本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工，具體涉及點(diǎn)擊型共價(jià)藥物，腫瘤胞外、內(nèi)酸響應(yīng)兩親性聚合物及區(qū)域選擇性遞送系統(tǒng)、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥免疫治療藥物是激活病人自身免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤細(xì)胞，從而消除腫瘤。通過(guò)干預(yù)腫瘤免疫環(huán)中不同的階段，多種治療策略被用于臨床治療癌癥病人，如治療性疫苗，細(xì)胞療法以及免疫檢查點(diǎn)療法。然而，腫瘤一方面通過(guò)降低免疫原性、上調(diào)免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子(如pd-l1、ido等)逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別，另一方面通過(guò)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、相關(guān)巨噬細(xì)胞和膠原蛋白等組成致密的胞外基質(zhì)形成“物理屏障”，限制腫瘤特異性t細(xì)胞的浸潤(rùn)，二者協(xié)同導(dǎo)致腫瘤免疫耐受，臨床單一治療響應(yīng)率低。此外，現(xiàn)有腫瘤免疫治療策略難以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)、外區(qū)域選擇性調(diào)控，是導(dǎo)致臨床治療響應(yīng)率較低的另一個(gè)重要原因。因此，針對(duì)區(qū)域選擇調(diào)控腫瘤胞內(nèi)、外靶點(diǎn)這一臨床關(guān)鍵挑戰(zhàn)，同時(shí)克服其“生物”、“物理”屏障，促進(jìn)腫瘤特異性t細(xì)胞浸潤(rùn)，提高響應(yīng)率的治療策略，具有重要臨床意義。目前，非小分子抗腫瘤藥物存在水溶性差、藥動(dòng)力學(xué)性質(zhì)較差、親和力較低和缺乏靶向性。小分子共價(jià)抑制劑相比于非共價(jià)抑制劑具有提高生物化學(xué)效率和效力，延長(zhǎng)作用持續(xù)時(shí)間，延長(zhǎng)藥物藥代動(dòng)力學(xué)，降低劑量和給藥頻率等優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)的非共價(jià)抑制劑相比，非共價(jià)抑制劑依靠疏水作用、氫鍵與靜電相互作用與靶蛋白可逆地結(jié)合，這些作用力強(qiáng)度弱于共價(jià)化學(xué)鍵，因此共價(jià)抑制劑的藥效強(qiáng)度往往強(qiáng)于非共價(jià)抑制劑。然而，相比于更容易開發(fā)的激酶小分子共價(jià)抑制劑，直接靶向腫瘤細(xì)胞的小分子共價(jià)抑制劑至今仍未被報(bào)道。小分子共價(jià)抑制劑靶向天然氨基酸殘基(半胱氨酸、絲氨酸、酪氨酸、賴氨酸以及精氨酸和谷氨酸)的傳統(tǒng)共價(jià)策略可能會(huì)引起強(qiáng)烈的毒副作用。此外，氨基酸在蛋白質(zhì)，細(xì)胞和體內(nèi)的普遍存在給實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)靶標(biāo)的反應(yīng)選擇性帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。因此，開發(fā)共價(jià)小分子藥物的關(guān)鍵在于在反應(yīng)性和選擇性之間取得適當(dāng)?shù)钠胶?。為了能夠產(chǎn)生用于體內(nèi)靶向腫瘤的小分子共價(jià)藥物，需要一種新的策略來(lái)設(shè)計(jì)小分子共價(jià)抑制劑的化學(xué)反應(yīng)性，該化學(xué)反應(yīng)性是生物相容的，并且對(duì)靶標(biāo)具有高度特異性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于以上背景，本發(fā)明的目的是利用點(diǎn)擊化學(xué)和腫瘤胞內(nèi)、外酸激活兩親性嵌段聚合物設(shè)計(jì)開發(fā)了區(qū)域選擇性遞送系統(tǒng)，該遞送系統(tǒng)由可點(diǎn)擊型共價(jià)藥物和腫瘤胞內(nèi)、外酸響應(yīng)兩親性嵌段聚合物共組裝形成納米粒；該納米粒在腫瘤胞外、內(nèi)酸環(huán)境中次序激活釋放負(fù)載的可點(diǎn)擊型共價(jià)藥物以及其他聯(lián)合治療藥物。首先，在腫瘤胞外微酸環(huán)境下釋放出可點(diǎn)擊藥物，與預(yù)先疊氮標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)特異性抑制腫瘤胞外靶點(diǎn)；待納米粒被細(xì)胞攝取后，胞內(nèi)酸激活藥物釋放，調(diào)控胞內(nèi)靶點(diǎn)；二者協(xié)同對(duì)腫瘤實(shí)現(xiàn)區(qū)域選擇性調(diào)控。

