本發(fā)明涉及一種人源化abca4點突變的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病小鼠模型的構建方法及其應用，屬于分子生物學與生物醫(yī)學。

背景技術：

1、基因編輯技術是一種可以對基因組特定目的基因序列進行插入、刪除、替換等較精確修飾的技術。其中2013年左右出現(xiàn)的crispr/cas9系統(tǒng)是繼zfn、talens等基因編輯技術推出后的第三代基因編輯技術，更是以其效率高、成本低和方便易操作等優(yōu)勢迅速成為基因編輯領域研究的熱點。crispr/cas9基因編輯技術就是通過人工設計的sgrna(guiderna)來識別目的基因組序列，并引導cas9蛋白酶進行有效切割dna雙鏈，形成雙鏈斷裂(double?strand?break，dsb)。dsb可以通過兩種途徑被修復，一種是非同源重組的末端接合(non-homologous?end?joining，nhej)方式，另一種是同源重組修復(homologydirected?repair，hdr)方式，后者可以通過導入同源片段作為修復模板生成基因敲除或敲入等，最終達到對基因組dna進行修飾的目的。

2、遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病(irds)是一組臨床和遺傳上異質性很強的變性疾病，是一大類導致不可逆的視力喪失和失明的遺傳性眼疾，其中包含了rp、lca、chm、usher綜合癥、stargardt(眼底黃色斑點癥)、色盲、x連鎖視網(wǎng)膜劈裂癥等。irds的發(fā)生多是由于一種或多種基因的突變導致視網(wǎng)膜感光細胞死亡而引起的。迄今為止，已有270多個致病基因中多個突變位點與irds相關。但是由于irds的遺傳異質性較強，例如，已顯示prom1基因的突變會導致色素性視網(wǎng)膜炎(rp)，但也會導致stargardt病；此外，比較特殊的是abca4突變的患者所存在的廣泛視網(wǎng)膜病變，包含了從stargardt病到視錐細胞營養(yǎng)不良以及rp。這種極端的遺傳異質性會導致基因檢測出現(xiàn)約30％的失敗率。盡管如此，由于眼睛的解剖學和功能特性，視網(wǎng)膜依舊是基因治療的首選器官，雖然從臨床前的動物模型到人類的轉化方法存在很多困難，但通過基因編輯進行治療的方案依然具備潛力。

3、a4型atp結合盒轉運蛋白(abca4)的基因突變與多種形式的irds相關，包括stargardt病(stgd)、視錐視桿細胞營養(yǎng)不良(crd)和視網(wǎng)膜色素變性(rp)。abca4是一個相當大的基因座，包含50個外顯子，已被鑒定出2000多種不同嚴重程度和類型的致病變異。因此abca4視網(wǎng)膜病具有較高的臨床和遺傳異質性，診斷該基因相關的視網(wǎng)膜疾病也具有很大的挑戰(zhàn)性。abca4相關疾病的最早記錄表現(xiàn)為中央靶眼型黃斑營養(yǎng)不良，逐漸進展為黃斑區(qū)的脈絡膜視網(wǎng)膜萎縮，伴有粗糙圓形色素沉著和周邊受累范圍擴大。大多數(shù)患者至少攜帶一種被分類為“嚴重”的突變，其中最常見的是p.n965s變異，此前在丹麥abca4相關視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良患者中高頻率發(fā)現(xiàn)。此外，在小鼠模型中abca4的p.n965s突變也會導致abca4蛋白表達水平下降，部分錯誤定位到光感受器的內質網(wǎng)(er)，缺乏n-視黃亞甲基磷脂酰乙醇胺(n-ret-pe)激活的atp酶活性，并導致小鼠的視力受損，自發(fā)熒光和與視網(wǎng)膜色素上皮細胞中脂褐素沉積相關的雙視黃醇類a2e增加。

4、基于abca4基因和irds的上述特征，雖然現(xiàn)有的技術已有abca4基因敲除和abca4基因p.n965s自發(fā)突變的小鼠模型的相關報道，但由于irds的遺傳復雜性，上述小鼠模型雖然可以和人表現(xiàn)出類似的視網(wǎng)膜病變和功能損失，但由于基因組序列的不同，上述的小鼠動物模型很難用于irds的基因治療方面的研究中。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種制備遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病非人哺乳動物模型的方法，所述方法包括：將所述動物同源染色體中的內源性abca4基因的部分序列替換為人源的abca4基因的同源序列；所述abca4基因片段為發(fā)生c.2894a>g(p.asn965ser)位點變異的人源abca4基因第19外顯子后54nt序列。

2、在本發(fā)明的一種實施方式中，使用crispr/cas9系統(tǒng)將所述內源性abca4基因部分序列敲除，并用所述abca4基因同源序列替換敲除的內源性abca4基因部分序列；

