專利名稱:實蠅分類檢測生物芯片、檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲分類檢測技術(shù)，特別是涉及實蠅科的分類檢測生物芯片、檢測方法以及試劑盒。
背景技術(shù)：
地中海實蠅Ceratitis capitata和桔小實蠅Bactrocera dorsalis是雙翅目Diptera，實蠅科Tepheitida昆蟲。這兩種昆蟲是世界上公認(rèn)的農(nóng)業(yè)大害蟲，食性雜寄主，非常廣泛，主要危害水果和蔬菜。
地中海實蠅和桔小實蠅分別是我國進(jìn)境植物檢疫禁止進(jìn)境的危險性害蟲。地中海實蠅是一種對水果和蔬菜最具破壞性的危險性有害生物，可以危害所有對人類有價值的水果作物(已報道352種)，被稱為“果蔬頭號殺手”。地中海實蠅原產(chǎn)西非，現(xiàn)已隨果蔬等傳播到世界90多個國家和地區(qū)。地中海實蠅曾使地中海地區(qū)一些國家種植的核果受害率高達(dá)100％，希臘的柑橘損失50％，意大利的杏、蘋果和柑橘損失高達(dá)80％；自1975年地中海實蠅傳入美國加利福尼亞州以來，1986-1991年每年都有發(fā)生，期間共進(jìn)行了10多次大規(guī)模的根除行動，耗資達(dá)1.5億美元，與此同時，世界上34個國家和地區(qū)中斷了與美國的水果、蔬菜的貿(mào)易關(guān)系，使美國蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
桔小實蠅寄主范圍很廣泛，是一種嚴(yán)重的果蔬害蟲?？蔀楹Ω探邸⒊?、番石榴、芒果、桃、番荔枝、枇杷、木瓜、黃皮、沙田柚、楊桃、火龍果、龍眼、荔枝、黃皮、香蕉、咖啡、李、杏、櫻桃、番茄、茄子、辣椒等250余種水果和蔬菜。該蟲現(xiàn)分布美國(夏威夷)和亞洲部分地區(qū)(中國南部、印度、斯里蘭卡、尼泊爾、不丹、緬甸、泰國、老撾、越南、柬埔寨等)，近幾年我國的實蠅監(jiān)測結(jié)果表明，桔小實蠅在我國的分布有向長江以北擴(kuò)散的跡象，我國農(nóng)業(yè)部已公布上海已是桔小實蠅的分布區(qū)，桔小實蠅問題也是世界果蔬貿(mào)易最常用的技術(shù)壁壘措施之一，我國因部分地區(qū)是桔小實蠅疫區(qū)而導(dǎo)致水果和蔬菜出口受到許多國家的限制，經(jīng)濟(jì)損失巨大。
在亞洲太平洋地區(qū)，已知的桔小實蠅復(fù)合種達(dá)75種之多，其中有重要經(jīng)濟(jì)意義的有8種，較為常見的5種包括B.(B.)dorsalis及其四個重要復(fù)合種(木瓜實蠅B.(B.)papayae、楊桃實蠅B.(B.)carambolae、菲律賓實蠅B.(B.)philippinensis、芒果實蠅B.(B.)occipitalis復(fù)合種之間形態(tài)學(xué)差異非常小，不易區(qū)分開來，桔小實蠅復(fù)合種的分類鑒定一直是實蠅科害蟲的難點之一，國內(nèi)外專家意見還未取得完全一致。
目前實蠅的種類鑒定方法多數(shù)采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定，主要是通過成蟲的形態(tài)特征來鑒定種類，而不能對幼蟲及卵進(jìn)行鑒定，而且對近源種間的鑒定存在誤差。但在口岸檢疫中截獲的主要以幼蟲和蛹等蟲態(tài)為主，果實蠅屬的幼蟲、蛹的特征非常相似，難以鑒定到種，傳統(tǒng)的方法是將幼蟲或蛹飼養(yǎng)至成蟲再作種類鑒定，這一過程需要20天以上的時間且不適合口岸檢疫快速驗放的工作程序。因此實蠅的快速種類區(qū)分是進(jìn)出口果蔬實蠅貿(mào)易和植物檢疫中最大的問題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了解決以上問題，提供一種能快速、準(zhǔn)確、高通量地進(jìn)行實蠅物種鑒定和區(qū)分的生物芯片。
本發(fā)明另一目的在于提供一種進(jìn)行實蠅物種鑒定和區(qū)分的檢測方法。
本發(fā)明再一目的在于提供一種能快速、準(zhǔn)確、高通量地進(jìn)行實蠅物種鑒定和區(qū)分的試劑盒。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種實蠅分類檢測生物芯片，包括固相載體及固定在載體上的探針，所述探針包括科通用探針、屬通用探針以及種通用探針中的至少一種，所述科通用探針為teph，其具有如序列表中Seq ID No.1所示的序列；所述屬通用探針選自anst、cera、bact中的至少一種，其分別具有如序列表中Seq IDNo.2～4所示的序列；所述種通用探針選自以下中的至少一種ccca-1、ccca-2、ccco、cpro、anlu、anob、bboc-1、bboc-2、bbal、bbdi、bbla-1、bbla-2、bbfr、bbne、bbps、bbco-1、bbco-2、bbzo-1、bbzo-2、bbmu、bbum、bgca、baja、bdol-1、bdol-2、bpex、bzta、bzcu-1、bzcu-2、bzis，其分別具有如序列表中Seq ID No.26～55所示的序列。
