本發(fā)明涉及生物檢測，具體而言，涉及snp位點(diǎn)基因型的檢測方法及其試劑盒。

背景技術(shù)：

1、單核苷酸多態(tài)性（single?nucleotide?polymorphism，snp）是發(fā)生在基因組中特定位點(diǎn)單核苷酸上的?dna?變異，這使得同一位點(diǎn)存在兩種或多種等位基因，是人類最普遍的遺傳變異形式之一。該變異在人類基因組中的發(fā)生頻率比較高（通常大于1%），平均每500到1000個(gè)堿基對(duì)中就有一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。snp與遺傳疾病密切相關(guān)，對(duì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，決定人類表型和調(diào)節(jié)代謝過程具有重要影響，它解釋了復(fù)雜表型中可遺傳的個(gè)體間差異和基因與疾病的關(guān)系，與疾病易感性、疾病發(fā)病機(jī)制和藥物反應(yīng)個(gè)體差異有關(guān)，因此對(duì)snp進(jìn)行檢測可以促進(jìn)早期遺傳疾病的診斷、預(yù)防和治療，在臨床診斷中具有指導(dǎo)作用。

2、目前對(duì)基因多態(tài)性檢測的方法有測序法、taqman探針?biāo)夥?、pcr-relf、擴(kuò)增阻滯pcr法，分子信標(biāo)法以及高分辨率熔解曲線法等。其中taqman探針法作為臨床應(yīng)用中最常見的檢測方法，具有簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，但該方法僅在一個(gè)維度即利用熒光改變產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測分析，一個(gè)snp位點(diǎn)需要設(shè)計(jì)兩條兩端帶有不同熒光標(biāo)記的特異探針來識(shí)別不同的等位基因，對(duì)于多重檢測，由于熒光通道的限制只能用于少量snp位點(diǎn)的分析，難以區(qū)分多靶標(biāo)，且對(duì)于距離較近的snp位點(diǎn)探針設(shè)計(jì)比較困難。

3、多色熔解曲線分析技術(shù)在多色熒光的基礎(chǔ)上結(jié)合了熔解曲線分析，在兩個(gè)維度即熒光改變和tm值進(jìn)行檢測分析，實(shí)現(xiàn)一個(gè)通道多重檢測。該方法利用探針與大量dna單鏈雜交產(chǎn)生的tm值進(jìn)行熔解曲線分析，因此使用不對(duì)稱pcr，通過調(diào)整上下游引物濃度比例，獲取大量與熒光探針互補(bǔ)的單鏈產(chǎn)物，將不對(duì)稱擴(kuò)增與dna熔解溫度結(jié)合，從而形成熔解曲線特征峰。該方法規(guī)避了其他方法多重檢測時(shí)的pcr儀熒光通道限制，具有通量大、操作簡單、成本低、精度可靠等優(yōu)點(diǎn)。但目前多色熔解曲線分析技術(shù)仍面臨著眾多挑戰(zhàn)，由于不對(duì)稱擴(kuò)增屬于線性擴(kuò)增，而非指數(shù)擴(kuò)增易出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)量低，靈敏度低的問題，同時(shí)，上下游引物比例難于優(yōu)化，設(shè)計(jì)難度較大。非對(duì)稱熔曲使用的分子信標(biāo)在反應(yīng)中經(jīng)歷發(fā)夾結(jié)構(gòu)、游離單鏈、雜交雙鏈、游離單鏈的過程，熒光信號(hào)由弱到強(qiáng)和由強(qiáng)到弱兩部分，容易出現(xiàn)基線不平、倒峰等問題。

4、目前將非對(duì)稱熔解曲線在snp基因分型中應(yīng)用很廣泛，該方法將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)于探針上，由于探針沒有選擇性，一個(gè)snp位點(diǎn)僅設(shè)計(jì)一條探針區(qū)分兩個(gè)基因型，利用同一熒光通道的探針與單鏈結(jié)合的單堿基tm值實(shí)現(xiàn)基因型的區(qū)分。對(duì)于atgc>gc的突變tm值差異容易區(qū)分，但對(duì)于a>t的突變探針結(jié)合的tm差異較小，基因型難以辨別，且因?yàn)樘结槣囟群蛦瓮ǖ纼蓚€(gè)峰的限制，一個(gè)熒光通道最多設(shè)計(jì)2-3個(gè)snp位點(diǎn)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的兩條特異性修飾引物，分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，利用不同熒光通道中的熔解曲線峰區(qū)分同一snp位點(diǎn)的基因型，對(duì)tm值不作區(qū)分，可以重疊，因此對(duì)于a>t的突變通過熒光通道的不同即可區(qū)分。對(duì)不同的snp位點(diǎn)，通過控制兩條引物之間的擴(kuò)增子長度和gc含量進(jìn)行tm值區(qū)分，通過不同熔解曲線tm值區(qū)分不同snp位點(diǎn)，因此使可檢測的snp位點(diǎn)增多。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供snp位點(diǎn)基因型的檢測方法，所述方法包括以下步驟：