3、在本發(fā)明的一種實施方式中，其中所述crispr/cas9系統(tǒng)包括sgrna和cas9酶，sgrna序列為seq?id?no.1所示；所述人源的abca4基因的同源序列核苷酸序列如seq?idno.3所示，所述小鼠來源abca4基因的部分序列的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。所述發(fā)生c.2894a>g(p.asn965ser)位點變異的人源abca4基因第19外顯子后54nt序列如seq?idno.5所示。

4、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述人源abca4基因替換敲除的內源性abca4基因的方法為同源重組。

5、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述人源abca4基因兩側添加左側同源臂和右側同源臂以實現(xiàn)同源重組。

6、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因敲除和人源abca4基因替換處理的對象為受精卵的內源性abca4基因。

7、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述crispr/cas9系統(tǒng)和所述人源abca4基因轉入所述受精卵的方法為顯微注射。

8、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法還包括將處理后受精卵移植到假孕雌性動物體內并產出f0代，將正確表達人源abca4基因的f0代動物與野生型動物交配獲得f1代。

9、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述非人哺乳動物為嚙齒類動物。

10、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述非人哺乳動物是小鼠(musmusculus)。

11、本發(fā)明還提供了使用上述方法構建的人源化abca4基因點突變小鼠模型在研究irds致病機理中的應用。

12、本發(fā)明還提供了使用上述方法構建的人源化abca4基因點突變小鼠模型在研究irds基因治療方法中的應用。

13、本發(fā)明提供了一種stargardt病小鼠模型，所述小鼠模型為，將引入了a>g突變的人源abca4基因19外顯子后54nt的同源序列敲入小鼠的基因組上，敲入位點為小鼠基因組上的abca4基因19號外顯子后半段；所述引入了a>g突變的人源abca4基因19外顯子后54nt的同源序列如seq?id?no.5所示，所述abca4基因19號外顯子后半段如seq?id?no.4所示。

14、本發(fā)明提供了一種stargardt病小鼠模型的構建方法，所述包括如下步驟：

15、(1)基因的制備

16、合成ncbi編號為nm_007378.1的小鼠abca4基因；合成引入了a>g突變的ncbi編號為：nm_000350.3的人源abca4基因19外顯子后54nt的同源序列，序列如seq?id?no.5所示；

17、(2)打靶載體的構建：

18、利用高保真taqdna聚合酶，從連接有小鼠abca4基因的bca載體上，擴增出含有小鼠基因組片段的同源臂；將擴增得到的同源臂片段、seq?id?no.5所示的基因片段、氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因依次組裝到靶向載體中，構建用于基因打靶的重組載體；

19、(3)stargardt病小鼠模型的構建

20、將seq?id?no.1所示的sgrna序列、純化的cas9蛋白、步驟(2)得到的所述重組載體混合后得到的rnp注射復合物，將rnp注射復合物注入到小鼠受精卵中，將所述受精卵移植到代孕小鼠體內，產出小鼠并進行基因型鑒定；

21、選出整合了外源基因的f0代小鼠與野生型小鼠雜交，得到整合了外源基因的f1代小鼠；

22、將得到的f1代雜合的雌雄小鼠進行同型交配，得到整合了外源基因的f2代小鼠；

23、從f2代小鼠中選出純合突變的雌鼠和雄鼠進行同型純合交配，得到的f3代均是純合小鼠；部分序列人源化的abca4基因點突變的純合小鼠。

24、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述靶向載體為donor質粒。

25、本發(fā)明提供了一種制備abca4基因點突變小鼠模型的方法，所述方法包括：將小鼠基因組上的動物同源染色體中的內源性abca4基因中的seq?id?no.4所示的序列替換為seqidno.5所示的序列；所述seq?id?no.4所示的序列為abca4基因19號外顯子后半段；所述seqid?no.5所示的序列為引入a>g突變的人源的abca4基因19外顯子后54nt的同源序列。

26、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法具體包括如下步驟：

27、(1)基因的制備

28、合成ncbi編號為nm_007378.1的小鼠abca4基因；合成引入了a>g突變的ncbi編號為：nm_000350.3的人源abca4基因19外顯子后54nt的同源序列，序列如seq?id?no.5所示；

29、(2)打靶載體的構建：

30、利用高保真taqdna聚合酶，從連接有小鼠abca4基因的bca載體上，擴增出含有小鼠基因組片段的同源臂；將擴增得到的同源臂片段、seq?id?no.5所示的基因片段、氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因依次組裝到靶向載體中，構建用于基因打靶的重組載體；

31、(3)stargardt病小鼠模型的構建

32、將seq?id?no.1所示的sgrna序列、純化的cas9蛋白、步驟(2)得到的所述重組載體混合后得到的rnp注射復合物，將rnp注射復合物注入到小鼠受精卵中，將所述受精卵移植到代孕小鼠體內，產出小鼠并進行基因型鑒定；