優(yōu)選的，所述探針還包括亞屬通用探針和/或復(fù)合種/近緣種特異探針；所述亞屬通用探針選自subbact、subzeug中的至少一種，其分別具有如序列表中Seq ID No.5～6所示的序列；所述復(fù)合種/近緣種特異探針選自以下中的至少一種caro、caco-1、caco-2、dor-comp-1、dor-comp-2、dor-comp-3、dor-comp-4、dor-comp-5、dor-comp-6、tyne、tycu、bbcu、coza、tacu、sais-1、sais-2、bpde、bacu-1、bacu-2，其分別具有如序列表中Seq ID No.7～25所示的序列。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述探針還包括定位探針、陽性對照探針、陰性對照探針中的至少一種。
所述定位點探針具有如序列表中Seq ID No.56所示的序列；所述陽性對照探針具有如序列表中Seq ID No.57所示的序列；所述陰性對照探針具有如序列表中Seq ID No.58所示的序列。
本發(fā)明還公開了一種實蠅分類鑒定方法，所述方法包括步驟從實蠅科昆蟲卵、幼蟲、蛹或成蟲提取基因組DNA，用通用引物COI3/COI5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物與上述的實蠅分類檢測生物芯片雜交，所述通用引物COI3/COI5分別具有如序列表中SeqID No.59～60所示的序列。
所述PCR擴(kuò)增過程中利用熒光摻入法進(jìn)行熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增。
優(yōu)選的，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94℃/1.5min；94℃/30s-55℃/30s-72℃/30s，40個循環(huán)；72℃/5min。
本發(fā)明還公開了一種實蠅分類檢測試劑盒，所述試劑盒含有上述的實蠅分類檢測生物芯片。
由于采用了以上的方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明的生物芯片，通過選用實蠅科通用探針、屬通用探針以及種特異探針，或者進(jìn)一步選用亞屬通用探針以及復(fù)合種/近緣種特異探針，能夠快速、準(zhǔn)確、高通量的鑒定實蠅物種，并且不僅對實蠅成蟲，對實蠅卵、幼蟲以及蛹也能實現(xiàn)準(zhǔn)確分類鑒定。
圖1是32種實蠅分類檢測生物芯片探針點陣示意圖(15×16)。
圖2是桔小實蠅五個復(fù)合種分類檢測生物芯片探針點陣示意圖(8×16)。
圖3為地中海實蠅及其近緣種分類檢測生物芯片探針點陣示意圖(6×16)。
具體實施方式在本發(fā)明的技術(shù)之前，雖然AFLP和PCR-RFLP、特異性引物PCR和SYBR Green實時熒光PCR技術(shù)等分子生物學(xué)方法先后被嘗試應(yīng)用于實蠅的分類鑒定，但只能對單個實蠅或少數(shù)種類的鑒定和區(qū)分，還未建立大規(guī)模、高通量的實蠅鑒定方法。生物芯片技術(shù)以其可高通量、高靈敏度和高特異性等優(yōu)勢可解決實蠅種類多，復(fù)合種形態(tài)學(xué)鑒定難以區(qū)分的問題，是一種理想的實蠅分子鑒定技術(shù)平臺。用生物芯片技術(shù)不僅能在不同蟲態(tài)水平快速、準(zhǔn)確進(jìn)行物種分子鑒定，而且能快速、準(zhǔn)確、高通量的進(jìn)行實蠅物種鑒定和區(qū)分。
本發(fā)明的生物芯片，通過選用實蠅科通用探針、屬通用探針以及種特異探針，或者進(jìn)一步選用亞屬通用探針以及復(fù)合種/近緣種特異探針，能夠快速、準(zhǔn)確、高通量的鑒定實蠅物種，并且不僅對實蠅成蟲，對實蠅卵、幼蟲以及蛹也能實現(xiàn)準(zhǔn)確分類鑒定。
本發(fā)明根據(jù)我國新修訂的進(jìn)境植物檢疫性病蟲雜草名錄，并結(jié)合我國口岸植物檢疫危險性實蠅的截獲頻率、國內(nèi)外實蠅的發(fā)生危害情況，擬定了地中海實蠅和桔小實蠅等危險性實蠅(包括3屬12亞屬32種)的生物芯片檢測方法，32種實蠅種類名錄如下地中海實蠅Ceratitis(C.)capitata、納塔爾實蠅Ceratitis(Pterandrus)rosa、非洲芒果實蠅Ceratitis(Ceratalaspis)cosyra；桔小實蠅Bactrocera(Bactrocera)dorsalis、木瓜實蠅Bactrocera(B.)papayae、楊桃實蠅Bactrocera(B.)carambolae、菲律賓實蠅Bactrocera(B.)pilippinensis、芒果實蠅Bactrocera(B.)occipitalis、番石榴實蠅Bactrocera(B.)correcta、蒲桃實蠅Bactrocera(B.)albistrigatus、短條面包果實蠅Bactrocera(B.)frauenfeldi、迪奧氏實蠅Bactrocera(B.)diospyiri、大洋洲桔實蠅Bactrocera(B.)curvipennis、辣椒實蠅Bactrocera(B.)latifrons、香蕉實蠅Bactrocera(B.)musae、小昆士蘭實蠅Bactrocera(Bactrocera)neohumeralis、黑肩角桔實蠅Bactrocera(B.)psidii、昆士蘭