本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)的，具體涉及鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法。

背景技術：

1、隨著生命科學與醫(yī)療技術的蓬勃發(fā)展，干細胞因其特有的分化、增殖及組織修復潛能，使其在生物醫(yī)藥產業(yè)中的作用日趨顯現(xiàn)。無論是從全球干細胞相關公司數量、市值的大幅增長，或是美國食品藥物管理局（fda）接受以干細胞申請的臨床案件的逐年上升等情況來看，均顯示出干細胞治療已成為國際生物科技產業(yè)重點發(fā)展項目。此外，基于干細胞的培養(yǎng)肉的出現(xiàn)，也為干細胞應用開辟了新的方向，無論是干細胞治療，還是干細胞的其他應用，首先要解決的都是其大規(guī)模培養(yǎng)問題。

2、鹿茸是目前所知的唯一能夠完全再生的哺乳動物器官，且其生長速度可達2cm/d。鹿茸完全再生和快速生長能力主要由于鹿茸干細胞的存在。經鑒定，鹿茸干細胞為介于胚胎干細胞和間充質干細胞之間的一種特殊的干細胞類型。與目前所常用的骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞等干細胞相比，鹿茸干細胞更易于獲取，增殖速度快，具有更大的自我更新能力，分泌大量的細胞因子和生物活性因子。因此，可以作為優(yōu)秀的細胞來源，在組織器官損傷等領域進行應用。但是，目前鹿茸干細胞的穩(wěn)定傳代及大規(guī)模培養(yǎng)尚屬空白，因此，建立鹿茸干細胞的穩(wěn)定傳代及大規(guī)模培養(yǎng)技術十分必要。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對如何解決鹿茸干細胞的穩(wěn)定傳代和擴大規(guī)模培養(yǎng)問題，提供了一種鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法。

2、為實現(xiàn)其目的，本發(fā)明采用以下技術方案：鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，具體包括如下步驟：

3、s1、鹿茸干細胞的分離培養(yǎng)：鹿茸干細胞來源于健康公鹿生茸區(qū)骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質層組織；

4、s2、鹿茸干細胞的原代培養(yǎng)：

5、s2.1、取出s1步驟中的鹿茸干細胞，清洗、切割；

6、s2.2、轉入并在離心管中消化、離心棄上清液，加dmem原代培養(yǎng)液洗去消化液，離心、棄上清液，收集沉淀；

7、s2.3、取步驟s2.2中獲得的沉淀，置于培養(yǎng)箱中先培養(yǎng)，當細胞達到70-80%匯合，將細胞用胰蛋白酶進行消化，收集細胞，獲得原代鹿茸干細胞，凍存?zhèn)溆茫?/p>

8、s3、鹿茸干細胞的傳代培養(yǎng)：對步驟s2中獲得的細胞進行傳代培養(yǎng)，將能夠穩(wěn)定傳代的細胞進行連續(xù)傳代至20-50代，建立細胞株，并對每一代細胞分別進行凍存；對不能夠順利傳代的細胞進行永生化處理，獲得永生化的鹿茸干細胞細胞株；

9、s4、建立鹿茸干細胞大規(guī)模培養(yǎng)體系：

10、s4.1、在三維培養(yǎng)體系中細胞馴化；

11、s4.2、利用生物反應器進行3d培養(yǎng)。

12、優(yōu)選的，所述步驟s1中，采集鹿生茸區(qū)骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質組織后置于5-10倍體積的運輸液中。

13、優(yōu)選的，所述步驟s2.1中，使用pbs溶液反復清洗直至完全去除血污，切割成0.5-1mm3的碎塊。

14、優(yōu)選的，所述步驟s2.2中，所使用消化液為50-100u/mlⅰ型膠原酶溶液，在37℃條件下緩慢震蕩進行消化，當組織碎塊邊緣出現(xiàn)毛刷樣毛邊時，停止消化；所述原代培養(yǎng)液為dmem培養(yǎng)基中，含10-15%?fbs，5-10%鹿血清，1-2%雙抗。

15、優(yōu)選的，所述步驟s2.3中，所述沉淀均勻涂在t25的細胞培養(yǎng)瓶底部，倒置培養(yǎng)瓶并加入dmem原代培養(yǎng)液，置于37℃，5%co2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4h，輕輕正置培養(yǎng)瓶繼續(xù)靜置培養(yǎng)3-7d。

