：本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)，具體涉及一種豬子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

0、
背景技術(shù)：

1、由于再生醫(yī)學(xué)和組織工程技術(shù)的發(fā)展結(jié)合了生命科學(xué)、工程學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多個(gè)學(xué)科的理論和方法，以及材料科學(xué)、細(xì)胞技術(shù)、基因工程技術(shù)等多項(xiàng)現(xiàn)代生物工程技術(shù)，為組織的再生和修復(fù)提供了新的手段和方法，能夠修復(fù)、替代和增強(qiáng)人體內(nèi)受損、病變或有缺陷的組織和器官。再生醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵組成部分：干細(xì)胞療法，在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，部分產(chǎn)品管線已經(jīng)進(jìn)入臨床階段。干細(xì)胞具有強(qiáng)大的分化再生能力以及免疫調(diào)節(jié)作用，在成為再生醫(yī)學(xué)中的研究熱點(diǎn)的同時(shí)，也面對(duì)很多挑戰(zhàn)，選擇合適的細(xì)胞來源一直困擾著研究人員。

2、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells，mscs)是具有多向分化潛能和自我更新能力的多能干細(xì)胞，具有再生成各種組織、器官和細(xì)胞的潛力，相關(guān)臨床研究已廣泛開展，并取得了許多重大突破。子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(endometrial?mscs，簡(jiǎn)稱emscs)是位于子宮內(nèi)膜的功能層和基底層的細(xì)胞，在月經(jīng)周期中負(fù)責(zé)子宮內(nèi)膜的再生和重塑，具有多能分化潛能和自我更新的能力，能夠分化為多種細(xì)胞類型，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞等。emscs在再生醫(yī)學(xué)中顯示出巨大的潛力，尤其是在治療子宮內(nèi)膜損傷和促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生方面。研究表明，emscs能夠通過分泌生長(zhǎng)因子或外泌體來促進(jìn)血管生成和基質(zhì)細(xì)胞增殖，同時(shí)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)并抑制纖維化子宮內(nèi)膜的再生。在子宮內(nèi)膜損傷的修復(fù)過程中，emscs能夠遷移到受損部位，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成、腺體形成以及上皮和基質(zhì)成分的再生，從而改善子宮內(nèi)膜的厚度和完整性。emscs還顯示出對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，能夠降低促炎因子的表達(dá)，提高抗炎因子的表達(dá)，有助于創(chuàng)造更有利于胚胎植入的環(huán)境。此外，emscs在治療子宮內(nèi)膜粘連(asherman綜合征)方面也顯示出潛力。asherman綜合征是一種由于感染或創(chuàng)傷導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜粘連形成，從而減少了胚胎植入的可用區(qū)域，導(dǎo)致不孕。emscs作為子宮內(nèi)膜的本地細(xì)胞，對(duì)于周期性再生具有天然的優(yōu)勢(shì)，已成為修復(fù)受損子宮內(nèi)膜的理想細(xì)胞來源?？偟膩碚f，emscs在子宮內(nèi)膜修復(fù)和再生方面具有顯著的潛力，為治療子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病提供了新的策略和希望，并為臨床應(yīng)用提供新的治療選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明涉及的豬子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的具體工藝過程包括以下步驟：

2、(1)獲取組織

3、將新鮮的豬子宮(帶卵巢)組織置于冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中保存；

4、(2)預(yù)處理組織

5、首先，在無菌室內(nèi)，切開組織，使用預(yù)冷的添加有氯化鎂和氯化鈣的無菌pbs(ph＝7.4)浸泡，沖洗；

6、然后，剝離最外層的漿膜層，將豬子宮內(nèi)膜層和肌層分開；

7、最后，將碎片化的內(nèi)膜層，置于37℃的培養(yǎng)箱中用補(bǔ)充有消化酶的基礎(chǔ)培養(yǎng)基消化2-3小時(shí)，每隔15分鐘吹打一次，得到細(xì)胞懸浮液；

8、(3)初步離心

9、首先，通過100和40微米細(xì)胞濾器過濾細(xì)胞懸浮液，加入msc(間充質(zhì)干細(xì)胞)完全培養(yǎng)基阻止進(jìn)一步消化，用pbs清洗，1000rpm離心5分鐘；

10、然后，用紅細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞2次，用pbs清洗；

11、最后，細(xì)胞以500cell/cm2的克隆密度接種在msc完全培養(yǎng)基中，在37.0℃下、5％co2的潮濕空氣中孵育，細(xì)胞接種后的第二天，密切觀察細(xì)胞的貼壁狀況，每隔2-3天替換一次msc完全培養(yǎng)基，該細(xì)胞為p0代的細(xì)胞；