實蠅Bactrocera(B.)tryoni、三帶實蠅Bactrocera(B.)umbrosa、桃實蠅Bactrocera(B.) zonata；扎維斯實蠅Bactrocera(Afrodacus)jarvisi、黃瓜實蠅Bactrocera(Austrodacus)cucumis、橄欖實蠅Bactrocera(Daculus)oleae、艷實蠅Bactrocera(Gymnodacus)calophylli、日本南瓜實蠅Bactrocera(Paradacus)depressa、平展實蠅Bactrocera(Paratridacus)expandens、瓜實蠅Bactrocera(Zeugodacus)cucurbitae、石垣島實蠅Bactrocera(Z.)ishigahiensis、具條實蠅Bactrocera(Z.)scutellata、南瓜實蠅Bactrocera(Z.)tau、墨西哥按實蠅Anastrepha ludens、西印度按實蠅Anastrepha obliqua。
下表1中列出了本發(fā)明所用到的探針。
表1實蠅生物芯片探針
上述表1中的檢測探針均為20～30nt的寡核苷酸，序列分別為實蠅科、屬、種的特異性序列，能夠準(zhǔn)確、快速地檢測出包含這些特異性序列的不同種類實蠅，實現(xiàn)實蠅的分類鑒別。這些檢測探針的5’端氨基修飾。
本發(fā)明的生物芯片中，除了上述檢測探針外，通常還可以包括定位點探針、陽性對照探針以及陰性對照探針等質(zhì)控探針。本發(fā)明定位點探針、陽性對照探針以及陰性對照探針優(yōu)選用以下表2中的序列。表2中，定位點探針是一條30nt的寡核苷酸，序列與現(xiàn)知的實蠅序列無同源性，3′端氨基修飾，5′端Cy3熒光標(biāo)記。陽性對照探針是一條20nt的寡核苷酸，序列與現(xiàn)知實蠅序列無同源性，5′端氨基修飾，其作用是監(jiān)控PCR擴(kuò)增標(biāo)記過程和雜交過程是否正常。本發(fā)明中的陰性對照是也一條23nt的寡核苷酸，序列與現(xiàn)知實蠅序列無同源性，5′端氨基修飾，其作用是監(jiān)控雜交過程非特異性結(jié)合情況，并作為檢測探針位點陽性與否的參照。本發(fā)明的生物芯片還優(yōu)選包括空白對照，本發(fā)明中的空白對照是50％DMSO緩沖液，用于檢測雜交背景。
表2質(zhì)控探針序列
本發(fā)明生物芯片的固相載體可以選用本領(lǐng)域已知可用的載玻片、硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯等。
以下通過具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
實施例1(一)32種危險性實蠅分類檢測生物芯片一種地中海實蠅、桔小實蠅等32種危險性實蠅分類檢測生物芯片，其是在固相載體介質(zhì)表面上固定有寡核苷酸探針點陣。每張基片包括四個相同的探針點陣區(qū)，每一探針點陣區(qū)包括15行16列點陣。每個探針點陣內(nèi)部分成四個功能探針區(qū)，即按實蠅屬Anastrepha檢測探針區(qū)、果實蠅屬Bactrocera檢測探針區(qū)、小條實蠅屬Ceratitis檢測探針區(qū)和質(zhì)控對照探針檢測區(qū)(質(zhì)控對照探針由陽性對照探針、陰性對照探針和空白對照探針組成)。探針點陣第1行和第1列由定位點探針組成，檢測探針和質(zhì)控探針點陣分布如表3及圖1所示。檢測探針和質(zhì)控探針的每條探針橫向重復(fù)3點。檢測探針的核苷酸序列及探針特性如表1，質(zhì)控探針和定位點探針如表2所示。
檢測探針包括科通用探針1條、屬通用探針3條、亞屬通用探針2條、復(fù)合種/近緣種探針19條、種特異探針30條?？蓪崿F(xiàn)包括實蠅科按實蠅屬Anastrepha spp.、果實蠅屬Bactrocera spp.和小條實蠅屬Ceratitis spp.等三個屬實蠅種類的初篩以及地中海實蠅、納塔爾實蠅、非洲芒果實蠅；桔小實蠅、木瓜實蠅、楊桃實蠅、菲律賓實蠅、芒果實蠅、番石榴實蠅、蒲桃實蠅、短條面包果實蠅、迪奧氏實蠅、大洋洲桔實蠅、辣椒實蠅、香蕉實蠅、小昆士蘭實蠅、黑肩角桔實蠅、昆士蘭實蠅、三帶實蠅、桃實蠅；扎維斯實蠅、黃瓜實蠅、橄欖實蠅、艷實蠅、日本南瓜實蠅、平展實蠅、瓜實蠅、石垣島實蠅、具條實蠅、南瓜實蠅；墨西哥按實蠅、西印度按實蠅等32種實蠅的鑒定。
表3.32種危險性實蠅分類檢測生物芯片探針排布示意圖
(二)生物芯片的制備實蠅生物芯片的制備包括探針點陣的設(shè)計、探針的準(zhǔn)備、點樣、固定、洗片和圍欄粘貼等步驟，現(xiàn)分述如下探針點陣的設(shè)計每張芯片包括4個相同的探針點陣區(qū)，每個探針點陣區(qū)根據(jù)設(shè)計的探針排布(表3)和探針點陣位置(圖1)進(jìn)行點樣。每條探針橫向重復(fù)3點，每點約0.4nL，點直徑約200μm，點間距370μm，點樣均勻度(SV值)約為7％。
探針的準(zhǔn)備探針用50％DMSO點樣緩沖液溶解，濃度為50μM，按探針點樣的順序?qū)⑻结樔芤?100μL)加入96孔板。