16、優(yōu)選的，所述步驟s3中，使用的傳代培養(yǎng)液：傳代培養(yǎng)基為含5-10%fbs，含1%雙抗的dmem培養(yǎng)液和mtesrtm1培養(yǎng)基組成，其中mtesrtm1培養(yǎng)基所占體積為培養(yǎng)液總體積的30-80%，mtesrtm1為間充質干細胞專用無血清培養(yǎng)基。

17、優(yōu)選的，所述步驟s3中，永生化鹿茸干細胞株的制備方法為：

18、s3.1、構建?sv40t?抗原病毒載體：將表達?sv40t?抗原基因的逆轉錄病毒載體和包裝載體共轉染人胚腎?293?細胞系?hek293，包裝出表達?sv40t?抗原的逆轉錄病毒；

19、s3.2、慢病毒轉染：將不能穩(wěn)定傳代的鹿茸干細胞的原代細胞傳至第2-?3?代，添加含3-?4μg/ml?聚凝胺的逆轉錄病毒，病毒滴度為?1×10?8tu/ml，感染?2?天后，換液并在培養(yǎng)液中添加?0.3-?0.4mg/ml?的潮霉素?b?篩選?14?天，形成篩選后的干細胞集落；s3.3、傳代：將篩選后的干細胞集落擴增并進行連續(xù)傳至?30?代以上，即得到永生化的鹿茸干細胞系，凍存?zhèn)溆谩?/p>

20、優(yōu)選的，所述步驟s3.2，使細胞密度為?3-5×10?3?/ml，0.3-0.5ml/cm2?培養(yǎng)面積添加逆轉錄病毒。

21、優(yōu)選的，所述步驟s4.1中，復蘇鹿茸干細胞種子細胞于傳代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1代復壯；然后更換為3d培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1代后，培養(yǎng)方式更改為與微載體結合的三維培養(yǎng)。

22、進一步優(yōu)選的，所述步驟s4.2中，當步驟s4.1中2d培養(yǎng)的細胞長至80%左右匯合時，胰酶消化，獲得單細胞懸液；同時準備無菌處理的生物反應器，向其培養(yǎng)室投入微載體，投入密度1.5-2.5g/l，加入適當體積的3d培養(yǎng)基溶脹微載體至少10分鐘；然后將單細胞懸液以0.5-5×107/g的比例接種入反應器，補充足夠的培養(yǎng)基；啟動反應器開始培養(yǎng)，day?0采用間隔式培養(yǎng)，即40-60rpm?5min,?0rpm?25min,?48次循環(huán)；day?1?改用恒速模式，轉速為40-60rpm，確保微組織均勻懸??；培養(yǎng)至day?4-5時，收獲細胞；將微載體連同培養(yǎng)基收集到無菌容器中，靜止沉降2-3min，或179×g低速離心，使微載體沉于容器底部，吸棄上清，用無菌的pbs?洗2次，加入少量胰酶消化1-3分鐘，然后加入含血清培養(yǎng)基終止消化，然后加入等體積的1mg/ml?的3d?flotrix?digest裂解液，混勻，置于37℃水浴鍋裂解10-30min，裂解過程中可以吹打加速微載體裂解，裂解結束后，1000rpm離心5min，收集細胞，125ml?mini生物反應器可收獲10億個單細胞。

23、本發(fā)明的有益效果：

24、利用本發(fā)明中的傳代培養(yǎng)體系，不僅可以提高鹿茸干細胞的增殖速度，而且可以防止鹿茸干細胞聚集生長，形成克隆。與普通培養(yǎng)基相比，鹿茸干細胞的倍增時間明顯縮短。普通培養(yǎng)液（10%fbs，含1%雙抗的dmem培養(yǎng)液）培養(yǎng)鹿茸干細胞株，倍增時間為（21h-24h），發(fā)明中的傳代培養(yǎng)基培養(yǎng)鹿茸干細胞，其倍增時間為（18h-20h)。鹿茸干細胞用微載體培養(yǎng)常出現(xiàn)微載體消化不掉，收集細胞困難的問題，利用本發(fā)明中的3d培養(yǎng)基進行鹿茸干細胞的微載體培養(yǎng)，同時采用細胞消化與微載體消化結合，可以避免微載體被鹿茸干細胞包裹后，消化困難的問題，可以收獲單細胞懸液。

技術特征：

1.鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

2.根據權利要求1所述的鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s1中，采集鹿生茸區(qū)骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質組織后置于5-10倍體積的運輸液中。

3.根據權利要求1所述的鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s2.1中，使用pbs溶液反復清洗直至完全去除血污，切割成0.5-1mm3的碎塊。

4.根據權利要求1所述的鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s2.2中，所使用消化液為50-100u/mlⅰ型膠原酶溶液，在37℃條件下緩慢震蕩進行消化，當組織碎塊邊緣出現(xiàn)毛刷樣毛邊時，停止消化；所述原代培養(yǎng)液為dmem培養(yǎng)基中，含10-15%fbs，5-10%鹿血清，1-2%雙抗。

5.根據權利要求1所述的鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s2.3中，所述沉淀均勻涂在t25的細胞培養(yǎng)瓶底部，倒置培養(yǎng)瓶并加入dmem原代培養(yǎng)液，置于37℃，5%co2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4h，輕輕正置培養(yǎng)瓶繼續(xù)靜置培養(yǎng)3-7d。

6.根據權利要求1所述的鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s3中，使用的傳代培養(yǎng)液：傳代培養(yǎng)基為含5-10%fbs，含1%雙抗的dmem培養(yǎng)液和mtesrtm1培養(yǎng)基組成，其中mtesrtm1培養(yǎng)基所占體積為培養(yǎng)液總體積的30-80%，mtesrtm1為間充質干細胞專用無血清培養(yǎng)基。

7.根據權利要求1所述的鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s3.2中，使細胞密度為?3-5×10?3?/ml，0.3-0.5ml/cm2?培養(yǎng)面積添加逆轉錄病毒。

8.根據權利要求1所述的鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s4.1中，復蘇鹿茸干細胞種子細胞于傳代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1代復壯；然后更換為3d培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1代后，培養(yǎng)方式更改為與微載體結合的三維培養(yǎng)。

9.根據權利要求8所述的鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟s4.2中，當步驟s4.1中2d培養(yǎng)的細胞長至80%左右匯合時，胰酶消化，獲得單細胞懸液；同時準備無菌處理的生物反應器，向其培養(yǎng)室投入微載體，投入密度1.5-2.5g/l，加入適當體積的3d培養(yǎng)基溶脹微載體至少10分鐘；然后將單細胞懸液以0.5-5×107/g的比例接種入反應器，補充足夠的培養(yǎng)基；啟動反應器開始培養(yǎng)，day?0?采用間隔式培養(yǎng)，即40-60rpm5min,?0rpm?25min,?48次循環(huán)；day?1?改用恒速模式，轉速為40-60rpm，確保微組織均勻懸??；培養(yǎng)至day?4-5時，收獲細胞；將微載體連同培養(yǎng)基收集到無菌容器中，靜止沉降2-3min，或179×g低速離心，使微載體沉于容器底部，吸棄上清，用無菌的pbs?洗2次，加入少量胰酶消化1-3分鐘，然后加入含血清培養(yǎng)基終止消化，然后加入等體積的1mg/ml?的3dflotrix?digest裂解液，混勻，置于37℃水浴鍋裂解10-30min，裂解過程中可以吹打加速微載體裂解，裂解結束后，1000rpm離心5min，收集細胞，125ml?mini生物反應器可收獲10億個單細胞。

技術總結
本發(fā)明公開了鹿茸干細胞株的建立及其擴大培養(yǎng)方法，屬于干細胞培養(yǎng)的技術領域。具體包括如下步驟：鹿茸干細胞的分離培養(yǎng)；鹿茸干細胞的原代培養(yǎng)；鹿茸干細胞的傳代培養(yǎng)；建立鹿茸干細胞大規(guī)模培養(yǎng)體系：在三維培養(yǎng)體系中細胞馴化；利用生物反應器進行3D培養(yǎng)。利用本發(fā)明中的傳代培養(yǎng)體系，不僅可以提高鹿茸干細胞的增殖速度，而且可以防止鹿茸干細胞聚集生長，形成克隆。與普通培養(yǎng)基相比，鹿茸干細胞的倍增時間明顯縮短。

技術研發(fā)人員：孫紅梅,李勛勝,呂金朋,岳志剛,王大濤
受保護的技術使用者：中國農業(yè)科學院特產研究所
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/9/9