2、實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的具體技術(shù)方案是：

3、一類點(diǎn)擊型共價(jià)藥物，所述點(diǎn)擊型共價(jià)藥物能夠與疊氮標(biāo)記的靶蛋白發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)形成共價(jià)鍵，其具有以下式1所示結(jié)構(gòu)：

4、

5、其中，

6、r1為膜蛋白抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑或化療藥物，具有如下結(jié)構(gòu)：

7、

8、linker為r1與羰基之間的連接鏈，選自以下結(jié)構(gòu)中的任意一種，

9、

10、其中，n為1-20任意整數(shù)，優(yōu)選地為2-10的整數(shù)。

11、一種所述點(diǎn)擊型共價(jià)藥物的制備方法，該方法具體包含如下步驟，通過(guò)以下反應(yīng)路線i所示的酯化反應(yīng)合成所述的點(diǎn)擊型共價(jià)藥物：

12、

13、??????????????????????????????

14、其中，linker，r1如權(quán)利要求1所述；

15、步驟a：氮雜環(huán)形炔linker衍生物即dbco-linker的合成

16、將羧基氮雜環(huán)形炔、linker、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及n，n-二異丙基乙胺以摩爾比為1∶2∶2∶2∶2的比例溶于二氯甲烷中，得到質(zhì)量濃度為20-40％w/v的溶液；在無(wú)水條件下，室溫反應(yīng)24h，反應(yīng)產(chǎn)物用薄層色譜法純化，得到氮雜環(huán)形炔linker衍生物即dbco-linker；

17、

18、步驟b：點(diǎn)擊型共價(jià)藥物的合成

19、將r1、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽及n，n-二異丙基乙胺以摩爾比為1∶2∶2∶2或?qū)1、三乙胺及三光氣以摩爾比為1∶1.5∶0.3溶于無(wú)水二氯甲烷或二甲基亞砜中制得40％w/v溶液b，反應(yīng)1.5h；取所述步驟a中得到的氮雜環(huán)形炔linker衍生物溶于無(wú)水二氯甲烷中，得到質(zhì)量濃度為20-40％w/v的溶液a；將溶液a滴加到溶液b中，繼續(xù)反應(yīng)24h，然后用薄層色譜法純化，得到點(diǎn)擊型共價(jià)藥物，式1所示的化合物；

20、

21、其中，r1如權(quán)利要求1所述。

22、一種同時(shí)響應(yīng)胞外和胞內(nèi)酸環(huán)境的兩親性嵌段聚合物，所述聚合物為線性兩親性嵌段聚合物，具有腫瘤胞外、胞內(nèi)酸激活核磁共振信號(hào)引導(dǎo)成像特性，其具有以下式2所示結(jié)構(gòu)：

23、

24、其中，

25、r2為n,n-二乙基氨基、n,n-二異丙基氨基、n,n-二叔丁基氨基、n-乙基正丙氨基、n,n-二丙氨基、n,n-二戊氨基、n,n-二己氨基、五亞甲基氨基、六亞甲基氨基或七亞甲基氨基，優(yōu)選地為n,n-二異丙基氨基；r3為n,n-二乙基氨基、n,n-乙基丙氨基、五亞甲基氨基或六亞甲基氨基；優(yōu)選為n,n-乙基丙氨基；

26、m為gd3+、mn2+、co2+、fe3+、cu2+或ni2+,優(yōu)選地為gd3+；

27、n為20-200的整數(shù)，優(yōu)選地為113的整數(shù)；

28、x為20-100的整數(shù)，優(yōu)選地為40-50的整數(shù)；

29、y為20-100的整數(shù)，優(yōu)選地為40-50的整數(shù)；

30、z為0-20的整數(shù)，優(yōu)選地為5-10的整數(shù)。

31、一種所述的兩親性嵌段聚合物的制備方法，通過(guò)以下反應(yīng)路線ii所示的可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合以及酯化接枝合成所述的兩親性嵌段聚合物：

32、

33、其中，n、x、y、z、m的定義如權(quán)利要求2所述；

34、步驟a：合成聚乙二醇-b-聚r3

35、將raft鏈轉(zhuǎn)移劑封端的聚乙二醇大分子引發(fā)劑與甲基丙烯酸乙酯修飾的r3及引發(fā)劑偶氮二異丁腈以摩爾比＝1∶50-80∶0.1的比例溶于1-5毫升n,n-二甲基甲酰胺；在無(wú)氧條件下，70℃反應(yīng)24h，反應(yīng)產(chǎn)物用1-10毫升dmf稀釋后去離子水透析，截留量為3500道爾頓的透析袋，冷凍干燥，得到胞外酸響應(yīng)兩親性嵌段共聚物；

36、

37、步驟b：聚乙二醇-b-聚(r3-b-r2-r-甲基丙烯酸羥乙酯)

38、取所述步驟a中得到的兩親性嵌段共聚物、甲基丙烯酸乙酯修飾的r2、甲基丙烯酸羥乙酯單體及引發(fā)劑偶氮二異丁腈以摩爾比＝1∶50-80∶10-20∶0.1的比例溶于1-5毫升n,n-二甲基甲酰胺；在無(wú)氧條件下，70℃反應(yīng)24h，反應(yīng)產(chǎn)物用1-10毫升dmf稀釋后去離子水透析，截留量為3500道爾頓的透析袋，冷凍干燥，得到胞外、胞內(nèi)酸響應(yīng)兩親性嵌段共聚物；

39、

40、步驟c：取所述步驟b中得到的兩親性嵌段共聚物溶于無(wú)水n,n-二甲基甲酰胺，得到質(zhì)量濃度為10％w/v的溶液c，將金屬離子配位的焦脫鎂葉綠酸(mppa)、n,n-二異丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺以摩爾比為1∶1.5∶1.5∶1.5溶于n,n-二甲基甲酰胺中制得30％w/v溶液d，反應(yīng)1.5h；將溶液c滴加到溶液d中，繼續(xù)反應(yīng)24h，然后用n,n-二甲基甲酰胺透析，再用去離子水透析，截留量為3500道爾頓的透析袋，冷凍干燥得到金屬離子配位焦脫鎂葉綠酸(mppa)共價(jià)修飾得到式2所示的兩親性嵌段聚合物；

41、

42、一種區(qū)域選擇性遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)是由所述點(diǎn)擊型共價(jià)藥物和所述兩親性嵌段聚合物共同組裝成的納米粒；所述納米粒響應(yīng)腫瘤胞外微酸和胞內(nèi)酸環(huán)境實(shí)現(xiàn)藥物區(qū)域選擇性遞送；其中，所述點(diǎn)擊型共價(jià)藥物占納米粒總質(zhì)量的5％-20％，所述兩親性嵌段聚合物占納米粒總質(zhì)量的80％-95％。

43、一種上述的區(qū)域選擇性遞送系統(tǒng)制備方法，首先將式1所示的點(diǎn)擊型共價(jià)藥物和式2所示的兩親性嵌段聚合物以質(zhì)量比＝1-9的比例同時(shí)溶于有機(jī)溶劑中，得到混合溶液，在超聲條件下將所述混合溶液滴加到去離子水中，與去離子水的體積比為1∶9，通過(guò)超濾或透析法除去有機(jī)溶劑或未包載的式1所示的點(diǎn)擊型共價(jià)藥物，得到包載有式1所示的點(diǎn)擊型共價(jià)藥物區(qū)域選擇性遞送系統(tǒng)。

44、又一種區(qū)域選擇性遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)是由所述點(diǎn)擊型共價(jià)藥物、正常藥物和所述兩親性嵌段聚合物組裝成的納米粒，所述正常藥物包括免疫調(diào)劑劑、化療藥物、核酸藥物或蛋白降解劑；其中，所述點(diǎn)擊型共價(jià)藥物占納米?？傎|(zhì)量的5％-20％，所述正常藥物占納米?？傎|(zhì)量的5％-20％，所述兩親性嵌段聚合物占納米?？傎|(zhì)量的60％-90％。

45、一種上述的區(qū)域選擇性遞送系統(tǒng)制備方法，通過(guò)ph梯度法制備而成；首先，將正常藥物和式2所示的兩親性嵌段聚合物以質(zhì)量比＝1-9的比例同時(shí)溶于有機(jī)溶劑中，得到含有藥物和所述兩親性嵌段聚合物的混合溶液，在超聲條件下將該混合溶液滴加到ph>6.5的緩沖液中，與緩沖液的體積比為1∶9，通過(guò)超濾或透析法除去有機(jī)溶劑或未包載的正常藥物，得到包載有正常藥物的納米粒懸液；其次，將式1所示的點(diǎn)擊型共價(jià)藥物溶于有機(jī)溶劑，得到含有點(diǎn)擊型共價(jià)藥物的藥物溶液，與納米粒懸液的質(zhì)量比＝1-9，且與ph>6.5納米粒懸液的體積比為1∶9；在超聲條件下將所述的藥物溶液滴加到ph>6.5納米粒懸液中，同時(shí)調(diào)節(jié)納米粒懸液的ph至7.4，然后通過(guò)超濾或透析法除去有機(jī)溶劑或未包載的點(diǎn)擊型共價(jià)藥物，最終得到含有所述點(diǎn)擊型共價(jià)藥物、正常藥物和所述兩親性嵌段聚合物的納米粒即區(qū)域選擇性遞送系統(tǒng)。

46、進(jìn)一步，所述有機(jī)溶劑選自四氫呋喃、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺和n,n-二甲基乙酰胺中的至少一種；所述緩沖液選自pbs緩沖液。

47、一種所述的區(qū)域選擇性遞送系統(tǒng)在遞送治療癌癥藥物中的用途。

48、所述治療癌癥藥物包括蛋白抑制劑、化療藥物、核算藥物以及聯(lián)合藥物。

49、所述癌癥為肺癌，皮膚癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌或前列腺癌。

50、所述區(qū)域選擇性遞送系統(tǒng)具有腫瘤胞內(nèi)、外區(qū)域選擇性遞送的特征，基于腫瘤胞外和胞內(nèi)酸環(huán)境的差異性，將點(diǎn)擊型膜蛋白抑制劑特異性在腫瘤胞外釋放，特異性降解腫瘤細(xì)胞膜蛋白；將核磁共振造影劑特異性在胞內(nèi)釋放。區(qū)域選擇性納米粒在正常生理?xiàng)l件下(如ph＝7.4)自組裝成穩(wěn)定的納米粒，流體力學(xué)粒徑約80納米；在血液循環(huán)時(shí)具有良好的穩(wěn)定性，防止藥物泄露；在腫瘤組織胞外微酸環(huán)境下，胞外酸激活納米粒中胞外酸響應(yīng)基團(tuán)被質(zhì)子化，釋放出點(diǎn)擊型共價(jià)藥物，與疊氮預(yù)標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，增強(qiáng)在腫瘤組織的滯留以及提高點(diǎn)擊型共價(jià)藥物的效力，減少毒副作用；待納米粒被細(xì)胞攝取后，胞內(nèi)酸激活納米粒中胞內(nèi)酸響應(yīng)基團(tuán)被質(zhì)子化，在胞內(nèi)激活核磁共振造影劑，最終實(shí)現(xiàn)藥物區(qū)域選擇性釋放，實(shí)現(xiàn)核磁共振成像引導(dǎo)的腫瘤精準(zhǔn)治療。