點樣利用點樣儀(GeSim NANO plotter 2)將各寡核苷酸探針固化在醛基化玻璃片，經(jīng)過水合、固定和洗片，獲得帶探針矩陣的芯片。每張基片包括四個相同的探針點陣區(qū)(15×16)，每個探針點陣內(nèi)部分成四個功能探針區(qū)，即按實蠅屬Anastrepha檢測探針區(qū)、果實蠅屬Bactrocera檢測探針區(qū)、小條實蠅屬Ceratitis檢測探針區(qū)和質(zhì)控對照探針檢測區(qū)(由陽性對照探針、陰性對照探針和空白對照探針組成)。探針點陣第1行和第1列由定位點探針組成。探針由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成和標(biāo)記。
固定點樣后將基片放在保濕盒37℃恒溫固定12小時以上。
洗片固定后的基片先在0.2％SDS洗液中攪拌清洗2min；水中攪拌清洗2min，重復(fù)三次；然后在0.2％NaBH4封閉液中攪拌封閉5min；再用去離子水中攪拌清洗2min，重復(fù)三次，2000rpm離心2min，晾干。
預(yù)掃描點完片針的芯片，放入GenePix4200A基因芯片掃描儀，用遠(yuǎn)紅外光區(qū)532nm對基因芯片進(jìn)行預(yù)掃描質(zhì)檢，通過軟件GenePix Pro5.0(或更高的版本)分析芯片點樣結(jié)果，主要檢查定位點和檢測探針位點的均勻性，有無少點或漏點探針等。
圍欄粘貼利用芯片粘貼工具將四孔芯片圍欄小心貼在芯片正面，放入芯片盒，避光室溫保存。
(三)32種危險性實蠅分類檢測方法1、實蠅基因組DNA的提取利用動物/昆蟲DNA提取試劑盒或其它相關(guān)方法獲得實蠅標(biāo)本基因組DNA，DNA模板必須滿足下游PCR擴(kuò)增等實驗的要求。實蠅基因組DNA推薦Dneasy Tissue Kit(QIAGEN德國)提取方法，從卵、幼蟲、蛹或成蟲部分組織如腹部等實蠅樣本中均可提取得到。
2、熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增分別用實蠅科mtDNA COI基因通用引物COI3/COI5(表4)，利用熒光摻入法進(jìn)行熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增，即在PCR擴(kuò)增體系中加入含Cy3/Cy5-dCTP。PCR反應(yīng)體系如表5，其中體系中各試劑的量可根據(jù)反應(yīng)體系的總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。標(biāo)記PCR反應(yīng)條件94℃/1.5min；94℃/30s；55℃/30s；72℃/30s，40個循環(huán)；72℃/5min。引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增片段長度為430bp。
表4熒光標(biāo)記PCR引物序列
表5熒光標(biāo)記PCR反應(yīng)體系
3、標(biāo)記PCR產(chǎn)物與芯片的雜交反應(yīng)分別各取熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和50℃預(yù)熱的雜交緩沖液(1∶1的10×SSPE與2％SDS)10μl混合(表6)，95℃變性5min后，迅速放入冰水混合物中冰浴5min。
表6雜交反應(yīng)體系
在芯片雜交盒(北京博奧)兩側(cè)小槽中加入200μL去離子水(保持雜交盒內(nèi)濕度)，將已制備完備的芯片(制備方法參見上文)正面朝上放進(jìn)雜交盒中，對準(zhǔn)方向放入4圍欄蓋片，通過加樣孔將冰浴的熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物和雜交液混合物一次注入，使其充滿蓋片和芯片之間空隙，封閉雜交盒，置于46℃恒溫環(huán)境3小時。
雜交完畢后棄去蓋片，芯片探針面向下在少量50℃預(yù)熱的雜交洗液I(表7)中漂去殘余雜交液(注意避免四個矩陣的雜交液交叉污染)，在42℃預(yù)熱的雜交洗液I攪拌清洗2min，再在50℃預(yù)熱的雜交洗液II攪拌清洗2min，2000rpm離心1min，置暗盒室溫保存。
表7芯片雜交洗液
4、芯片掃描在基因芯片掃描儀(GenePix4200A，Axon)在遠(yuǎn)紅外光區(qū)532nm處對基因芯片進(jìn)行掃描，PMT值為800。再通過軟件GenePix Pro 5.0分析芯片掃描的結(jié)果，得出相關(guān)的數(shù)據(jù)，并保存。
5、數(shù)據(jù)分析和信號判讀雜交信號依據(jù)下述原則進(jìn)行判讀(1)每個檢測點信號值＝該點熒光強度值-該點背景強度值；(2)空白對照平均信號值＝3個空白對照點信號值的平均值；(3)陰性對照平均信號值＝3個陰性對照點信號值的平均值-空白對照平均信號值；(4)每條探針的每個檢測點信號值—空白對照平均信號值＞10倍陰性對照平均信號值即判讀該檢測點為陽性；(5)每條探針的3個重復(fù)檢測點均為陽性即判讀該條探針為陽性；(6)如定位探針部分或全部為陰性，則表明探針與片基結(jié)合有問題，實驗結(jié)果不準(zhǔn)確；(7)如陽性對照為陰性，則表明擴(kuò)增標(biāo)記或雜交環(huán)節(jié)存在問題，實驗結(jié)果不準(zhǔn)確；
