本技術(shù)涉及細(xì)胞工程，具體涉及一種sirt6永生化hucmscs及其構(gòu)建方法、sirt6外囊泡及其提取方法。

背景技術(shù)：

1、人間充質(zhì)干細(xì)胞(human?mesenchymal?stem?cells，hmscs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)hmscs在骨關(guān)節(jié)炎(oa)修復(fù)中具有較大的潛力。然而研究過程中發(fā)現(xiàn)，在hmscs長期離體培養(yǎng)過程中，容易出現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定性、染色體結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞增殖能力下降、細(xì)胞衰老嚴(yán)重等問題。針對上述問題，研究人員經(jīng)過多年努力，通過基因操作實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的永生化。

2、外囊泡(evs)是由hmscs產(chǎn)生的雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡，作為細(xì)胞通信的重要介質(zhì)，evs能夠攜帶蛋白質(zhì)、rna和其他生物大分子，參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的多種生理和病理過程。由于evs具有低免疫原性、穩(wěn)定性高、可以自然穿越生物屏障的特性，其已成為治療oa等疾病最有吸引力的選擇。然而，用于oa疾病等臨床治療所需的evs的數(shù)量通常較高，并且現(xiàn)有的evs治療效果一般。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了實(shí)現(xiàn)hucmscs的永生化，并且增強(qiáng)evs在oa等疾病方面的治療效率，本技術(shù)提供一種sirt6永生化hucmscs及其構(gòu)建方法、sirt6外囊泡及其提取方法。

2、第一方面，本技術(shù)提供一種sirt6永生化hucmscs的構(gòu)建方法，采用如下的技術(shù)方案：

3、一種sirt6永生化hucmscs的構(gòu)建方法，包括以下步驟：hucmscs的提取與培養(yǎng)、永生化hucmscs的構(gòu)建、sirt6永生化hucmscs的構(gòu)建；

4、所述永生化hucmscs的構(gòu)建采用的永生化基因?yàn)閠ert基因，所述sirt6永生化hucmscs的構(gòu)建采用的基因?yàn)閟irt6。

5、本技術(shù)提供了一種sirt6永生化hucmscs的構(gòu)建方法，上述構(gòu)建方法首先通過tert慢病毒載體介導(dǎo)hucmscs進(jìn)行tert過表達(dá)，解決了hucmscs在體外培養(yǎng)過程中端粒逐漸縮短導(dǎo)致細(xì)胞衰老和生長停滯問題，從而獲得了一種與hucmscs的遺傳穩(wěn)定性與功能特性一致的、近乎無限增殖的永生化hucmscs；然后通過sirt6慢病毒載體介導(dǎo)永生化hucmscs進(jìn)行sirt6過表達(dá)，獲得了一種與hucmscs的遺傳穩(wěn)定性與功能特性一致的、近乎無限增殖的、且能夠過表達(dá)sirt6的sirt6永生化hucmscs。sirt6作為一種脫乙酰酶，在調(diào)控衰老、dna修復(fù)、代謝穩(wěn)態(tài)及抗炎癥過程中能夠發(fā)揮關(guān)鍵作用，本技術(shù)提供的sirt6永生化hucmscs能夠過表達(dá)sirt6，因此在骨關(guān)節(jié)炎(oa)的病理生理學(xué)中能夠通過多種機(jī)制發(fā)揮保護(hù)作用，減緩軟骨細(xì)胞的老化、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)抗炎反應(yīng)以及保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨免受破壞，利用上述sirt6永生化hucmscs能夠提取富含過表達(dá)sirt6的sirt6外囊泡，sirt6外囊泡不僅攜帶有促進(jìn)組織修復(fù)和抗炎癥的分子，還具備更高的生物活性和治療效率，為oa的非細(xì)胞治療策略提供了新的視角。綜上，本技術(shù)通過兩次慢病毒介導(dǎo)的基因修飾方法，成功建立了一種可無限增殖、能夠過表達(dá)sirt6的sirt6永生化hucmscs，為oa的非細(xì)胞治療策略提供了新的視角。

6、可選地，所述永生化hucmscs的構(gòu)建方法包括以下步驟：將hucmscs接種至培養(yǎng)板，依次加入tert慢病毒、完全培養(yǎng)基、陽離子聚合物，培養(yǎng)48±2h；然后更換含有嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選與擴(kuò)增，獲得永生化hucmscs。

7、可選地，所述sirt6永生化hucmscs的構(gòu)建方法包括以下步驟：將永生化hucmscs接種至培養(yǎng)板，依次加入sirt6慢病毒、完全培養(yǎng)基、陽離子聚合物，培養(yǎng)48±2h；然后更換含有滅瘟素s的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選與擴(kuò)增，傳代5代后不再添加抗生素；當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度80％以上時(shí)，按照1：5比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，獲得sirt6永生化hucmscs。

8、可選地，所述hucmscs和永生化hucmscs的接種密度均為3.5×105個(gè)/孔；所述完全培養(yǎng)基為αmem完全培養(yǎng)基；所述含有嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中嘌呤霉素的濃度為3-5μg/ml，所述含有滅瘟素s的完全培養(yǎng)基中滅瘟素s的濃度為1.5-2.5μg/ml。

9、可選地，所述永生化hucmscs和sirt6永生化hucmscs的構(gòu)建步驟中，加入陽離子聚合物的同時(shí)補(bǔ)充完全培養(yǎng)基，使得陽離子聚合物的終濃度為5-7μg/ml。

10、可選地，所述tert慢病毒的滴度為(7-9)×108tu/ml，所述tert慢病毒、完全培養(yǎng)基的體積比為1：(20-25)；所述滅瘟素s的滴度為(0.8-1.5)×109tu/ml，所述tert慢病毒、完全培養(yǎng)基的體積比為1：(33-38)。

11、第二方面，本技術(shù)提供一種sirt6永生化hucmscs的構(gòu)建方法獲得的sirt6永生化hucmscs。

12、第三方面，本技術(shù)提供一種sirt6外囊泡，所述sirt6外囊泡通過對sirt6永生化hucmscs進(jìn)行提取獲得。

13、本技術(shù)通過對sirt6永生化hucmscs進(jìn)行提取，從而獲得了富含特定治療因子的sirt6外囊泡，該sirt6外囊泡不僅攜帶有促進(jìn)組織修復(fù)和抗炎癥的分子，還具備更高的生物活性和治療效率，為oa的非細(xì)胞治療策略提供了新的視角。

14、第四方面，本技術(shù)提供一種sirt6外囊泡的提取方法。

15、一種sirt6外囊泡的提取方法，包括以下步驟：對sirt6永生化hucmscs培養(yǎng)，待融合度達(dá)到70％以上，去上清；沉淀用pbs洗滌，并加入αmem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48±2h，取上清液于離心管，經(jīng)離心，獲得sirt6外囊泡。

16、可選地，所述離心步驟具體為：

17、s1.將上清液在4℃、2000×g下離心10±2min，取上清液①；

18、s2.將上清液①在4℃、1000×g下離心30±5min，取上清液②；

19、s3.將上清液②在4℃、110000×g下超速離心70±10min，棄上清液；

20、s4.取沉淀并加入pbs重懸，在4℃、110000×g下超速離心70±10min，取沉淀，獲得sirt6外囊泡。

21、本技術(shù)提供的sirt6外囊泡的提取方法中，通過離心步驟s1去除培養(yǎng)上清液中的死細(xì)胞和大碎片，通過離心步驟s2去除培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞器和小顆粒，通過離心步驟s3和s4獲取培養(yǎng)上清液中sirt6外囊泡。

22、本技術(shù)中，術(shù)語“hucmscs”表示人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；術(shù)語“永生化hucmscs”表示tert過表達(dá)的永生化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；術(shù)語“sirt6永生化hucmscs”表示tert與sirt6過表達(dá)的永生化人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；術(shù)語“sirt6外囊泡”表示sirt6永生化hucmscs提取獲得的外囊泡；術(shù)語“原代外囊泡”表示原代hucmscs提取獲得的外囊泡。

23、綜上所述，本技術(shù)具有以下有益效果：

24、1.本技術(shù)首先通過慢病毒載體介導(dǎo)tert過表達(dá)，解決了細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中端粒逐漸縮短導(dǎo)致細(xì)胞衰老和生長停滯問題，進(jìn)而獲得了一種能夠無限增殖的永生化hucmscs，且該永生化hucmscs能夠保持hucmscs細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性和功能特性；然后通過二次慢病毒感染引入sirt6基因，獲得一種可無限增殖、能夠過表達(dá)sirt6的sirt6永生化hucmscs，進(jìn)一步提高h(yuǎn)ucmscs在oa等疾病方面治療效果。

25、2.本技術(shù)構(gòu)建的sirt6永生化hucmscs與原代hucmscs具有相似的細(xì)胞表型與多項(xiàng)分化潛能，通過實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)，第60代的sirt6永生化hucmscs并沒有明出現(xiàn)明顯的細(xì)胞衰老現(xiàn)象，并且其sirt6蛋白表達(dá)水平顯著高于原代hucmscs。

26、3.本技術(shù)通過對sirt6永生化hucmscs進(jìn)行提取分離，能夠獲得富含過表達(dá)sirt6的sirt6外囊泡，該sirt6外囊泡不僅攜帶有促進(jìn)組織修復(fù)和抗炎癥的分子，還具備較高的生物活性和治療效率，為oa等疾病的非細(xì)胞治療策略提供了新的視角。

27、4.本技術(shù)中，對sirt6永生化hucmscs提取獲得的sirt6外囊泡的形態(tài)、粒徑大小和表面標(biāo)志物均與hucmscs提取獲得的原代外囊泡的形態(tài)、粒徑大小和表面標(biāo)志物均相似，并且sirt6外囊泡的sirt6蛋白裝載量顯著高于原代外囊泡。