2、步驟1：針對(duì)含有一個(gè)待測snp位點(diǎn)的靶標(biāo)設(shè)計(jì)三條擴(kuò)增引物：一條突變型引物，一條野生型引物和一條共用引物；所述突變型引物和所述共用引物配合用于擴(kuò)增突變型模板，所述野生型引物和所述共用引物配合用于擴(kuò)增野生型模板；所述突變型引物3’末端堿基與突變型模板中snp位點(diǎn)堿基互補(bǔ)或相同，所述野生型引物3’末端堿基與野生型模板中snp位點(diǎn)堿基互補(bǔ)或相同；

3、所述突變型引物tm值和所述野生型引物tm值相差±2℃之內(nèi)，如果所述突變型引物tm值和所述野生型引物長度相同，所述突變型引物和所述野生型引物除3’末端堿基不同之外，其余部分堿基相同；如果所述突變型引物tm值和所述野生型引物長度不相同，所述突變型引物和所述野生型引物除3’末端堿基不同之外，所述突變型引物和所述野生型引物中長度長的引物5’末端比長度短的引物5’末端多1個(gè)或2個(gè)堿基，所述突變型引物和所述野生型引物其余部分堿基相同；

4、步驟2：用不同熒光通道的兩種熒光分別標(biāo)記所述突變型引物和所述野生型引物，所述兩種熒光在核酸單鏈中熒光發(fā)射低沒有熒光，在核酸雙鏈中發(fā)射高有熒光；

5、步驟3：使用標(biāo)記后的突變型引物、野生型引物和所述共用引物pcr擴(kuò)增含有待測snp位點(diǎn)的靶標(biāo)，在pcr延伸階段形成帶有熒光標(biāo)記的雙鏈產(chǎn)物，擴(kuò)增時(shí)，所述突變型引物的物質(zhì)量和野生型引物的物質(zhì)量之和與所述共用引物的物質(zhì)量相等，進(jìn)行對(duì)稱pcr擴(kuò)增；

6、步驟4：擴(kuò)增階段完成后，隨著溫度的升高，?擴(kuò)增子雙鏈逐漸解鏈?zhǔn)篃晒庑盘?hào)強(qiáng)度隨之減弱，形成不同熒光通道的熔曲峰；

7、步驟5：根據(jù)不同熒光通道的熔曲峰結(jié)果判讀所述待測snp位點(diǎn)的基因型。

8、在本發(fā)明中突變型引物tm?值和野生型引物?tm?值相差+2℃之內(nèi)，因?yàn)閮蓷l引物只有?3”末端單堿基的差異，tm?值相差超過2℃，在同一退火溫度下擴(kuò)增效率會(huì)有差異，可能出現(xiàn)引物交叉擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)，即擴(kuò)增效率高的引物不僅擴(kuò)增自身完美配對(duì)的模板，還會(huì)競爭性的擴(kuò)增另一個(gè)只有單堿基差異的模板，所以本發(fā)明中突變型引物tm?值和野生型引物tm?值相差+2℃之內(nèi)。

9、在一種實(shí)施方中，提供一種多個(gè)snp位點(diǎn)基因型同時(shí)檢測的方法，所述方法包括以下步驟：

10、步驟1：針對(duì)含有多個(gè)待測snp位點(diǎn)中每一個(gè)待測snp位點(diǎn)的靶標(biāo)分別設(shè)計(jì)三條擴(kuò)增引物：一條突變型引物，一條野生型引物和一條共用引物；所述突變型引物和所述共用引物配合用于擴(kuò)增突變型模板，所述野生型引物和所述共用引物配合用于擴(kuò)增野生型模板；所述突變型引物3’末端堿基與突變型模板中snp位點(diǎn)堿基互補(bǔ)或相同，所述野生型引物3’末端堿基與野生型模板中snp位點(diǎn)堿基互補(bǔ)或相同；每一個(gè)待測snp位點(diǎn)的靶標(biāo)擴(kuò)增子的tm值彼此之間不同，并且是可區(qū)分的；

11、每一個(gè)待測snp位點(diǎn)的所述突變型引物tm值和所述野生型引物tm值相差±2℃之內(nèi)，如果所述突變型引物tm值和所述野生型引物長度相同，所述突變型引物和所述野生型引物除3’末端堿基不同之外，其余部分堿基相同；如果所述突變型引物tm值和所述野生型引物長度不相同，所述突變型引物和所述野生型引物除3’末端堿基不同之外，所述突變型引物和所述野生型引物中長度長的引物5’末端比長度短的引物5’末端多1個(gè)或2個(gè)堿基，所述突變型引物和所述野生型引物其余部分堿基相同；

12、步驟2：用不同熒光通道的兩種熒光分別標(biāo)記每一個(gè)待測snp位點(diǎn)的所述突變型引物和所述野生型引物，所述兩種熒光在核酸單鏈中熒光發(fā)射低沒有熒光，在核酸雙鏈中發(fā)射高有熒光；

13、步驟3：使用標(biāo)記后的突變型引物、野生型引物和所述共用引物pcr擴(kuò)增含有待測snp位點(diǎn)的靶標(biāo)，在pcr延伸階段形成帶有熒光標(biāo)記的雙鏈產(chǎn)物，擴(kuò)增時(shí)，每一個(gè)待測snp位點(diǎn)的所述突變型引物的物質(zhì)量和野生型引物的物質(zhì)量之和與所述共用引物的物質(zhì)量相等，進(jìn)行對(duì)稱pcr擴(kuò)增；

14、步驟4：擴(kuò)增階段完成后，隨著溫度的升高，?擴(kuò)增子雙鏈逐漸解鏈?zhǔn)篃晒庑盘?hào)強(qiáng)度隨之減弱，形成不同熒光通道的熔曲峰和不同tm值的熔曲峰；

15、步驟5：對(duì)形成的熔曲峰進(jìn)行結(jié)果判讀，對(duì)每一個(gè)待測snp位點(diǎn)的基因型通過熒光通道的不同進(jìn)行區(qū)分，對(duì)不同的待測snp位點(diǎn)通過tm值的差異進(jìn)行區(qū)分。

16、在一種實(shí)施方中，所述突變型引物tm值和/或所述野生型引物tm值為55-65℃。

17、在一種實(shí)施方中，每一個(gè)待測snp位點(diǎn)的所述突變型引物的物質(zhì)量、野生型引物的物質(zhì)量與所述共用引物的物質(zhì)量之比為1:1:2。

18、在一種實(shí)施方中，每一個(gè)待測snp位點(diǎn)的擴(kuò)增子的tm值為50℃-90℃。

19、在一種實(shí)施方中，不同待測snp位點(diǎn)的擴(kuò)增子的tm值彼此之間相差2℃-10℃。

20、在一種實(shí)施方中，不同待測snp位點(diǎn)的擴(kuò)增子的tm值彼此之間相差5℃。

21、在一種實(shí)施方中，提供一種在上述方法中使用的試劑盒。

22、在一種實(shí)施方中，提供一種使用上述方法檢測葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒，所述試劑盒同時(shí)檢測mthfr基因c677t位點(diǎn)和a1298c位點(diǎn)，檢測c677t位點(diǎn)的野生型引物序列為seq?id?no.1:?gagaaggtgtctgcgggagc，突變型引物序列為seq?id?no.2:gagaaggtgtctgcgggagt，和共用引物序列為seq?id?no.3:?tcacctggatgggaaagatcc；和所述mthfr基因a1298c位點(diǎn)的野生型引物序列為seq?id?no.4:?ggaggagctgaccagtgaaga，突變型引物序列為seq?id?no.5:?ggaggagctgaccagtgaagc，和共用引物序列為seq?id?no.6:cccgagaggtaaagaacgaagac。

23、傳統(tǒng)非對(duì)稱熔曲將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)于探針上，利用一條熒光通道探針的tm值差異區(qū)分野生型和突變型，對(duì)于atgc>gc的突變tm值差異容易區(qū)分，但對(duì)于a>t的突變探針結(jié)合的tm差異較小，基因型難以區(qū)分。目前將非對(duì)稱熔解曲線在snp基因分型中應(yīng)用很廣泛，該方法將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)于探針上，由于探針沒有選擇性，一個(gè)snp位點(diǎn)僅設(shè)計(jì)一條探針區(qū)分兩個(gè)基因型，利用同一熒光通道的探針與單鏈結(jié)合的單堿基tm值實(shí)現(xiàn)基因型的區(qū)分。對(duì)于atgc>gc的突變tm值差異容易區(qū)分，但對(duì)于a>t的突變探針結(jié)合的tm差異較小，基因型難以辨別，且因?yàn)樘结槣囟群蛦瓮ǖ纼蓚€(gè)峰的限制，一個(gè)熒光通道最多設(shè)計(jì)2-3個(gè)snp位點(diǎn)。

24、本發(fā)明設(shè)計(jì)的兩條特異性修飾引物，分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，利用不同熒光通道中的熔解曲線峰區(qū)分同一snp位點(diǎn)的基因型，對(duì)tm值不作區(qū)分，可以重疊，因此對(duì)于a>t的突變通過熒光通道的不同即可區(qū)分。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)兩條與各自野生/突變模板匹配的不同熒光通道的探針，區(qū)分同一snp位點(diǎn)的基因型野生型和突變型，規(guī)避了tm值區(qū)分不開問題，降低了設(shè)計(jì)難度，使檢測的靶標(biāo)位點(diǎn)使a>t堿基突變特異性區(qū)分得以實(shí)現(xiàn)。

25、對(duì)不同的snp位點(diǎn)，通過控制兩條引物之間的擴(kuò)增子長度和gc含量進(jìn)行tm值區(qū)分，通過不同熔解曲線tm值區(qū)分不同snp位點(diǎn)，因此使可檢測的snp位點(diǎn)增多。非對(duì)稱熔曲使用的分子信標(biāo)在反應(yīng)中經(jīng)歷發(fā)夾結(jié)構(gòu)、游離單鏈、雜交雙鏈、游離單鏈的過程，熒光信號(hào)由弱到強(qiáng)和由強(qiáng)到弱兩部分，容易出現(xiàn)基線不平、倒峰等問題。本發(fā)明突變型引物和野生型引物使用本公司商品化的不同熒光通道的rqa修飾，無需淬滅基團(tuán)，可選為bf490/rqa、bf533/rqa、bf590/rqa、bf648/rqa，突變型引物和野生型引物可以是上述四種修飾中的任意兩種組合。本發(fā)明使用的熒光在非結(jié)構(gòu)化的單鏈中熒光發(fā)射較低沒有熒光，雙鏈具有較強(qiáng)的熒光，只有由強(qiáng)到弱的熒光變化，因此基線平滑穩(wěn)定、無倒峰。本發(fā)明中，單雙鏈變化產(chǎn)生的熒光增加通過熔解曲線分析區(qū)分實(shí)現(xiàn)僅由單個(gè)堿基不同的序列。本發(fā)明利用擴(kuò)增阻滯原理，即擴(kuò)增時(shí)在dna?聚合酶作用下，必須在引物?3’末端堿基與模板完美配對(duì)的情況下才能進(jìn)行有效的聚合反應(yīng)，否則延伸反應(yīng)會(huì)因?3’，5’-磷酸二酯鍵形成障礙而受阻，不能進(jìn)行延伸，而與模板完全匹配的引物體系則可以持續(xù)延伸，因此將?snp?位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物的?3’末端，使突變模板與野生模板區(qū)分開來。將本公司熒光產(chǎn)品與擴(kuò)增阻滯原理結(jié)合，完美配對(duì)時(shí)延伸造成的單雙鏈變化產(chǎn)生的熒光增加形成熔解曲線，實(shí)現(xiàn)單堿基區(qū)分。

26、現(xiàn)有多色熔解曲線方案為擴(kuò)增出與探針互補(bǔ)結(jié)合的單鏈dna，采用不對(duì)稱pcr，使上下游引物濃度比例不等，擴(kuò)增出的大量單鏈dna與探針雜交進(jìn)行熔解曲線分析。本發(fā)明采用對(duì)稱擴(kuò)增，通過設(shè)計(jì)兩條特異性修飾引物（同方向）和一條共用引物（反方向），兩條修飾引物的比例與共用引物相同，等比例上下游引物擴(kuò)增后形成帶有熒光標(biāo)記的產(chǎn)物。本發(fā)明采用對(duì)稱擴(kuò)增，利用特異性修飾引物與共用引物等比例進(jìn)行擴(kuò)增，避免了非對(duì)稱方法的線性擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增，從而提高擴(kuò)增子產(chǎn)量和靈敏度。

27、非對(duì)稱熔曲由于探針溫度和tm區(qū)分基因型的限制，每個(gè)通道的可檢靶標(biāo)受限，本發(fā)明根據(jù)擴(kuò)增子的tm值不同，只對(duì)不同snp位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分，對(duì)基因型不作區(qū)分，每個(gè)tm值代表一個(gè)snp位點(diǎn)，增加了單一熒光通道可檢測靶標(biāo)數(shù)量，使可檢測靶標(biāo)數(shù)大大增加。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次提出了利用不同熒光通道中的熔解曲線峰區(qū)分同一snp位點(diǎn)的基因型，設(shè)計(jì)不同熔解曲線tm值區(qū)分不同snp位點(diǎn)的方法。本發(fā)明在pcr擴(kuò)增后直接對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行熔解曲線分析，具有通量大、操作簡單、精度可靠等優(yōu)點(diǎn)。