6、結(jié)果判定原則在質(zhì)控探針和定位點探針均正常情況下，檢測結(jié)果和判斷原則如下當(dāng)teph出現(xiàn)陽性信號，判定為實蠅科Tephritidae；Anastepha屬實蠅的鑒定當(dāng)teph，anst同時出現(xiàn)陽性信號，判定為按實蠅屬Anastrepha spp.；當(dāng)teph，anst，anlu同時出現(xiàn)陽性信號，判定為墨西哥按實蠅Anastrepha lundes；當(dāng)teph，anst，anob同時出現(xiàn)陽性信號，判定為西印度按實蠅Anastrepha obliqua。
Bactrocera屬實蠅的鑒定當(dāng)teph，bact同時出現(xiàn)陽性信號，判定為果實蠅屬Bactrocera spp.；當(dāng)teph，bact，subbact同時出現(xiàn)陽性信號，判定為果實蠅亞屬Bactrocera sp.；桔小實蠅、木瓜實蠅、楊桃實蠅、菲律賓實蠅和芒果實蠅的結(jié)果判定見以下實例2。
當(dāng)teph，bact，subbact，coza.，bbco-1，bbco-2同時出現(xiàn)陽性信號，判定為番石榴實蠅Bactrocera correcta；當(dāng)teph，bact，subbact，coza，bbzo-1，bbzo-2同時出現(xiàn)陽性信號，判定為桃實蠅Bactrocera(B.)zonata；當(dāng)teph，bact，subbact，bbal同時出現(xiàn)陽性信號，判定為蒲桃實蠅Bactrocera(B.)albistrigatus；當(dāng)teph，bact，subbact，bbdi同時出現(xiàn)陽性信號，判定為迪奧氏實蠅Bactrocera(B.)diospyiri；當(dāng)teph，bact，subbact，bbla-1，bbla-2同時出現(xiàn)陽性信號，判定為辣椒實蠅Bactrocera(B.)latifrons；當(dāng)teph，bact，subbact，bbfr同時出現(xiàn)陽性信號，判定為短條面包果實蠅Bactrocera(B.)frauenfeldi；當(dāng)teph，bact，subbact，bbps同時出現(xiàn)陽性信號，判定為黑肩角桔實蠅Bactrocera(B.)psidii；當(dāng)teph，bact，subbact，tyne，bbne同時出現(xiàn)陽性信號，判定為小昆士蘭實蠅Bactrocera(B.)neohumeralis；當(dāng)teph，bact，subbact，tyne，tycu同時出現(xiàn)陽性信號，判定為昆士蘭實蠅Bactrocera(B.)tryoni；當(dāng)teph，bact，subbact，bbcu同時出現(xiàn)陽性信號，但tyne，bbne不出現(xiàn)信號，判定為大洋洲桔實蠅Bactrocera(B.)curvipennis；當(dāng)teph，bact，subbact，bbmu同時出現(xiàn)陽性信號，判定為香蕉實蠅Bactrocera(B.)musae；當(dāng)tcph，bact，subbact，bbum同時出現(xiàn)陽性信號，判定為三帶實蠅Bactrocera(B.)umbroa；當(dāng)teph，bact，subbact，baja同時出現(xiàn)陽性信號，判定為扎維斯實蠅Bactrocera(Afrodacus)jarvisi；當(dāng)teph，bact，subbact，bacu-1，bacu-2同時出現(xiàn)陽性信號，判定為黃瓜實蠅Bactrocera(Austrodacus)cucumis；當(dāng)teph，bact，subbact，bgca同時出現(xiàn)陽性信號，bbcu也出現(xiàn)信號，判定為艷實蠅Bactrocera(Gymnodacus)calophylli；當(dāng)teph，bact，subbact，bpde同時出現(xiàn)陽性信號，但bgca，bbcu不出現(xiàn)信號，判定為日本南瓜實蠅Bactrocera(Paradacus)depressa；當(dāng)teph，bact，subbact，bpex同時出現(xiàn)陽性信號，判定為平展實蠅Bactrocera(Paratridacus)expandens；當(dāng)teph，bact，subbact，bdol-1，bdol-2同時出現(xiàn)陽性信號，判定為橄欖實蠅Bactrocera(Daculus)oleae；當(dāng)teph，bact，subzeug同時出現(xiàn)陽性信號，判定為亞屬Zeugodacus sp.；當(dāng)teph，bact，subzeug，tacu，bzta同時出現(xiàn)陽性信號，判定為南瓜實蠅Bactrocera(Z.)tau；當(dāng)teph，bact，subzeug，tacu，bzcu-1，bzcu-2同時出現(xiàn)陽性信號，判定為瓜實蠅Bactrocera(Z.)cucurbitae；當(dāng)teph，bact，subzeug，sais-1，sais-2同時出現(xiàn)陽性信號，判定為具條實蠅Bactrocera(Z.)scutellata；teph，bact，subzeug，sais-1，sais-2，bzis同時出現(xiàn)陽性信號，判定為石垣島實蠅Bactrocera(Z.)ishigahiensis；Ceratitits屬實蠅的鑒定當(dāng)teph，cera同時出現(xiàn)陽性信號，判定為小條實蠅屬Ceratitis spp.；當(dāng)?shù)刂泻嵪墶⒓{塔爾實蠅和非洲芒果實蠅的結(jié)果判定見以下實例3。