51、本發(fā)明還提供了一種基于腫瘤胞外、胞內(nèi)酸環(huán)境激活的點(diǎn)擊型共價(jià)藥物納米平臺(tái)腫瘤協(xié)同治療藥物，同時(shí)調(diào)控腫瘤胞內(nèi)、外靶點(diǎn)；所述胞外微酸環(huán)境激活納米粒用于調(diào)控腫瘤胞外靶點(diǎn)；胞內(nèi)酸環(huán)境激活納米粒用于調(diào)控胞內(nèi)靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)治療。其中，胞外微酸環(huán)境激活納米粒釋放點(diǎn)擊型共價(jià)藥物用于選擇性共價(jià)降解腫瘤膜蛋白；胞內(nèi)酸激活納米粒釋放其他藥物調(diào)控胞內(nèi)靶點(diǎn)；或者滿足本發(fā)明用途任意治療劑組合。

52、包含式1點(diǎn)擊型共價(jià)藥物和式2胞外、胞內(nèi)酸響應(yīng)兩親性嵌段聚合物的區(qū)域選擇性納米粒通過(guò)ph梯度方法制備，具有多層結(jié)構(gòu)，包括聚乙二醇外層、聚(甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯)-b-聚(n,n-二異丙基氨基乙酯-r-金屬配位焦脫鎂葉綠酸a)內(nèi)層納米粒，該納米粒的平均流體力學(xué)粒徑優(yōu)選為70-120納米。

53、所述的納米粒具有腫瘤胞外、胞內(nèi)酸環(huán)境響應(yīng)功能，使相應(yīng)的納米粒具備腫瘤組織區(qū)域選擇性遞送藥物的特征。聚乙二醇親水層，能夠防止蛋白吸附，使納米粒在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，減少內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)的清除，延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間。納米粒通過(guò)epr效應(yīng)到達(dá)腫瘤組織后，甲基丙烯酸乙基丙胺基乙酯被質(zhì)子化，納米粒解離，暴露點(diǎn)擊型共價(jià)藥物，通過(guò)原位點(diǎn)擊反應(yīng)提高點(diǎn)擊型共價(jià)藥物在腫瘤組織的滯留；待納米粒被腫瘤細(xì)胞攝取后，n,n-二異丙基氨基乙酯被繼續(xù)質(zhì)子化，釋放出核酸或化療等藥物，最終實(shí)現(xiàn)藥物區(qū)域選擇性遞送。

54、根據(jù)本發(fā)明提供的負(fù)載點(diǎn)擊型共價(jià)藥物和/或核酸藥物、化療藥物、蛋白降解劑等的胞外、內(nèi)酸響應(yīng)納米粒在治療癌癥中的用途，所述的癌癥類型主要為乳腺癌、皮膚癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌或前列腺癌等。

55、本發(fā)明的有益效果包括：

56、1)本發(fā)明利用點(diǎn)擊化學(xué)和腫瘤胞外、內(nèi)酸響應(yīng)兩親性嵌段聚合物，精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)腫瘤區(qū)域選擇性遞送；胞外酸激活遞送點(diǎn)擊型共價(jià)藥物，通過(guò)和疊氮標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)共價(jià)抑制腫瘤靶蛋白，提高小分子效力，增強(qiáng)在腫瘤滯留，改善治療效果，同時(shí)減少毒副作用；胞內(nèi)酸激活遞送核酸藥物、化療藥物或蛋白降解劑，協(xié)同調(diào)控腫瘤胞內(nèi)、外靶點(diǎn)。

57、2)本發(fā)明關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新在于通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)設(shè)計(jì)點(diǎn)擊型共價(jià)藥物，對(duì)疊氮標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)共價(jià)抑制，而對(duì)未疊氮標(biāo)記的正常細(xì)胞沒(méi)有影響，減少對(duì)正常組織的毒副作用。

58、3)本發(fā)明的創(chuàng)新獨(dú)特性在于利用腫瘤胞內(nèi)、外酸激活納米粒響應(yīng)腫瘤酸環(huán)境精準(zhǔn)胞內(nèi)、外區(qū)域選擇性遞藥物，系統(tǒng)調(diào)控腫瘤包內(nèi)外靶點(diǎn)，使得本發(fā)明具有廣譜性，可應(yīng)用于多種實(shí)體腫瘤治療場(chǎng)景。