12、(4)培養(yǎng)與傳代

13、首先，在細(xì)胞密度達(dá)到60％-80％時(shí)，將msc完全培養(yǎng)基、濃度為0.25％的胰蛋白酶和pbs提前置于37℃水浴鍋中預(yù)熱，吸除msc完全培養(yǎng)基，用pbs洗滌；

14、然后，加入胰蛋白酶消化，通過顯微鏡觀察到細(xì)胞出現(xiàn)回縮、分散現(xiàn)象時(shí)，立即加入等量的msc完全培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞移至ep管中，1000rpm離心5分鐘；

15、最后，除去上清液，加入msc完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取1/3加入到新的培養(yǎng)皿里，輕搖混勻，置于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，該細(xì)胞為p1代的細(xì)胞；

16、(5)計(jì)數(shù)、活性檢測(cè)和培養(yǎng)

17、取100μl?p1代的細(xì)胞，通過臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活性并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種至含msc完全培養(yǎng)基的六孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞為p2代的細(xì)胞，以此類推，其中，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞接種濃度為0.5×104/cm2-1.5×104/cm2；

18、(6)誘導(dǎo)分化

19、取p2-p3代的細(xì)胞加入不同的細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等分化。

20、本發(fā)明涉及的豬子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的步驟(2)中的無菌pbs中添加的氯化鎂和氯化鈣的濃度分別為1mm和0.5mm；

21、消化酶中含有濃度為0.2％的ii型膠原酶和40μg/ml的i型脫氧核糖核酸酶(dnasei)，ii型膠原酶和dnase?i聯(lián)合使用，ii型膠原酶負(fù)責(zé)分解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白，dnasei負(fù)責(zé)降解dna，減少細(xì)胞凝集，共同促進(jìn)組織的有效消化，從而獲得高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液；

22、其中，子宮內(nèi)膜中大部分為子宮內(nèi)膜細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞比例較小，ii型膠原酶通過水解細(xì)胞間質(zhì)中的脯氨酸，分離細(xì)胞，對(duì)膠原的消化作用很強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞間質(zhì)也有較好的消化作用，但對(duì)細(xì)胞本身影響不大，能夠使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害；

23、dnase?i能夠作用于細(xì)胞分離過程中降解出的dna，通過隨機(jī)剪切dna鏈，將dna鏈消化成寡脫氧核苷酸，減少細(xì)胞團(tuán)塊，幫助制備單細(xì)胞懸液。

24、本發(fā)明涉及的豬子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的步驟(3)和(4)中的msc完全培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清(fbs)、1％雙抗的msc基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中，雙抗為100u/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素。

25、本發(fā)明涉及的豬子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的步驟(5)中的細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件是：溫度37.0℃，5％?co2飽和度。

26、本發(fā)明涉及的豬子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的步驟(6)中的細(xì)胞誘導(dǎo)分化包括成骨分化、成軟骨分化、成脂肪分化等間充質(zhì)干細(xì)胞三系誘導(dǎo)分化，且三系誘導(dǎo)分化(成脂誘導(dǎo)、成骨誘導(dǎo)、成軟骨誘導(dǎo))均是參照脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨(guxmd-90021)，成脂(guxmd-90031)，成軟骨(guxmd-90041)誘導(dǎo)分化試劑盒的步驟進(jìn)行操作和驗(yàn)證鈣結(jié)節(jié)、脂滴、軟骨球切片的染色情況；其中，成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化；成軟骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化；成脂肪分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。

27、本發(fā)明涉及的豬子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面標(biāo)記物鑒定，確定適用于鑒定豬子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的抗體：cd44(abcam，ab95138)，cd34(abcam，ab223930)，cd105(abcam，ab53321)，cd11b(abcam，ab34444)。

28、本發(fā)明涉及的豬子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于宮腔粘連、皮膚及血管損傷等細(xì)胞的修復(fù)，包括修復(fù)卵巢早衰、子宮內(nèi)膜損傷，修復(fù)方法簡(jiǎn)單易行，將其與生物材料復(fù)合植入病灶部位即可進(jìn)行再生修復(fù)。

29、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，從大動(dòng)物：豬的子宮組織中進(jìn)行分離，步驟簡(jiǎn)單、細(xì)胞獲得量大，培養(yǎng)得到的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有cd34－和cd11b－，且cd44+、cd105+的表型，在體外可經(jīng)誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞、脂細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，能夠修復(fù)多種組織器官損傷，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究及應(yīng)用，為細(xì)胞移植治療提供了新的途徑；其通過從豬子宮內(nèi)膜組織來源分離間充質(zhì)干細(xì)胞，并在含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和擴(kuò)增子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo)分化成多種細(xì)胞后，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用前景。