實施例2 桔小實蠅五個復(fù)合種分類檢測生物芯片及其檢測方法桔小實蠅B.(B.)dorsalis及其四個重要復(fù)合種(木瓜實蠅B.(B.)papayae、楊桃實蠅B.(B.)carambolae、菲律賓實蠅B.(B.)philippinensis、芒果實蠅B.(B.)occipitalis)生物芯片檢測探針排布如表8及圖2所示。探針包括科通用探針1條、屬通用探針1條、亞屬通用探針1條、復(fù)合種特異探針6條、種特異探針2條，一組質(zhì)控探針(陽性、陰性和空白對照探針)和定位點探針。探針點陣如圖2，檢測探針和質(zhì)控探針的每條探針橫向重復(fù)3點。探針序列參照表1、表2。上述探針可實現(xiàn)果實蠅屬Bactrocera spp.種類初篩和區(qū)分鑒定桔小實蠅五個復(fù)合種。
表8桔小實蠅五個復(fù)合種生物芯片檢測探針排布示意列表
除探針排列方式以外，該實施例中桔小實蠅五個復(fù)合種生物芯片的制備及檢測方法與實施例1中所描述方法的基本相同。
此外，利用本實施例的生物芯片對桔小實蠅五個復(fù)合種進(jìn)行分類檢測時，結(jié)果判定按照以下描述的方法進(jìn)行。
在質(zhì)控探針和定位點探針均正常的情況下，檢測結(jié)果和判斷原則如下當(dāng)teph出現(xiàn)陽性信號，判定為實蠅科Tephritidae；當(dāng)teph，bact同時出現(xiàn)陽性信號，判定為果實蠅屬Bactrocera spp.；當(dāng)teph，bact，subbact同時出現(xiàn)陽性信號，判定為果實蠅亞屬Bactrocera sp.；當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1同時出現(xiàn)陽性信號，判定為桔小實蠅五個復(fù)合種Bactrocera dorsalis complex；當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-5同時出現(xiàn)陽性信號，判定為楊桃實蠅Bactrocera carambolae；當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-5同時出現(xiàn)陽性信號，判定為菲律賓實蠅Bactrocera philippinensis；當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-6同時出現(xiàn)陽性信號，判定為桔小實蠅Bactrocera dorsalis；當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-3，dor-comp-4，dor-comp-5，dor-comp-6同時出現(xiàn)陽性信號，判定為木瓜實蠅Bactrocera papayae。
當(dāng)teph，bact，subbact，dor-comp-1，dor-comp-2，dor-comp-4，dor-comp-6，bboc-1，bboc-2同時出現(xiàn)陽性信號，判定為芒果實蠅Bactrocera occipitalis；
實施例3 地中海實蠅及其近緣種分類檢測生物芯片及其檢測方法地中海實蠅C.capitata及其二個近緣種納塔爾實蠅C.rosa和非洲芒果實蠅C.cosary生物芯片檢測探針排布如表9所示。探針組除定位點探針外，還包括科通用探針1條、屬通用探針1條、近緣種特異探針2條、種特異探針4條和一組質(zhì)控(陽性、陰性和空白對照)探針。檢測探針、質(zhì)控探針和定位點探針的探針點陣如圖3所示，檢測探針和質(zhì)控探針的每條探針橫向重復(fù)3點。上述探針組可實現(xiàn)小條實蠅屬Ceratitis spp.種類初篩和地中海實蠅、納塔爾實蠅和非洲芒果實蠅的種類鑒定。
表9地中海實蠅及其近緣種生物芯片檢測探針排布示意列表
除探針排列方式以外，該實施例中地中海實蠅及其近緣種生物芯片的制備及檢測方法與實施例1中所描述方法的基本相同。
此外，利用本實施例的生物芯片對地中海實蠅及其近緣種進(jìn)行分類檢測時，結(jié)果判定按照以下描述的方法進(jìn)行。
在質(zhì)控探針和定位點探針均正常情況下，檢測結(jié)果和判斷原則如下當(dāng)teph出現(xiàn)陽性信號，判定為實蠅科Tephritidae.；當(dāng)teph，cera同時出現(xiàn)陽性信號，判定為小條實蠅屬Ceratitis spp.；當(dāng)teph，cera，caro，cpro同時出現(xiàn)陽性信號，判定為納塔爾實蠅Ceratitis rosa；當(dāng)teph，cera，caco-1，caco-2，ccco同時出現(xiàn)陽性信號，判定為非洲芒果實蠅Ceratitiscosyra；當(dāng)teph，cera，caro，caco-1，caco-2，ceca-1，ccca-2同時出現(xiàn)陽性信號，判定為地中海實蠅Ceratitis capitata.
