tǒng)和營養(yǎng)代謝特征與人更相似，已成功應(yīng)用于人類營養(yǎng)代謝相關(guān)肥胖、nafld、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等方面的研究。豬與人的胰腺在組織學(xué)、生理和病理學(xué)方面都具有較高的相似性。首先，組織學(xué)方面，豬胰腺大小、形狀、體內(nèi)位置及血液供應(yīng)方面與人類相似；其次，重要功能基因同源性高，如豬與人胰島素僅在b鏈的第30位存在一個(gè)氨基酸差異，且豬胰島素應(yīng)用于人類糖尿病的治療已有幾十年的歷史；再次，糖尿病發(fā)生過程中，β細(xì)胞損傷病理機(jī)制相似，豬與人β細(xì)胞量減少50％時(shí)將降低胰島素分泌量導(dǎo)致糖耐量受損，且不同于嚙齒類β細(xì)胞具有顯著的增殖能力，因此，促進(jìn)β細(xì)胞增殖似乎并不是預(yù)防人和豬高血糖的重要策略。豬禁食引起血糖水平下降時(shí)伴隨著多種適應(yīng)機(jī)制，包括增加脂肪分解產(chǎn)生脂肪酸和甘油，滿足肝臟糖異生和酮體生成的需求，這幾乎與人的代謝一致。隨著年齡增長，外周組織胰島素抵抗增加，糖耐量下降，血糖和胰島素水平也隨之穩(wěn)定上升。由此可見，豬不僅在大體解剖學(xué)、生理學(xué)、營養(yǎng)代謝和易于肥胖等方面與人相似，其胰腺形態(tài)特征、內(nèi)外分泌細(xì)胞組成和分布、胰島素及腸促胰島素釋放激素同源性等方面亦與人相似，代謝紊亂過程相關(guān)的病理機(jī)制同樣與人相似，是人類胰腺生理和病理學(xué)研究的適宜材料。

4、因此，提供一種靶向編輯豬hnf1a基因的sgrna將為基因編輯豬制備和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種靶向編輯豬hnf1a基因的sgrna及其應(yīng)用。

2、研究發(fā)現(xiàn)，hnf-1a基因全身性敲除、組織特異性敲除或移碼突變均能導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝紊亂，編碼基因第131位精氨酸突變?yōu)榻z氨酸的個(gè)體表現(xiàn)出代謝紊亂，目前尚無該氨基酸突變的動(dòng)物模型。

3、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供一種靶向編輯豬hnf1a基因的sgrna，其是基于crispr-cas9系統(tǒng)的sgrna，sgrna作用位點(diǎn)位于豬hnf1a基因第2外顯子上，sgrna作用位點(diǎn)的dna序列如seq?id?no:2所示。

4、本發(fā)明中，豬hnf1a基因在ncbi中的參考序列編號為nc_010456.5。

5、第二方面，本發(fā)明提供含有所述sgrna的crispr-cas9打靶載體。

6、優(yōu)選地，所述打靶載體的骨架載體為px458。

7、第三方面，本發(fā)明提供一種基于crispr-cas9技術(shù)的豬hnf1a基因編輯載體，包括所述打靶載體和基因同源重組載體；其中，所述基因同源重組載體包含供體dna，所述供體dna包含豬hnf1a基因第2外顯子第391位堿基由c突變?yōu)閠的核苷酸序列。

8、進(jìn)一步地，所述供體dna為雙鏈供體dna或單鏈供體dna。

9、優(yōu)選地，所述雙鏈供體dna包括供體ssodn及其互補(bǔ)ssodn，它們的核苷酸序列分別如seq?id?no:6和7所示。

10、第四方面，本發(fā)明提供一種hnf1a基因點(diǎn)突變豬胎兒成纖維細(xì)胞系，其是將所述基因編輯載體導(dǎo)入豬胎兒成纖維細(xì)胞中得到的。

11、第五方面，本發(fā)明提供所述sgrna、所述打靶載體、所述基因編輯載體或所述細(xì)胞系在制備基因編輯克隆豬中的應(yīng)用。

12、第六方面，本發(fā)明提供一種crispr-cas9介導(dǎo)的豬hnf1a基因點(diǎn)突變的方法，將所述基因編輯載體轉(zhuǎn)入豬胎兒成纖維細(xì)胞中，獲得豬hnf1a基因第2外顯子上第391位堿基由c突變?yōu)閠的細(xì)胞。

13、第七方面，本發(fā)明提供所述細(xì)胞系的以下任一應(yīng)用：

14、1)用于研究豬hnf1a基因的功能；

15、2)用于構(gòu)建hnf1a基因敲除豬；

16、3)用作研究糖脂代謝紊亂疾病的細(xì)胞模型或藥物篩選模型。

17、第八方面，本發(fā)明提供一種利用所述細(xì)胞系所構(gòu)建的hnf1a基因敲除豬在作為研究糖脂代謝紊亂疾病的動(dòng)物模型或藥物篩選模型中的應(yīng)用。

18、借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

19、本發(fā)明根據(jù)人mody3糖尿病特征典型的hnf1a基因突變位點(diǎn)hhnf1a?c.391c>t，經(jīng)同源比對確定豬打靶位點(diǎn)序列，通過基因編輯獲得phnf1a?c.391c>t點(diǎn)突變的豬，該豬的遺傳基礎(chǔ)與人一致。豬在體型大小、解剖學(xué)、生理學(xué)和易于肥胖等方面與人類具有相似性，作為雜食動(dòng)物，豬的消化系統(tǒng)和營養(yǎng)代謝特征與人更相似，適宜于人類糖脂代謝紊亂相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究，相關(guān)診斷方法和治療措施可以直接應(yīng)用于人類。