本發(fā)明主要涉及生物，具體是一種特異性區(qū)分滇黃精和湘黃精的引物對、試劑盒及其應用。

背景技術：

1、滇黃精 polygonatum?kingianum?collett?&?hemsl.為歷代《中華人民共和國藥典》中記載的黃精藥材的基原，是云南地區(qū)特有的高品質(zhì)道地藥材。得益于其藥食同源的獨特價值，滇黃精在市場上應用廣泛、需求巨大。湘黃精 polygonatum?hunanense?hui?h.?liu&?b.?z.?wang在外觀上與滇黃精極為相似，加工后的藥材更是難以區(qū)分，市場上混用現(xiàn)象時有發(fā)生。然而，不同黃精的成分和療效存在差異，混用現(xiàn)象影響了臨床用藥的安全性和有效性。因此，亟需開發(fā)一種更精確、有效的方法來鑒定和區(qū)分。

2、當前，紅外光譜技術已用于滇黃精和湘黃精藥材的鑒別，但該技術需要昂貴的設備投入，并且受到實驗條件的限制，這使得其在實際應用中顯得不太方便且缺乏實用性。因此，為了提高鑒別效率并降低成本，有必要探索更為經(jīng)濟實用的鑒別技術。分子標記技術以其方便、快捷和準確性，已成為中藥材鑒定的重要手段。然而，在滇黃精和湘黃精的鑒別中，通用條形碼如its、 trnk-matk、 rbcl、 psba-trnh和 psbk-psbl的特異性不足，鑒別效率低。迫切需要開發(fā)高特異性的dna分子標記，以提高滇黃精和湘黃精鑒別準確性和效率，保障藥品質(zhì)量和療效。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種特異性區(qū)分滇黃精和湘黃精的引物對、試劑盒及其應用。本發(fā)明提供的引物對可特異性區(qū)分滇黃精和湘黃精。

2、本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，通過以下技術方案實現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供了一種特異性區(qū)分滇黃精和湘黃精的引物對，所述引物對包括上游引物f和下游引物r；所述上游引物f的核苷酸序列如sed?id?no.1所示：caagaagaaggggtgatccat；所述下游引物r的核苷酸序列如sed?id?no.2所示：gccccatcgagaaatagaact。

4、本發(fā)明還提供了一種特異性區(qū)分滇黃精和湘黃精的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物對。

5、本發(fā)明還提供了上述引物對或上述試劑盒在區(qū)分滇黃精和湘黃精中的應用。

6、本發(fā)明還提供了一種區(qū)分滇黃精和湘黃精的方法，包括以下步驟：

7、以待測樣品基因組dna為模板，利用上述引物對或上述試劑盒配制pcr反應體系，進行pcr擴增。pcr產(chǎn)物測序后，采用軟件codoncode?aligner?(codoncode?co.,?usa)進行序列拼接及校對。首先，利用該軟件去除序列兩端的引物區(qū)，然后進行測序質(zhì)量評估及預處理，即去除測序結果兩端的低質(zhì)量部分，獲得目標片段的序列參見圖2。若擴增產(chǎn)物的214?-231?bp位置的序列缺失，則待測樣品為滇黃精。若擴增產(chǎn)物的214?-?231?bp位置的序列為attattttactatccata，則待測樣品為湘黃精。

8、優(yōu)選的，所述pcr擴增反應程序包括：95°c預變性3?min；95°c變性30?s，56°c退火1min，72°c延伸1?min，共35個循環(huán)；最后72°c延伸5?min，終止溫度為4°c。

9、優(yōu)選的，所述pcr擴增的反應體系以20?μl計，包括模板dna?2?μl，上、下游引物各1μl，2?×?taq?plus?pcr?mastermix?10?μl，dd?h2o?6?μl。

10、優(yōu)選的，所述上游引物和下游引物額濃度均為10?μmol/l。

11、優(yōu)選的，所述模板的濃度為30?-?100?ng/ul

12、優(yōu)選的，所述2?×?taq?pcr?mastermix購自北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司生產(chǎn)的貨號為dm1220。

13、優(yōu)選的，所述待測樣品包括新鮮組織和/或dna未降解的干品組織。

14、有益效果

15、本發(fā)明提供了一種特異性區(qū)分滇黃精和湘黃精的引物對，所述引物對包括上游引物f和下游引物r；所述上游引物f的核苷酸序列如sed?id?no.1所示：caagaagaaggggtgatccat；所述下游引物r的核苷酸序列如sed?id?no.2所示：gccccatcgagaaatagaact。本發(fā)明對滇黃精和湘黃精的葉綠體全基因組進行測序，發(fā)現(xiàn)3個高度可變位點，包括 rps7-trnv、rpob-trnc和 psbe-petl在這兩個物種中存在顯著差異。本發(fā)明基于上述差異序列設計特異性引物對，并利用上述引物對對滇黃精和湘黃精樣品進行pcr擴增和測序。分析測序結果發(fā)現(xiàn) rps7-trnv序列的引物組prime?1在兩個物種間差異最明顯，可準確鑒定滇黃精和湘黃精。

16、具體地，本發(fā)明所述方法如下：

17、（1）取滇黃精和湘黃精的新鮮葉片/或干燥樣品藥材，加液氮徹底磨碎，采用dneasy?plant?maxi?試劑盒（qiagen，巴倫西亞，加利福尼亞州，美國）提取待測黃精葉片的總dna。

18、（2）以步驟（1）提取的dna為模板，以所述分子特異性標記引物（a-f、a-r）作為擴增引物，進行pcr擴增。

19、pcr反應體系每20?μl組成如下：

20、

21、pcr擴增條件如下：

22、95°c預變性3?min；95°c變性30?s，56°c退火1?min，72°c延伸1?min，共35個循環(huán)；最后72°c延伸5?min，終止溫度為4°c。

23、（3）取步驟（2）的擴增產(chǎn)物5?μl，點樣于1%的瓊脂糖凝膠上，以dna分子量標準（dl2000?dna?marker）作為dna?marker，于1×tae緩沖液中進行電泳，電壓及電泳時間分別設置為110?v、40?min。電泳結束后將瓊脂糖凝膠置于紫外凝膠成像分析儀上顯影，電泳結果出現(xiàn)明顯且清晰的dna條帶，則可以進一步將pcr擴增產(chǎn)物進行測序。采用軟件codoncodealigner?(codoncode?co.,?usa)進行序列拼接及校對。首先，利用該軟件去除序列兩端的引物區(qū)，然后進行測序質(zhì)量評估及預處理，即去除測序結果兩端的低質(zhì)量部分，獲得目標片段的序列參見圖2。若擴增產(chǎn)物的214?-?231?bp位置的序列缺失，則待測樣品為滇黃精。若擴增產(chǎn)物的214?-?231?bp位置的序列為attattttactatccata，則待測樣品為湘黃精。

24、本發(fā)明提供了一種特異性區(qū)分滇黃精和湘黃精的引物對，所述引物對包括上游引物f和下游引物r；所述上游引物f的核苷酸序列如sed?id?no.1所示：caagaagaaggggtgatccat；所述下游引物r的核苷酸序列如sed?id?no.2所示：gccccatcgagaaatagaact。本發(fā)明對滇黃精和湘黃精的葉綠體全基因組進行測序，

25、發(fā)現(xiàn)3個高度可變位點，包括 rps7-trnv、rpob-trnc和 psbe-petl在這兩個物種中存在顯著差異。本發(fā)明基于上述差異序列設計特異性引物對，并利用上述引物對對滇黃精和湘黃精樣品進行pcr擴增和測序。分析測序結果發(fā)現(xiàn) rps7-trnv序列的引物組prime?1在兩個物種間差異最明顯，可準確鑒定滇黃精和湘黃精