實施例4 實蠅生物芯片的檢測試劑盒本發(fā)明提供了對實蠅科昆蟲卵、幼蟲、蛹和成蟲快速鑒定或初篩的生物芯片檢測試劑盒。試劑盒包括試劑和芯片。根據(jù)需要，芯片可以選用實施例1～3中的任意一種芯片。
試劑盒組成與貯存條件實蠅芯片試劑盒由芯片、芯片蓋片、標(biāo)記PCR試劑、陽性對照樣品、2×雜交緩沖液等組分組成，同時還附1份使用手冊，各組分的數(shù)量或容積、貯存條件見表4。
表10實蠅芯片檢測試劑盒
實蠅芯片試劑盒可實現(xiàn)地中海實蠅及其近緣種的鑒定和區(qū)分、桔小實蠅5個復(fù)合種的鑒定與區(qū)分，同時還可實現(xiàn)32種危險性實蠅的種類鑒定和按實蠅屬Anastrepha、果實蠅屬Bactrocera和小條實蠅屬Ceratitis三個屬實蠅的種類初篩。試劑盒具有快速、靈敏和高通量并行檢測的能力，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，可應(yīng)用于出入境檢驗檢疫系統(tǒng)、食品衛(wèi)生監(jiān)督系統(tǒng)以及農(nóng)業(yè)植保部門對實蠅的檢測和監(jiān)控工作，也可用于進(jìn)行實蠅物種鑒定和區(qū)分。
實驗例 實蠅生物芯片檢測芯片及試劑盒在檢驗檢疫中的應(yīng)用實蠅生物芯片的主要檢測對象是從水果蔬菜中發(fā)現(xiàn)的實蠅類卵、幼蟲、蛹和成蟲等，其中卵、幼蟲和蛹不能作為常規(guī)方法中種類鑒定的依據(jù)，需經(jīng)過實驗室飼養(yǎng)到成蟲才能最后鑒定其種類；上述實蠅樣品用實蠅生物芯片檢測的結(jié)果，可以與用從卵、幼蟲和蛹人工飼養(yǎng)的成蟲鑒定結(jié)果比較，檢驗生物芯片檢測的準(zhǔn)確性。成蟲則可用整頭或部分蟲體進(jìn)行種類復(fù)合性檢測，如發(fā)現(xiàn)為地中海實蠅需要復(fù)核檢測時，可用實蠅生物芯片過到上述目的。
實蠅芯片檢測蟲樣的收集和種類鑒定。舉例說明進(jìn)口龍眼實蠅檢疫鑒定。從進(jìn)口泰國龍眼檢疫中發(fā)現(xiàn)一個蟲果有實蠅卵27粒，收集5-8粒卵，用無水酒精浸泡-4℃保存用于實蠅芯片檢測樣品，其余卵粒接種在龍眼果實上，26-28℃培養(yǎng)2-3天，卵孵化成幼蟲，期間補充幼蟲所需的寄主(新鮮龍眼)，待幼蟲長成2-3齡，取幼蟲2-3頭(用無水酒精浸泡-4℃保存用于實蠅芯片檢測樣品)，其余幼蟲繼續(xù)飼養(yǎng)一周左右后老熟幼蟲化蛹，取蛹1-2頭(用無水酒精浸泡-4℃保存用于實蠅芯片檢測樣品)；其余繼續(xù)飼養(yǎng)，10-15天蛹羽化成蟲并確保形態(tài)特征成熟穩(wěn)定，成蟲置體視顯微鏡鑒定為桔小實蠅Bactroceradorsalis。
期間，將從泰國龍眼上收集的實蠅的卵、幼蟲和蛹樣品分別按照實施例1中所描述的方法進(jìn)行分類檢測，生物芯片檢測與結(jié)果判定同樣為桔小實蠅。
采用相同方法驗證其余31種實蠅，結(jié)果均證明采用本發(fā)明的生物芯片檢測方法進(jìn)行分類的結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，但比傳統(tǒng)方法更加快速、準(zhǔn)確且易于推廣應(yīng)用。
序列表<110>深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心<120>實蠅分類檢測生物芯片、檢測方法及試劑盒<130>0610867<160>60<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>teph探針<400>1agcaaagact gctcctattg ataat 25<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>anst探針<400>2ggaagtgtgc tactacataa taagtatcg 29<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>cera探針<400>3agctggtgag tagtttaatt gtg 23<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>bact探針<400>4cacaatatgg ctggtgaata gttt 24<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>subbact探針<400>5gggtatcagt gaacgaatcc t 21<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>subzeug探針<400>6aatgagctac tacgtagtaa gtgtc 25<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>caro探針<400>7cgttaaacct ccaactgtaa a 21<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>caco-1探針<400>8atagctgggg aataatttaa ttg 23<210>9
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>caco-2探針<400>9ggggaataat ttaattgagt ccc 23<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-1探針<400>10ataatagcaa agattgctcc tattga 26<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-2探針<400>11ccgataaata tgataatgaa ctgactt 27<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-3探針<400>12ttactccgat agacatgata ataaattg 28<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>dor-comp-4探針<400>13ctacgtaata tgtgtcatga agaa 24<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-5探針<400>14aaaccctagg gcttacaata tgg 23<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>dor-comp-6探針<400>15atcatttagg attcaatact agccc 25<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>tyne探針<400>16agtgggtacc agtgaacaaa c 21<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>tycu探針<400>17ctcatagcat agctggggaa taa 23<210>18
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>coza探針<400>19caatgaatta gctaggacaa ctcct 25<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>tacu探針<400>20tgaagaataa tatcaacaga agagt 25<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>sais-1探針<400>21ataaatatga tgataaattg gctt 24<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>sais-2探針<400>22ataatgtcta cggaagaatt agc 23<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bpde探針<400>23atgaattagc aaggacgact c 21<210>24<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bacu-1探針<400>24gctcataaca tagctggtga ataatt 26<210>25<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bacu-2探針<400>25ccagttaatc ctccgactgt aaa 23<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>ccca-1探針<400>26agaacaacgc ccgttaaacc 20<210>27
