本發(fā)明涉及一種一鍋級(jí)聯(lián)酶反應(yīng)合成虎杖苷的方法，屬于生物工程及生物合成。

背景技術(shù)：

1、糖苷化對(duì)生物體的正常生命活動(dòng)具有重要意義，它還可以增強(qiáng)天然產(chǎn)物的生物活性與多樣性，進(jìn)而控制生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育。該反應(yīng)也是自然界中最普遍也是最重要的修飾作用之一。研究表明，糖基化有能力改變苷元的藥理作用，并增強(qiáng)其他屬性，制藥行業(yè)越來(lái)越多地采用生物催化糖基化技術(shù)進(jìn)行藥物研發(fā)。

2、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase,gt)是一種促進(jìn)糖苷基從xdp(活性糖苷化合物)轉(zhuǎn)移到其他分子的酶。測(cè)序技術(shù)已經(jīng)在不同的微生物基因組中發(fā)現(xiàn)了許多糖基轉(zhuǎn)移酶(gts)，根據(jù)氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和糖苷連鎖特征，糖基轉(zhuǎn)移酶(gts)已被劃分為117個(gè)家族。然而，只有少數(shù)gts被研究并表征其獨(dú)特的糖基化能力和效率。二苯乙烯是幾種植物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)酚類(lèi)化合物，以其抗氧化和抗炎特性而聞名。二苯乙烯應(yīng)用上突出例子包括白藜蘆醇、桂皮醇和紫檀二苯乙烯。廣泛的研究表明，這些物質(zhì)具有多種健康益處，包括減少炎癥、改善心臟健康和預(yù)防癌癥。

3、白藜蘆醇是虎杖苷的苷元，因其抗癌、抗衰老、抗炎等特性而備受關(guān)注。有研究探討了白藜蘆醇用于治療代謝綜合征的前景，證明了其對(duì)大鼠體重、血壓、血糖水平和胰島素抵抗的影響。然而，由于白藜蘆醇水溶性有限，口服吸收不足限制了治療效果，阻礙了其發(fā)揮作用。為了解決這個(gè)問(wèn)題，一種被稱(chēng)為虎杖苷(白藜蘆醇糖苷)的化合物已被確定為具有優(yōu)異的水溶性。與白藜蘆醇相比，虎杖苷是一種天然化合物，具有優(yōu)越的生物利用度和藥理特性?；⒄溶諏?duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等均有保護(hù)作用，對(duì)肝、腎、肺等器官亦作用明顯,，其調(diào)節(jié)血糖血脂的作用對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化效果顯著；其抗纖維化的作用對(duì)肝、腎保護(hù)效果明顯。雖然白藜蘆醇和虎杖苷具有相同的抗氧化活性，但虎杖苷在清除自由基方面更有效。此外，與白藜蘆醇相比，虎杖苷對(duì)乙型肝炎病毒的抗病毒作用更強(qiáng)，虎杖苷還能有效緩解順鉑的毒副作用。

4、現(xiàn)有的生產(chǎn)虎杖苷的方法主要是利用微生物宿主如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)和解脂耶氏酵母(yarrowia?lipolytica)體內(nèi)生物合成，此方法產(chǎn)率較低。這是由于ugt(udp-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶)的催化能力、酵母細(xì)胞的合成能力以及合成的虎杖苷的抑制作用的限制。此外，用化學(xué)方法將虎杖苷化以生產(chǎn)多聚糖會(huì)遇到立體特異性不足、不良副反應(yīng)、效率不理想和環(huán)境污染等困難。所以，目前亟需一種高效合成虎杖苷的方法，以解決化學(xué)反應(yīng)副產(chǎn)物污染環(huán)境、及利用ugt導(dǎo)致機(jī)制作用等技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的一些問(wèn)題，本發(fā)明提供一鍋級(jí)聯(lián)酶反應(yīng)合成虎杖苷的方法，本發(fā)明以?xún)r(jià)值化為方向，構(gòu)建高效混交糖基轉(zhuǎn)移酶，提供一種利用廉價(jià)的蔗糖與白藜蘆醇生物合成多聚糖并生產(chǎn)虎杖苷的方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一鍋級(jí)聯(lián)酶反應(yīng)合成虎杖苷的方法，所述的方法包括如下步驟：

4、將白藜蘆醇、蔗糖、udp混合，加入tris-hcl緩沖液，將反應(yīng)體系在攪拌狀態(tài)下反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)過(guò)程中通過(guò)分批間歇補(bǔ)料的方式加入糖基轉(zhuǎn)移酶、蔗糖合成酶以及白藜蘆醇，得到虎杖苷；其中所述白藜蘆醇的添加方式為將白藜蘆醇溶解在dmso中，間歇補(bǔ)料添加。

5、進(jìn)一步的，所述糖基轉(zhuǎn)移酶為ugt109a3，氨基酸序列如seq?id?no:1所示；所述蔗糖合成酶為gmsus，氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

6、進(jìn)一步的，所述反應(yīng)體系中中，白藜蘆醇的濃度為0.5-2mm，所述蔗糖的濃度為50-500mm，所述udp的濃度為0.25-5mm，所述dmso的濃度為0-20％，

7、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系中，白藜蘆醇的濃度為1.0mm，所述蔗糖的濃度為400mm，所述udp的濃度為2.5mm，所述dmso的濃度為10％。

8、進(jìn)一步的，所述tris-hcl緩沖液濃度為50mm，ph值為8.0。

9、進(jìn)一步的，所述反應(yīng)體系的ph為5.0-9.0；所述反應(yīng)為攪拌條件下，反應(yīng)溫度為30-70℃。

10、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述反應(yīng)體系的ph值為8.0；所述反應(yīng)的溫度為40℃。

11、進(jìn)一步的，所述白藜蘆醇間歇補(bǔ)料為每間隔3-48h添加一次，優(yōu)選的，在0、3、6、12、18、24、30、36、42和48小時(shí)時(shí)分別加入白藜蘆醇。

12、進(jìn)一步的，所述反應(yīng)過(guò)程中分別在0、12和24小時(shí)時(shí)補(bǔ)充加入ugt109a3酶和gmsus酶。

13、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述gmsus酶和ugt109a3酶的酶活分別為50mu-350mu、25mu-200mu；優(yōu)選為200mu/ml、150mu/ml。

14、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明首先構(gòu)建了糖基轉(zhuǎn)移酶ugt109a3(核苷酸序列如seqid?no.1所示)與大豆蔗糖合成酶(gmsus)(核苷酸序列如seq?id?no.2所示)。在構(gòu)建了兩種酶基因后，本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究了兩種酶在大腸桿菌中表達(dá)的區(qū)域選擇性和特異性，蔗糖合成酶(gmsus)可以將蔗糖和udp轉(zhuǎn)化為udp-葡萄糖，并產(chǎn)生果糖；ugt109a3可以將一個(gè)葡萄糖基獨(dú)家轉(zhuǎn)移到白藜蘆醇的未結(jié)合的c-3羥基上，從而產(chǎn)生虎杖苷。

15、本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，利用單一的蔗糖合成酶(gmsus)催化蔗糖雖然可以獲得udp-葡萄糖，但是由于沒(méi)有不斷地提供供體udp，導(dǎo)致udp-葡萄糖產(chǎn)量低。于是本發(fā)明構(gòu)建了糖基轉(zhuǎn)移酶ugt109a3與蔗糖合成酶(gmsus)偶聯(lián)一鍋級(jí)聯(lián)反應(yīng)，開(kāi)發(fā)并增強(qiáng)了兩種酶偶聯(lián)的人工生物催化級(jí)聯(lián)，在高效合成虎杖苷的同時(shí)連續(xù)再生udp-葡萄糖。

16、本發(fā)明的有益效果：

17、本發(fā)明提供的一鍋級(jí)聯(lián)反應(yīng)方法是目前最高效且最具備價(jià)值化生產(chǎn)虎杖苷的一種合成策略，本發(fā)明利用糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合酶偶聯(lián)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)既可以很好地解決化學(xué)反應(yīng)副產(chǎn)物環(huán)境污染等問(wèn)題，又可以解決以往生物合成中利用ugt109a3導(dǎo)致抑制作用這一自限制，成為高效合成虎杖苷的理想選擇。

18、在等量原料的反應(yīng)條件下，本發(fā)明的偶聯(lián)一鍋級(jí)聯(lián)反應(yīng)與單一酶催化反應(yīng)相比，得到的udp-葡萄糖與虎杖苷的產(chǎn)率有明顯的提高。ugt109a3與gmsus的結(jié)合為天然化合物的糖基化提供了一種有吸引力的方法，因?yàn)樗軌驕p少u(mài)dp-葡萄糖的使用并減輕udp的抑制作用。

19、另一方面，本發(fā)明優(yōu)化了ugt109a3-gmsus生物催化級(jí)聯(lián)的反應(yīng)條件，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，分析純化后的gmsus和ugt109a3不同活性比對(duì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的影響。測(cè)定了不同ph值、溫度、dmso、udp、蔗糖和白藜蘆醇對(duì)白藜蘆醇糖基化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。

20、本發(fā)明進(jìn)一步采用了間歇補(bǔ)料技術(shù)，并通過(guò)調(diào)節(jié)ugt109a3與gmsus的酶比成功獲得高白藜蘆醇轉(zhuǎn)化為虎杖苷的關(guān)鍵參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了高效生產(chǎn)虎杖苷和udp-葡萄糖。

技術(shù)特征：

1.一鍋級(jí)聯(lián)酶反應(yīng)合成虎杖苷的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖基轉(zhuǎn)移酶為ugt109a3，氨基酸序列如seq?id?no:1所示；所述蔗糖合成酶為gmsus，氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系中，白藜蘆醇的濃度為0.5-2mm，所述蔗糖的濃度為50-500mm，所述udp的濃度為0.25-5mm，所述dmso的濃度為0-20％。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系中，白藜蘆醇的濃度為1.0mm，所述蔗糖的濃度為400mm，所述udp的濃度為2.5mm，所述dmso的濃度為10％。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系的ph為5.0-9.0；所述反應(yīng)為攪拌條件下，反應(yīng)溫度為30-70℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系的ph值為8.0；所述反應(yīng)的溫度為40℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述白藜蘆醇間歇補(bǔ)料為每間隔3-48h添加一次。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述白藜蘆醇在0、3、6、12、18、24、30、36、42和48小時(shí)時(shí)分別加入。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)過(guò)程中分別在0、12和24小時(shí)時(shí)加入ugt109a3酶和gmsus酶，所述gmsus酶和ugt109a3酶的酶活分別為50mu-350mu、25mu-200mu。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述gmsus酶和ugt109a3酶的酶活分別為200mu/ml、150mu/ml。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一鍋級(jí)聯(lián)酶反應(yīng)合成虎杖苷的方法，屬于生物工程及生物合成技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先構(gòu)建表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT109A3與大豆蔗糖合成酶GmSUS的表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)得到糖基轉(zhuǎn)移酶和大豆蔗糖合成酶；然后以白藜蘆醇為底物和蔗糖為原料，在酶的催化下合成虎杖苷。本發(fā)明的方法利用糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合酶偶聯(lián)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，一鍋反應(yīng)合成虎杖苷，既可以很好地解決化學(xué)反應(yīng)副產(chǎn)物環(huán)境污染等問(wèn)題，又可以解決以往生物合成中利用UGT導(dǎo)致抑制作用這一自限制，達(dá)到高效合成虎杖苷的目的。

技術(shù)研發(fā)人員：朱道辰,張正昊,高嘉悅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/9