33、選出整合了外源基因的f0代小鼠與野生型小鼠雜交，得到整合了外源基因的f1代小鼠；

34、將得到的f1代雜合的雌雄小鼠進行同型交配，得到整合了外源基因的f2代小鼠；

35、從f2代小鼠中選出純合突變的雌鼠和雄鼠進行同型純合交配，得到的f3代均是純合小鼠；部分序列人源化的abca4基因點突變的純合小鼠。

36、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述seq?id?no.1所示的sgrna序列的合成方法為：首先人工合成crrna(crispr?rna，序列為：aaccaaaucacggcguuccu)序列(idt公司)和tracrrna(trans-activating?crrna，序列為：guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu)序列(金斯瑞生物科技股份有限公司)。crrna將會與tracrrna結合形成sgrna序列。

37、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述rnp注射復合物為，按照在rnase-free水中，添加crrna、tracrna混勻孵育，之后再加入cas9蛋白(neb，貨號：m0646m)混勻孵育得到管1溶液；再將donor質粒(即步驟1制備得到的打靶載體)稀釋為終濃度為15?ng/ul，得到管2溶液；

38、最后將管1溶液和管2溶液混合得到rnp注射復合物。

39、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述crrna、tracrna、cas9蛋白按照體積比為4：3：1的比例添加。

40、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述rnp注射復合物為，按照在5.2ul?rnase-free水中加入0.8ul?100pmol/ul的crrna，再加入0.6ul?100pmol/ul的tracrna混勻孵育5min，之后再加入0.2ul?cas9蛋白(neb，貨號：m0646m)混勻孵育10min得到管1溶液，再將donor質粒(即步驟1制備得到的打靶載體)稀釋為終濃度為15ng/ul得到管2溶液；最后將管1溶液和管2溶液混合得到rnp注射復合物。

41、本發(fā)明還提供了一種打靶載體，所述打靶載體為，利用高保真taqdna聚合酶，從連接有ncbi編號為nm_007378.1的小鼠abca4基因的bca載體上，擴增出含有小鼠基因組片段同源臂；將擴增得到的同源臂片段、seq?id?no.5所示的基因片段、氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因依次組裝到靶向載體中得到的。

42、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述靶向載體為donor質粒。

43、本發(fā)明還提供了一種用于在abca4基因19號外顯子后半段中定點敲入人源基因的crispr/cas9系統(tǒng)，所述crispr/cas9系統(tǒng)包含上述打靶載體，所述abca4基因19號外顯子后半段序列如seq?id?no.4所示。

44、本發(fā)明還提供了一種獲得敲入人源基因的小鼠的方法，飼養(yǎng)上述方法構建的人源基因敲入的模型小鼠。

45、本發(fā)明還提供了上述小鼠模型，或上述方法得到的小鼠模型在制備鑒別和/或測試遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病的藥物中的用途。

46、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥物用于預防和/或治療的適應癥為遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病、和/或治療與遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病相關的并發(fā)癥。

47、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病為stargardt病。

48、有益效果

49、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點：

50、(1)本發(fā)明提供了一種人源化abca4基因點突變小鼠模型的構建方法，應用該方法構建的小鼠模型可以穩(wěn)定傳代，為研究abca4基因突變與遺傳性視網(wǎng)膜疾病的關系及其致病機理提供了便捷、可靠、經(jīng)濟的手段。

51、(2)在人類患者研究材料不易獲得且受醫(yī)學倫理制約的情況下，本發(fā)明提供的小鼠模型將成為abca4n965s/n965s突變相關的遺傳性視網(wǎng)膜疾病研究中的重要工具。

52、(3)本發(fā)明提供的小鼠模型在致病機理、治療方法、藥物篩選等方面的研究中提供可穩(wěn)定遺傳的有效研究模型，尤其是在基于基因編輯的治療方法中提供了含有突變的與人同源的序列且不改變氨基酸序列的abca4n965s/n965s純合點突變的小鼠模型。

53、(4)本發(fā)明的構建方法為獲得與人類abca4基因p.asn965ser致病突變相近的小鼠模型提供了便利，為研究人類中abca4n965s/n965s突變的相關因素和診斷治療提供了基礎。

54、(5)本發(fā)明對該動物模型進行了一系列表型檢測，其中電生理(erg)檢測顯示感光細胞功能受損；眼底自發(fā)熒光檢測(faf)出自發(fā)熒光增強，可能是脂褐質沉積造成的；h&e染色結果顯示視網(wǎng)膜厚度減少，以上病理學背景非常符合stgd的疾病表型，更適合于作為irds中stgd的動物模型。