<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>ccco探針<400>28ctgttaaacc cccaactgtg a 21<210>29<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>cpro探針<400>29acataatgga agtgtgctac aac 23<210>30<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>anlu探針<400>30gtaaataaga agacaaaccc tagagct 27<210>31<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<223>anob探針<400>31cagatgagtt agcaagtatt actccag 27<210>32<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bboc-1探針<400>32tatgataatg aactgacttt ttaatc 26<210>33<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bboc-2探針<400>33ctccgataaa tatgataatg aactgac 27<210>34<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbal探針<400>34gtcctgtaaa tagcgggtat caa 23<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbdi探針<400>35gaaatgtgcc acgacatagt a 21<210>36
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>bbla-2探針<400>37tttagtcagg ttgggtttag ta 22<210>38<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbfr探針<400>38tttagtacta atcctgtaaa tagtgg 26<210>39<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbne探針<400>39tagttgagtg ccgtgtaatg t 21<210>40<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>bbps探針<400>40ccctattgat aacacatagt gga 23<210>41<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc feature<223>bbco-1探針<400>41gaaatgagca acaacataat atgtgt 26<210>42<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbco-2探針<400>42cctgtaaata gagggtatca gtg 23<210>43<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bbzo-1探針<400>43cgataaatat ggtaataaat tgac 24<210>44<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>bdol探針<220>
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<221>misc_feature<223>bpex探針<400>51ccagatcggg tttagagtga gt 22<210>52<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzta探針<400>52tacaaatccg gctataatag caaa 24<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzcu-1探針<400>53caaaacctaa agctcatagc a 21<210>54<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzcu-2探針<400>54tactccagtt agtcccccaa 20<210>55<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>bzis探針<400>55ctataatagc gaacactgct cctata 26<210>56<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>定位點探針<400>56tggataccca acttagctat taatagtc 28<210>57<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>陽性對照探針<400>57tgagaccaac caactgaaac g 21
<210>58<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>陰性對照探針<400>58gactatagta taagcgcggt cca 23<210>59<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>COI3引物<400>59ttttagttga ctggctacat tacatgg 27<210>60<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>COI5引物<400>60ctggaggggt attttgaagt catt 24
權(quán)利要求
1.一種實蠅分類檢測生物芯片，包括固相載體及固定在載體上的探針，其特征在于所述探針包括科通用探針、屬通用探針以及種通用探針中的至少一種，所述科通用探針為teph，其具有如序列表中Seq ID No.1所示的序列；所述屬通用探針選自anst、cera、bact中的至少一種，其分別具有如序列表中Seq IDNo.2～4所示的序列；所述種通用探針選自以下中的至少一種ccca-1、ccca-2、ccco、cpro、anlu、anob、bboc-1、bboc-2、bbal、bbdi、bbla-1、bbla-2、bbfr、bbne、bbps、bbco-1、bbco-2、bbzo-1、bbzo-2、bbmu、bbum、bgca、baja、bdol-1、bdol-2、bpex、bzta、bzcu-1、bzcu-2、bzis，其分別具有如序列表中Seq ID No.26～55所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種實蠅分類檢測生物芯片，其特征在于所述探針還包括亞屬通用探針和/或復(fù)合種/近緣種特異探針；所述亞屬通用探針選自subbact、subzeug中的至少一種，其分別具有如序列表中Seq ID No.5～6所示的序列；所述復(fù)合種/近緣種特異探針選自以下中的至少一種caro、caco-1、caco-2、dor-comp-1、dor-comp-2、dor-comp-3、dor-comp-4、dor-comp-5、dor-comp-6、tyne、tycu、bbcu、coza、tacu、sais-1、sais-2、bpde、bacu-1、bacu-2，其分別具有如序列表中Seq ID No.7～25所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的一種實蠅分類檢測生物芯片，其特征在于所述探針還包括定位探針、陽性對照探針、陰性對照探針中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的一種實蠅分類檢測生物芯片，其特征在于所述定位點探針具有如序列表中Seq ID No.56所示的序列；所述陽性對照探針具有如序列表中SeqID No.57所示的序列；所述陰性對照探針具有如序列表中Seq ID No.58所示的序列。
5.一種實蠅分類鑒定方法，所述方法包括步驟從實蠅科昆蟲卵、幼蟲、蛹或成蟲提取基因組DNA，用通用引物COI3/COI5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的PCR產(chǎn)物與權(quán)利要求
1～4任意一項所述的實蠅分類檢測生物芯片雜交，所述通用引物COI3/COI5分別具有如序列表中Seq ID No.59～60所示的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的一種實蠅分類鑒定方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增過程中利用熒光摻入法進(jìn)行熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的一種實蠅分類鑒定方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94℃/1.5min；94℃/30s-55℃/30s-72℃/30s，40個循環(huán)；72℃/5min。
8.一種實蠅分類檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有權(quán)利要求
1～4任意一項所述的實蠅分類檢測生物芯片。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種實蠅分類檢測生物芯片、檢測方法及檢測試劑盒。本發(fā)明的生物芯片，通過選用實蠅科通用探針、屬通用探針以及種特異探針，或者進(jìn)一步選用亞屬通用探針以及復(fù)合種/近緣種特異探針，能夠快速、準(zhǔn)確、高通量地鑒定實蠅物種，并且不僅對實蠅成蟲，對實蠅卵、幼蟲以及蛹也能實現(xiàn)準(zhǔn)確分類鑒定。
文檔編號G01N21/64GK1995393SQ200610157807
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月20日
發(fā)明者余道堅, 章桂明, 李建光, 任魯風(fēng), 楊偉東, 汪萬春, 陳枝楠, 周琦, 徐浪 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan