本發(fā)明涉及維生素k2菌株，具體為一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法。
背景技術(shù)：
1、維生素k2是一種脂溶性維生素，它在人體內(nèi)具有重要的生理功能，尤其是在骨骼健康和血液凝固等方面起著重要作用。由于人體無法自行合成維生素k2，因此需要通過食物或補(bǔ)充劑來攝入。隨著對維生素k2重要性的認(rèn)識不斷提高，其市場需求也在逐漸增加。
2、維生素k2的主要生產(chǎn)技術(shù)是通過微生物發(fā)酵法獲得。這種方法利用了某些微生物(如植物乳桿菌和大腸桿菌等)能夠在發(fā)酵過程中產(chǎn)生維生素k2的特性。如202010562405.x提出的一種采用微生物發(fā)酵法制備維生素k2的方法，其能夠很好地滿足維生素k2發(fā)酵在生長及合成等各階段對培養(yǎng)條件的不同需求，促進(jìn)菌體生長及產(chǎn)物合成，能夠非常有效地提高維生素k2的發(fā)酵水平，所得發(fā)酵產(chǎn)物中維生素k2含量較高。
3、然而對于維生素k2菌株的培養(yǎng)多采用發(fā)酵的方法進(jìn)行，單純采用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵效率低，菌株生長的速度慢，需要話費(fèi)較多周期，由于核輻射誘變法在育種方向的突破，使其可以改變菌株的基因，在短時間內(nèi)創(chuàng)造成可以快速生長和代謝的菌種，使得菌株在發(fā)酵的過程中更快更多的分泌出維生素k2，而且市面上缺少上述方法，因此亟需提出利用核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法來滿足市場需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，具備增加維生素k2的制備效率和產(chǎn)量的優(yōu)點(diǎn)，解決了對于維生素k2菌株的培養(yǎng)多采用發(fā)酵的方法進(jìn)行，單純采用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵效率低，菌株生長的速度慢，需要話費(fèi)較多周期，由于核輻射誘變法在育種方向的突破，使其可以改變菌株的基因，在短時間內(nèi)創(chuàng)造成可以快速生長和代謝的菌種，使得菌株在發(fā)酵的過程中更快更多的分泌出維生素k2，而且市面上缺少上述方法的問題。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，包括如下步驟：
3、步驟一、取黃桿菌hna12-d接種在斜面培養(yǎng)基內(nèi)，用劑量為400-1200gy的γ射線對培養(yǎng)基內(nèi)的黃桿菌進(jìn)行輻射30-90min，劑量率為15-30gy/min；
4、步驟二、將裝有黃桿菌的培養(yǎng)基放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)，進(jìn)行20-60天的恢復(fù)培養(yǎng)，將光照培養(yǎng)箱的溫度控制在20-30℃；
5、步驟三、將經(jīng)過輻射處理的黃桿菌接種在三角細(xì)胞搖瓶中，對接種后的黃桿菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，放大培養(yǎng)完成之后，將黃桿菌以4000-5000rpm離心處理10-15min，取出上浮的清液，下層沉淀作為黃桿菌菌種；
6、步驟四、以核輻射誘變后的黃桿菌菌種為出發(fā)菌種，將黃桿菌培養(yǎng)在平板培養(yǎng)基a中，培養(yǎng)溫度為35-40℃，培養(yǎng)時間為2-5天；
7、步驟五、將活化好的黃桿菌菌種采用生理鹽水稀釋90倍，菌液中菌體濃度保持在每毫升含100-120個細(xì)胞，將平皿放入低能離子注入機(jī)的靶室中進(jìn)行n+注入，注入能量為15kev，劑量為2.0×1015n+/cm2；
8、步驟六、以真空環(huán)境下未接受離子注入的樣品作為對照；離子注入輻照后，在超凈工作臺上用1ml無菌生理鹽水分別洗脫處理樣品和對照樣品，將洗脫得到的菌液用微量移液器分別取0.1ml菌液均勻涂布在初篩平板培養(yǎng)基b上培養(yǎng)；
9、步驟七、待長出單菌落后進(jìn)行菌落計數(shù)并挑取生長速度快，直徑大的菌落，接入發(fā)酵培養(yǎng)基b上搖瓶發(fā)酵，得到維生素k2菌株。
10、優(yōu)選地，步驟一中黃桿菌hna12-d的提取量為20-40ml，斜面培養(yǎng)基的容量為60ml，γ射線對培養(yǎng)基內(nèi)的黃桿菌進(jìn)行輻射過程中對培養(yǎng)基進(jìn)行旋轉(zhuǎn)處理。
11、優(yōu)選地，恢復(fù)培養(yǎng)時每天進(jìn)行12小時的光照和12小時的遮光處理，光照處理的強(qiáng)度為1200-1500lux。
12、優(yōu)選地，放大培養(yǎng)過程中培養(yǎng)溫度設(shè)置在30-45℃，每天依次進(jìn)行12小時的光照處理和12小時的遮光處理，光照處理的強(qiáng)度為1200-2800lux，培養(yǎng)時間為12-20天。
13、優(yōu)選地，培養(yǎng)基a由葡萄糖15-20g/l、馬鈴薯浸出液180-220g/l，甘油5-8g/l，瓊脂20-30g/l成分制備。
14、優(yōu)選地，培養(yǎng)基b由葡萄糖15-18g/l、馬鈴薯浸出液150-180g/l、甘油2-5g/l、瓊脂10-20g/l、1.4-二羥基-2-萘甲酸60-80mg/l成分制備。
15、優(yōu)選地，培養(yǎng)基c由甘油10-15g/l、蛋白胨10-20g/l、酵母提取物1.5-3g/l、mgso40.3-1g/l、k2hpo44.5-6g/l、nacl3-8g/l成分制備。
16、優(yōu)選地，步驟五中將黃桿菌菌種放置于平皿中，將平皿放入低溫空氣等離子體放電裝置中，抽真空到30pa時開始等離子體放電，電源為13.56mhz的射頻電源，功率為360w，放電20分鐘后放入過濾后的無菌空氣恢復(fù)柜內(nèi)壓力。
17、優(yōu)選地，步驟七中對黃桿菌菌種進(jìn)行洗脫處理，將洗脫得到的菌液用微量移液器分別取0.1ml菌液均勻涂布在初篩平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在35℃下倒置培養(yǎng)3天，待長出單菌落后進(jìn)行菌落計數(shù)并挑取生長速度快，直徑大的菌落，接入發(fā)酵培養(yǎng)基。
18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請的技術(shù)方案具備以下有益效果：
19、1、本發(fā)明采用核輻射誘變法進(jìn)行維生素k2菌種進(jìn)行培養(yǎng)，核輻射誘變法縮短培養(yǎng)進(jìn)程，能夠誘發(fā)維生素k2菌種出現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目上的變異，促成易位系及非速倍體的發(fā)生，可促成原生質(zhì)體非對稱細(xì)胞融合，提高外源基因整合程度，提高轉(zhuǎn)化效率。
20、2、本發(fā)明解決了對于維生素k2菌株的培養(yǎng)多采用發(fā)酵的方法進(jìn)行，單純采用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵效率低，菌株生長的速度慢，需要話費(fèi)較多周期，由于核輻射誘變法在育種方向的突破，使其可以改變菌株的基因，在短時間內(nèi)創(chuàng)造成可以快速生長和代謝的菌種，使得菌株在發(fā)酵的過程中更快更多的分泌出維生素k2，而且市面上缺少上述方法的問題。
1.一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，其特征在于，所述步驟一中黃桿菌hna12-d的提取量為20-40ml，所述斜面培養(yǎng)基的容量為60ml，所述γ射線對培養(yǎng)基內(nèi)的黃桿菌進(jìn)行輻射過程中對培養(yǎng)基進(jìn)行旋轉(zhuǎn)處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，其特征在于，所述恢復(fù)培養(yǎng)時每天進(jìn)行12小時的光照和12小時的遮光處理，光照處理的強(qiáng)度為1200-1500lux。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，其特征在于，所述放大培養(yǎng)過程中培養(yǎng)溫度設(shè)置在30-45℃，每天依次進(jìn)行12小時的光照處理和12小時的遮光處理，光照處理的強(qiáng)度為1200-2800lux，培養(yǎng)時間為12-20天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基a由葡萄糖15-20g/l、馬鈴薯浸出液180-220g/l，甘油5-8g/l，瓊脂20-30g/l成分制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基b由葡萄糖15-18g/l、馬鈴薯浸出液150-180g/l、甘油2-5g/l、瓊脂10-20g/l、1.4-二羥基-2-萘甲酸60-80mg/l成分制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基c由甘油10-15g/l、蛋白胨10-20g/l、酵母提取物1.5-3g/l、mgso40.3-1g/l、k2hpo44.5-6g/l、nacl3-8g/l成分制備。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，其特征在于，所述步驟五中將黃桿菌菌種放置于平皿中，將平皿放入低溫空氣等離子體放電裝置中，抽真空到30pa時開始等離子體放電，電源為13.56mhz的射頻電源，功率為360w，放電20分鐘后放入過濾后的無菌空氣恢復(fù)柜內(nèi)壓力。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核輻射誘變法制備維生素k2菌株的方法，其特征在于，所述步驟七中對黃桿菌菌種進(jìn)行洗脫處理，將洗脫得到的菌液用微量移液器分別取0.1ml菌液均勻涂布在初篩平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在35℃下倒置培養(yǎng)3天，待長出單菌落后進(jìn)行菌落計數(shù)并挑取生長速度快，直徑大的菌落，接入發(fā)酵培養(yǎng)基。