專利名稱：口服可溶性經(jīng)調(diào)節(jié)柑桔果膠抑制癌癥轉(zhuǎn)移的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及用于治療前列腺癌的方法。
背景技術(shù)：
預(yù)計(jì)隨著人口老齡化多種癌癥的發(fā)病率會(huì)增加。例如，美國男性中前列腺癌是最常見確診的癌癥，且也是男性癌癥死亡的第二大病因。據(jù)認(rèn)為1994年將有20萬例新近被確診的前列腺癌患者，且將有3萬8千例患者死于前列腺癌，這些數(shù)字隨著人口老齡化會(huì)繼續(xù)上升。大約50％確診患有前列腺癌的患者患有已經(jīng)或?qū)⒆郧傲邢俎D(zhuǎn)移的疾病。前列腺癌向骨骼系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，并且病人典型地死于不可阻擋的骨轉(zhuǎn)移性疾病。到目前為止，還無有效的治療方法，而且對患轉(zhuǎn)移性疾病的患者僅有極少的治療方法。
腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程需要細(xì)胞與原發(fā)腫瘤分離，侵入基底膜，自腫瘤細(xì)胞栓子穿過血流，與靶器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，滲出且增殖形成如同E.C.Kohn，抗癌治療，13，2553(1993)；和L.A.Kiotta，P.S.Steeg，W.G.Stettler-Stevenson，細(xì)胞64，327(1991)所描述的繼發(fā)腫瘤集落。
一般認(rèn)為轉(zhuǎn)移的級聯(lián)過程之多個(gè)階段包含由如糖結(jié)合蛋白的細(xì)胞表面成分介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用，所說的糖結(jié)合蛋白包括如A.Raz，R.Lotan，癌癥轉(zhuǎn)移回顧，6，433(1987)；和H.J.Gabius，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)1071，1(1991)所述的半乳糖苷結(jié)合的凝集素(galectins)。在將B16黑素瘤與uv-2236纖維肉瘤細(xì)胞靜注入同基因小鼠尾靜脈之前，以抗半乳糖苷結(jié)合的凝集素單克隆抗體于體外對其進(jìn)行處理可以顯著抑制腫瘤肺部集落的發(fā)展，如L.Meromsky，R.Lotan，A.Raz，癌癥研究46，5270(1991)所述。以半乳糖苷結(jié)合的凝集素-3cDNA對低轉(zhuǎn)移性、低半乳糖苷結(jié)合的凝集素-3表達(dá)性的uv-2237-cll5纖維肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染使受轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性表型增加，如A.Raz，D.Zhu，V.Hogan，J.Shah，T.Raz，R.Karkash，G.Pazerini，P.Carmi，國際癌癥雜志46，871(1990)所述。另外，人乳頭狀甲狀腺癌之半乳糖苷結(jié)合的凝集素-3-表達(dá)水平與人結(jié)腸直腸和胃癌腫瘤分期之間已建立了相關(guān)關(guān)系，如L.Chiariotti，M.T.Berlinjieri，P.DeRosa，C.Battaglia，N.Berger，C.B.Bruni，A.Fusco，Omeogene 7，2507(1992)；L.Irimura，Y.Matsushite，R.C.Sutton，D.Carralero，D.W.Ohanesian，K.R.Cleary，D.M.Ota，國際癌癥雜志51，387(1991)；R.Lotan，H.Ito，W.Yasui，H.Yokozak，D.Lotan，E.Tahara，國際癌癥雜志56，474(1994)；及M.M.Lotz，C.W.Andrews，C.A.Korzelius，E.C.Lee，G.D.Steele，A.Clarke，A.M.Mercurio，PNAS，USA90，3466(1993)所述。
已顯示如甲基-α-D乳糖苷(lactoside)和乳-N-四糖的單糖可抑制B16黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而D-半乳糖和阿拉伯半乳糖抑制L-1肉瘤細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移，如J.Beauth等癌癥研究臨床腫瘤學(xué)雜志113，51(1987)。
已知將B16-F1鼠黑素瘤細(xì)胞與柑桔果膠或經(jīng)調(diào)節(jié)的柑桔果膠一同靜脈注射至同基因小鼠中可分別引起肺部集落的顯著增加或減少，如D.Platt及A.Raz，全國癌癥研究所雜志84438-42(1992)所述。在本文所公開的發(fā)現(xiàn)之前，還未存在一種利用口服的非細(xì)胞毒制劑抑制癌癥轉(zhuǎn)移的有效治療方法。因此，存在著對基于口服一種非細(xì)胞毒制劑的治療方法的需求。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了一種通過口服經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠，優(yōu)選水溶性pH調(diào)節(jié)的柑桔果膠，治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法，如本文所述為抑制轉(zhuǎn)移。
另一方面，本發(fā)明提供了一種適于治療哺乳動(dòng)物癌癥的組合物，它包括經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠，優(yōu)選pH調(diào)節(jié)的柑桔果膠，與用于口服的藥物學(xué)可接受的、能消化的載體之混和物。
另一方面，本發(fā)明的方法和組合物用于治療人及其它哺乳動(dòng)物前列腺癌，以抑制原發(fā)腫癌的轉(zhuǎn)移。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案提供了一種新的治療方法，其中口服一種富含半乳糖苷殘基的非細(xì)胞毒天然復(fù)合糖即pH調(diào)節(jié)的柑桔果膠(MCP)，這種復(fù)合糖起有效的自發(fā)性前列腺癌轉(zhuǎn)移之抑制劑的作用。
按照本發(fā)明進(jìn)行治療時(shí)，在接種106Dunning大鼠前列腺腺癌MLL細(xì)胞后第14天時(shí)切除原發(fā)腫瘤后觀察到16只生長有腫瘤的大鼠中有7只經(jīng)尸檢無腫瘤存在(淋巴結(jié)或肺中無可見性轉(zhuǎn)移灶)，而對照組16/16的大鼠有轉(zhuǎn)移灶。與對照組相比口服1％(w/v)MCP顯著減低了其余動(dòng)物的腫瘤肺部病灶的數(shù)量(對照，9±4；1％MCP，1±1)，對原發(fā)腫瘤的生長無作用。于體外MCP以時(shí)間-劑量依賴方式抑制MLL細(xì)胞粘附至大鼠內(nèi)皮細(xì)胞及其于半固體培養(yǎng)基中的集落形成。MCP作用的可能機(jī)制似涉及腫瘤細(xì)胞表面糖結(jié)合蛋白。
因此，本發(fā)明提供了一種口服MCP治療癌癥的方法，MCP為一種具有獨(dú)特作用機(jī)制可成功抑制腫瘤細(xì)胞離散的非毒性藥物。另外，本發(fā)明提供了一種包含了MCP與口服藥劑載體的治療哺乳動(dòng)物癌癥的組合物。


圖1A為一顯示患有肺轉(zhuǎn)移大鼠數(shù)目在0.1％MCP和1.0％MCP組與對照組相比顯著降低的圖。
圖1B為一顯示以1.0％MCP治療動(dòng)物的肺中所存在的轉(zhuǎn)移灶與對照組相比顯著減少的圖。
圖1C為對照大鼠肺的顯微照片。
圖1D為1.0％MCP大鼠肺的顯微照片。
圖2為MLL細(xì)胞中大鼠半乳糖苷結(jié)合的凝集素-3表達(dá)的細(xì)胞表面染色和Western印跡分析(插圖)的標(biāo)圖。
圖3A為說明MLL細(xì)胞在MCP不存在或存在不同濃度的情況下于4℃經(jīng)90分鐘附著情況的圖。
圖3B為說明MLL細(xì)胞在存在或不存在(----)0.03％w/vMCP時(shí)附著于RAEC融合單層的時(shí)間過程圖。
圖3C為不存在MCP時(shí)熒光MLL細(xì)胞粘附于RAEC細(xì)胞的顯微照片。
圖3D為存在0.1％w/vMCP時(shí)熒光MLL細(xì)胞粘附于RAEC細(xì)胞的顯微照相片。
圖4A為一顯示MCP于0.5％瓊脂糖中對MLL集落形成之影響的圖。
圖4B為無MCP生長時(shí)MLL細(xì)胞位相顯微照片。
圖4C為含0.1％(w/v)MCP生長時(shí)MLL細(xì)胞位相顯微照片。
圖5為人原發(fā)前列腺腺癌組織的顯微照片，它顯示了半乳糖苷結(jié)合的凝集素-3的存在。
圖6為說明在不同濃度CP(O)或MCP(O)存在時(shí)CP和MCP對B16F1與層粘連蛋白粘附的影響。垂直小柱表示平均值±由平均值七分布計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖7A為鋪于層粘連蛋白上之B16F1細(xì)胞的位相顯微片。細(xì)胞僅在DMEM中培養(yǎng)。
圖7B為鋪于層粘連蛋白上并在含0.5％CP的DMEM中培養(yǎng)的B16F1細(xì)胞之位相顯微照片。
圖7C為鋪于層粘連蛋白上并在含0.5％MCP的DMEM中培養(yǎng)的B16F1細(xì)胞之位相顯微照片。
圖8為一說明在僅有20μg/ml無唾液酸胎球蛋白(asialofetuin)(A)或加有0.5％CP(B)或0.5％MCP(C)時(shí)CP及MCP對無唾液酸胎球蛋白誘導(dǎo)的同型凝集之作用。垂直小柱表示平均值±平均值t分布計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖9A為僅有20μg/ml無唾液酸胎球蛋白時(shí)B16F1細(xì)胞同型凝集的位相顯微照片。
圖9B為有0.5％CP和無唾液酸胎球蛋白時(shí)B16F2細(xì)胞同型凝集的位相顯微照片。
圖9C為有0.5％MCP和無唾液酸胎球蛋白時(shí)B16F1細(xì)胞同型凝集的位相顯微照片。
圖10為說明半乳糖苷結(jié)合的凝集素-3與MCP涂布孔之結(jié)合的圖。
圖11為說明CP及MCP對B16F1細(xì)胞在0.5％瓊脂糖(CPOMCPO)中形成集落之能力影響的圖。
優(yōu)選實(shí)施方案之詳細(xì)描述如本文所用，術(shù)語“治療性”治療指給已被診斷患有癌癥的個(gè)體口服預(yù)定量的經(jīng)調(diào)節(jié)的柑桔果膠，此方法可有效地增加用藥者之生存。
如本文所用，術(shù)語“癌癥”指任何新生物疾病，包括如細(xì)胞性疾病，例如腎細(xì)胞癌、Kaposi化肉瘤、慢性白血病、乳腺癌、肉瘤、卵巢癌、直腸癌、喉癌、黑素癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肥大細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺腺癌、咽鱗狀細(xì)胞癌及胃腸道或胃癌。優(yōu)選地在本發(fā)明中進(jìn)行治療的癌癥為人前列腺癌，最優(yōu)選人前列腺腺癌。
本文所用的縮略語為CP，天然柑桔果膠；MCP，pH調(diào)節(jié)的CP；EHS，Englebreth-Holm Swarm；DMEM，Dulbecco′s改良Eagle化最低限度必需培養(yǎng)基；CMF-PBS，無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖鹽液，pH7.2；BSa，牛血清白蛋白。
如在文章“柑桔果膠對B16-F1黑素細(xì)胞肺部集落化之調(diào)節(jié)”(全國癌癥研究所雜志，84卷第六期，1992年3月18日)中所描述，以前已對柑桔果膠(CP)(一種富含半乳糖殘基的復(fù)合多糖)及其pH調(diào)節(jié)的衍生物(MCP)對B16黑素瘤實(shí)驗(yàn)性的轉(zhuǎn)移之作用進(jìn)行了分析，該文全文引入本文作為參考。已發(fā)現(xiàn)將MCP與B16-F1細(xì)胞一同靜注可顯著抑制腫瘤細(xì)胞在受注射小鼠肺部形成集落。在下文中將更全面描述的CP之pH調(diào)節(jié)將產(chǎn)生與未調(diào)節(jié)CP相似但更小的非支鏈糖鏈的糖組合物。MCP在體外和體內(nèi)均顯示出無毒性。
本發(fā)明所用的已調(diào)節(jié)的果膠是通過對柑桔果膠部分解聚，優(yōu)選pH調(diào)節(jié)，制備的。
正如本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員將理解的，未經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠分子量范圍在約20,000-400,000之間。正是所有植物組織細(xì)胞壁上存在的多糖類物質(zhì)起著細(xì)胞間粘接物的作用。果膠最豐富來源之一是檸檬或橙子果皮，它含有約30％的這種多糖。這種多糖以插入(1-2)-L-鼠李糖殘基的α-(1-4)連接之D-聚半乳糖醛酸序列的部分甲基酯天然存在。中性糖D-半乳糖、L-阿糖、D-木糖和L-巖藻糖在果膠分子上形成側(cè)鏈。D.A.Rees，A.W.Wight等人已進(jìn)行了結(jié)構(gòu)研究(J.Chem Soc.B，1971，1366)。以溶液形式和凝膠形式的二級和三級結(jié)構(gòu)由D-A.Rees，E.J.Welsh，Angew.Chem.Int.Ed 16，214(1977)進(jìn)行了描述。一篇綜述及文獻(xiàn)目錄由Towle，Christensen完成(Industrial Gums，R.L.Whistler，Ed.(AcademicPress，New York，2nd，ed.，1973)P.429-461)。一本值得注意的關(guān)于果膠的書由Z.I.Kertesz完成，The Pectic Substance(Interscience，New York，1951)。
果膠是以粗或細(xì)粉、淡黃白色、實(shí)際上無氣味且
起來發(fā)粘的形式存在。它在20份水中幾乎完全溶解，形成一含帶負(fù)電荷、水合程度非常高的顆粒的粘稠溶液。它對石蕊呈酸性并且不溶于酒精或已稀釋的酒精，而且也不溶于其它的有機(jī)溶劑中。如果首先以酒精、甘油或糖漿將其潤濕，或如果首先將其與3份或以上的蔗糖混和，它可更容易地溶于水。它在輕度酸性條件下保持穩(wěn)定；更強(qiáng)的酸性或堿性條件引起解聚。
在制備本發(fā)明所用之pH調(diào)節(jié)柑桔果膠中用作起始材料的一種優(yōu)選果膠可從位于圣路易斯(密蘇里)的Sigma Chemical Co.處購得。該物質(zhì)分子量為70-100kd，重量的約85％為半乳糖醛酸基團(tuán)且重量的約9.5％為甲氧基因，并且含有少于10％的水分。它可以粉狀的形式得到。柑桔果膠也可從ICN Biomedicals處以Pectin102587 RT的號碼購得。
制備0.5％，更優(yōu)選1.0％w/v的柑桔果膠水溶液(除非特別指明，本文所有溶液濃度均以w/v表示)，并且在UV下照射48小時(shí)滅菌。為使果膠部分解聚，以NaOH(3N)增加pH至10.030分鐘調(diào)節(jié)果膠溶液，然后以HCl(3N)使pH降至3.0，這是根據(jù)Alberscheim等人在文章“AMethod for Analysis of Sugars in Plant Cell Wall Polysaccharides by GasLiquid Chromatography”，Carbohydrate Research，5340-346，1967中描述的方法進(jìn)行的，該文全文引入本文作為參考。約10-24小時(shí)后，溶液的pH平衡至約6.3。然后以乙醇(70％)沖洗溶液并以丙酮(100％)干燥。這就產(chǎn)生了平均分子量約10kd的果膠片段，這一測定結(jié)果依照Christensen在“Methods of Grading Pectin in Relation如MolecularWeight(intrinsic viscosity of pectin)”，F(xiàn)ood Research 19163-165(1954)一文中的方法，即以20mM的六偏磷酸鈉(pH4.5)、0.2％EDTA和(0.9％)NaCl于25℃在Ubbelohde No.1粘度計(jì)中進(jìn)行粘度測定而測得，該文全文引入本文作為參考。本文所用的術(shù)語“經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠”和“MCP”應(yīng)指已解聚的果膠。更優(yōu)選的是，本發(fā)明所用的經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠分子量約為1-15kd，最優(yōu)選為約10kd，而且優(yōu)選按照上文的方法制備，并且優(yōu)選為水溶性，已干燥的MCP片段可以以不含Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖鹽液(pH7.2)(CMF-PBS)再水化至0.5％(w/v)的終貯存液。
如所陳述的，本發(fā)明中MCP是經(jīng)口服用的，因此本發(fā)明提供了一種含有MCP和一種可消化的藥用載體的組合物。適宜的可消化藥用載體包括將MCP以干燥形式包入其中的明膠膠囊，或?qū)CP與羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、硬脂酸鎂、微晶纖維素、丙二醇、硬脂酸鋅及二氧化鈦等混合其中的片劑。該組合物可用純化水、香味劑及作為可消化載體的蔗糖制成液體，從而制備出在服藥者服用時(shí)具有令人愉快味道的組合物。
準(zhǔn)確的劑量及用量方案依服用者的年齡、體重、病史等多種可變因素而不同。依據(jù)治療癌癥有效的MCP成分(即不考慮可消化載體)之重量的優(yōu)選劑量及用量方案為每天每公斤體重為約10至約1000mg。將MCP以相同的間隔口服，即每24小時(shí)約10-1000mg/kg和/或每6小時(shí)2.5-250mg/kg。同樣的劑量和用量方案優(yōu)選用于治療哺乳動(dòng)物前列腺癌，包括人前列腺癌，以減少或抑制轉(zhuǎn)移。據(jù)信同樣的劑量和用量方案在作為口服預(yù)防組合物服用時(shí)，將有效地預(yù)防高危哺乳動(dòng)物服藥者的癌癥發(fā)生。
實(shí)施例下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明的各個(gè)方面，而不是以任何方式限制本發(fā)明。
前列腺癌的Dunning(R3327)大鼠前列腺腺癌膜型是由Dunning從一雄性大鼠上發(fā)現(xiàn)的自發(fā)腺腺癌發(fā)展而來，這一過程由W.F.Dunning在NatlCancer Inst Mono 12，351(1963)中進(jìn)行了描述。如J.T.Isaacs，W.D.W.Heston，R.M.Weissman，D.S.Coffey，Cancer Res 38，4353(1978)所述，由原發(fā)腫瘤已發(fā)展了幾種具有不同分化以轉(zhuǎn)移特性的亞系。MAT-LyLu(MLL)亞系為一生長快速、分化差的腺癌細(xì)胞系，如J.T.Isaacs，W.B.Isaacs W.F.J.Feitz，J.Scheres，The Prostate 9，261(1986)；和K.J.Pienta，B.C.Murphy，W.B.Isaacs，J.T.Isaacs，D.S.Coffey，The Prostate 20，233(1992)所述，將1×106MLL細(xì)胞注射入大鼠大腿中約25天內(nèi)會(huì)由于繼發(fā)于過強(qiáng)的原發(fā)腫瘤的影響而導(dǎo)致動(dòng)物死亡。在腫瘤細(xì)胞接種約12天后，原發(fā)的MLL腫瘤開始轉(zhuǎn)移，在此時(shí)間之前進(jìn)行肢體截肢以去除原發(fā)腫瘤可使動(dòng)物痊愈。如果截肢在第12天之后進(jìn)行，如K.J.Pienta，B.C.Murphy，W.B.Isaacs，J.T.Isaacs，D.S.Coffey，The Prostate 20，233(1992)所述，大多數(shù)動(dòng)物在40天內(nèi)死于肺及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中，將可溶性MCP溶于水中長期口服可影響MLL腫瘤產(chǎn)生自發(fā)轉(zhuǎn)移的能力。
為更全面地說明本發(fā)明以及參見圖1A，將大鼠于第0天時(shí)于其后腿注射入1×106MLL細(xì)胞。第4天當(dāng)原發(fā)腫瘤大小約為1cm3時(shí)，持續(xù)地將0.01％、0.1％或1％(w/v)MCP加入大鼠飲水中(N＝每組8只，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次)。于第14天將大鼠麻醉，截去后肢去除原發(fā)腫瘤。加到水中的任何濃度的MCP均不影響原發(fā)腫瘤的生長(平均腫瘤重量對照，4.2±0.26gm，0.01％，4.7±0.7gm；0.1％，4.3±0.37gm，1.0％，5.0±0.25gm)。然后進(jìn)一步追蹤至第30天，此時(shí)將所有組的動(dòng)物殺死并作尸檢。在此期間，動(dòng)物從其飲水中持續(xù)地?cái)z入MCP。對照及治療的動(dòng)物體重均適度增加且MCP治療組動(dòng)物并未觀察到毒性作用。切下肺臟，水中漂洗并于Bouin′s液中固定過夜。與對照組(15/16大鼠有轉(zhuǎn)移)相比，0.1％(P＜0.03)MCP組(7/14大鼠有轉(zhuǎn)移)患有肺轉(zhuǎn)移的大鼠數(shù)目顯著降低(圖1A)(p＜0.001)。各組大鼠每天飲用30±4ml水。在解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)測定MLL腫瘤集落的數(shù)目。1.0％MCP治療組動(dòng)物肺中平均轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目顯著少于對照組(對照組9±4；治療組1±1)(p＜0.05)(圖1B)(Mann-Whitney Test)。MCP的作用顯示出不依賴于其在飲水中的濃度。圖1C和1D也顯示了患腫瘤動(dòng)物肺的情況(C-對照組，D-1.0％MCP組)且突出了MCP降低已發(fā)生的表面MLL肺病灶數(shù)目的作用。1％MCP也顯著有陽性淋巴結(jié)腫瘤的動(dòng)物數(shù)目(對照組55％，MCP治療組13％，p＜0.01)。受治療的動(dòng)物未遭受MCP治療的明顯毒性的作用。動(dòng)物體重的增加率與對照組相同。對照與治療組每天飲水量為30±4ml/只。毛發(fā)狀況，總體行為及大便顏色均無改變。
由于以前已顯示MCP可以干擾細(xì)胞間通過細(xì)胞表面糖結(jié)合的半乳糖苷結(jié)合凝集素-3分子介導(dǎo)的相互作用，因此研究了是否MLL細(xì)胞表達(dá)半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的問題。MLL細(xì)胞如同許多其它癌細(xì)胞一樣可在其細(xì)胞表面表達(dá)半乳糖苷結(jié)合凝集素-3，正如圖2所示的以定量熒光流式細(xì)胞分析所測定的及圖2(印跡插圖)所示的以提取的全部細(xì)胞與單一特異性免抗半乳糖苷凝集素-3肽抗體進(jìn)行免疫印跡所測定的。
腫瘤-內(nèi)皮細(xì)胞粘附被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移過程中一個(gè)關(guān)鍵的步驟，因此研究了MCP對MLL-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的影響，圖3A顯示了Cr標(biāo)記的MLL細(xì)胞在MCP存在或不存在時(shí)與融合的單層大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(RAEC)粘附的情況。發(fā)現(xiàn)MCP是一較強(qiáng)的MLL細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附的抑制劑，圖3A和3B。
MLL和RAEC細(xì)胞生長于補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。RAEC在組織培養(yǎng)孔中長至融合。于37℃在2ml加有0.5％牛血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基中將2.4×106MLL細(xì)胞與5μCiNa51CrO4溫育30分鐘。在較充分的洗滌后，以每孔105向一式四份的RAEC單層上加入MLL細(xì)胞。如圖3A所示，評估了不同濃度MCP存在或不存在時(shí)于4℃經(jīng)90分鐘MLL細(xì)胞的附著情況。以冷磷酸緩沖鹽液將細(xì)胞洗三次以去除未結(jié)合細(xì)胞。然后將細(xì)胞用0.1NNaOH于37℃溶解30分鐘，用β-計(jì)數(shù)計(jì)測定放射活性。各點(diǎn)代表四個(gè)孔的平均值，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行同樣的兩次。小柱代表標(biāo)準(zhǔn)誤，如圖3B所見，測定了0.03％(w/v)MCP不存在(----)或存在時(shí)MLL細(xì)胞附著于RAEC融合的單層細(xì)胞的時(shí)間過程。存在0.03％MCP抑制了MLL細(xì)胞對RAEC的附著。為觀察熒光MLL細(xì)胞對RAEC的粘附，將105MLL細(xì)胞于0.1％FITC中溫育30分鐘。然后充分沖洗，將細(xì)胞加至RAEC單層上。顯示了不存在(圖3C)或存在0.1％(w/v)MCP(圖3D)時(shí)MLL細(xì)胞的結(jié)合情況(以放大160倍顯示)。很明顯MLL細(xì)胞可很快與RAEC單層粘附，而在MCP存在時(shí)只觀察到有較小程度的細(xì)胞附著。圖3C和3D以圖像顯示了MCP對粘附過程的作用。將MLL細(xì)胞與FITC一起懸浮進(jìn)行熒光標(biāo)記，暴露于不含(圖3C)或含0.1％MCP(圖3D)的0.5％牛血清白蛋白中的融合的單層大鼠內(nèi)皮細(xì)胞60分鐘。培養(yǎng)物沖洗以去除未粘附細(xì)胞，然后照相。在未處理的培養(yǎng)物中，熒光MLL細(xì)胞幾乎一致地與內(nèi)皮細(xì)胞單層粘附(圖3C)，而存在0.1％MCP時(shí)顯微鏡視野中幾乎檢測不出熒光細(xì)胞與RAEC單層相連(圖3D)。
細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中生長的能力即錨鏈不依賴性可用作細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，而且藥物或抗體對此過程的抑制可用于測定其效力。細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中的生長需要其以類似于體內(nèi)轉(zhuǎn)移步驟中許多步驟的過程移動(dòng)、侵入及建立新的腫瘤灶。以前已提出腫瘤細(xì)胞通過細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素-3與糖蛋白糖殘基的相互作用的能力，與其與瓊脂糖(D-半乳糖與L-脫水-半乳糖的聚合物)半乳糖殘基相互作用的能力和提供在這種半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞增殖所需的最低支持相關(guān)。結(jié)果已被證實(shí)抗半乳糖苷結(jié)合凝集素-3單克隆抗體能抑制腫瘤細(xì)胞在瓊脂糖中的生長。而且，以小鼠半乳糖苷結(jié)合凝集素-3 cDNA轉(zhuǎn)染正常小鼠成纖維細(xì)胞可導(dǎo)致獲得錨鏈非依賴性生長。
為測定MCP對MLL在0.5％瓊脂糖中的集落形成的作用，以溶于無鈣鎂(CMF)-PBS的0.02％EDTA將MLL細(xì)胞自培養(yǎng)的單層上解離下來并以4×103細(xì)胞/ml懸于含不同濃度MCP或不含MCP的完全RPMI中。于37℃將細(xì)胞溫育30分鐘，然后以1∶1(vol/vol)與預(yù)先加熱至45℃的溶于RPMI之1％瓊脂糖(1∶4，vol/vol)溶液混和。取2ml該混和物置于預(yù)制于6cm直徑皿中的1％瓊脂糖層之上。于37℃溫育細(xì)胞8天，然后固定，計(jì)數(shù)且照相。圖4A顯示了由設(shè)盲的觀察者用倒置相顯微鏡測定的所形成集落數(shù)。0.1％MCP的存在與對照相比顯著抑制了出現(xiàn)的MLL集落數(shù)(p＜0.01，Mann-Whitney)。小柱子代表三次同樣的實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)與S.E.。于不含(圖4B)或含0.1％(w/v)MCP(圖4C)中生長之MLL細(xì)胞的位相顯微照片為放大160倍。如圖4A所示，MCP以劑量依賴方式抑制MLL細(xì)胞在瓊脂糖中的集落形成。MCP即抑制MLL集落的數(shù)量也抑制其大小(圖4B和4C)。MCP的抑制作用顯示為細(xì)胞抑制而不是細(xì)胞毒性，因?yàn)樗鼘w外培養(yǎng)的單層MLL細(xì)胞的生長速度無影響(數(shù)列未列出)。MCP對其它的腫瘤細(xì)胞于軟質(zhì)瓊脂糖中形成集落的能力有相似作用，這些細(xì)胞包括B16-F黑素瘤、UV-2237纖維肉瘤；HT-1080人纖維肉瘤以及A375人黑色瘤，還不知道是否MCP阻斷MLL細(xì)胞與瓊脂糖的半乳糖殘基的結(jié)合，或與含糖生長因子與細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的結(jié)合進(jìn)行競爭。與此相似，還未知道是否MCP抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞肺集落形成與體內(nèi)抑制集落形成相似，盡管這種相關(guān)似乎存在(圖1和圖4)。
這里所展現(xiàn)的結(jié)果提供了預(yù)防自發(fā)性前列腺癌轉(zhuǎn)移的一種新的無毒性及口服的方法。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)半乳糖苷結(jié)合凝集素-3存在于人前列腺癌病理組織標(biāo)本及人前列腺腺癌細(xì)胞系PC-3中。為進(jìn)行免疫組化，將5μm甲醛固定的石蠟包埋之原發(fā)前列腺腺癌切片脫石蠟、再水化并于1mM硬脂酸鈉緩沖液中用微波處理(中-高)10分鐘。沖洗后，將切片在正常山羊血清中阻斷30分鐘，然后與第一抗體大鼠抗-半乳糖苷結(jié)合凝集素-3-TIB-166單克隆抗體溫育。在DPBS中洗切片30分鐘，然后與生物素化的抗-大鼠IgG溫育，沖洗，并與抗生物素蛋白-生物素化的辣根過氧化酶溫育，再與過氧化酶底物3′-3′-二氨基聯(lián)苯胺溫育。將切片以3％甲基綠復(fù)染并置于明膠-甘油上。圖5顯示的切片來自一患侵入性前列腺癌的病人。如圖2圖例所述，將PC-3細(xì)胞提取物進(jìn)行免疫印跡及分析以了解人半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的存在。用TIB-166抗半乳糖苷結(jié)合凝集素-3單克隆抗體進(jìn)行的免疫組化檢測人前列腺標(biāo)本中半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的表達(dá)。半乳糖苷結(jié)合凝集素-3主要在以較少基質(zhì)(stromal)染色且易變的正常上皮染色的前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)(圖5)。以此抗體的半乳糖苷結(jié)合凝集素-3染色與增強(qiáng)的核，胞漿及細(xì)胞表面染色相關(guān)連。進(jìn)一步的研究將測定半乳糖苷結(jié)合凝集素在正常及癌性前列腺組織中的作用以及MCP抑制裸鼠的人前列腺癌轉(zhuǎn)移的能力。MCP分子顯示出口服后可吸收入血且與對于繼發(fā)腫瘤細(xì)胞集落成功的形成之必需的腫瘤細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素天然配體進(jìn)行競爭。由于對果膠分子特征知之甚少，目前正在進(jìn)行確定MCP活性部分的特征以及其血漿水平的工作。似乎MCP的作用發(fā)生在轉(zhuǎn)移的早期階段，可能抑制了腫瘤細(xì)胞栓子的形成以及抑制了癌細(xì)胞與靶器官內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，而不是在后期的過程如轉(zhuǎn)移細(xì)胞的生長，因?yàn)镸CP對MLL原發(fā)腫瘤生長或血管生成無作用。
由于天然柑桔果膠(CP)和pH調(diào)節(jié)的柑桔果膠(MCP)分別是高度支鏈化和非支鏈化復(fù)合多糖，富含半乳糖殘基，能夠與半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的糖結(jié)合功能區(qū)結(jié)合，我們研究了CP和MCP對糖識(shí)別介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞及細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用的影響。MCP而不是CP可抑制B16-F1黑素瘤細(xì)胞粘附至層粘連蛋白及無唾液酸胎球蛋白導(dǎo)致的同型凝集。MCP及CP均可抑制B16-F1細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基即瓊脂糖中的錨鏈-非依賴性生長。這些結(jié)果表明由細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素-3介導(dǎo)的糖識(shí)別可能參與細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用且在錨鏈-非依賴性生長以及體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的栓塞中起作用。
更具體地說，內(nèi)源性的脊椎動(dòng)物半乳糖苷結(jié)合凝集素已在廣泛的組織和細(xì)胞中得到鑒定并確認(rèn)了特征?；谄浯笮?，凝集素被分成兩個(gè)充裕的類別，分子量大小為～14kDa和～30kDa近期已分別被稱為半乳糖苷結(jié)合凝集素-1和半乳糖苷結(jié)合凝集素-3。半乳糖苷結(jié)合凝集素-3代表了很寬范圍的分子，即鼠34kDa(ML-34)和人31kDa(hL-31)腫瘤相關(guān)半乳糖苷結(jié)合凝集素、35kDa或纖維細(xì)胞糖結(jié)合蛋白(CBP35)，IgE-結(jié)合蛋白(εBP)、32kDa巨噬細(xì)胞非一整合蛋白粘連蛋白結(jié)合蛋白(Mac-2)以及大鼠、小鼠和人形式的29kDa半乳糖苷結(jié)合凝集素(L-29)。分子克隆研究已揭示多肽是一致的。半乳糖苷結(jié)合凝集素-3包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)功能區(qū)，一個(gè)含有膠源樣序列的氨基末端功能區(qū)以及包含了半乳糖苷結(jié)合位點(diǎn)的球形羧基末端功能區(qū)。目前還不知道是否所有上文所提及的半乳糖苷結(jié)合凝集素共有同樣的天然配體。盡管已認(rèn)為半乳糖苷結(jié)合凝集素-3為需要還原條件保證其糖結(jié)合活性的S型凝集素，近期的研究已獲得了相反的證據(jù)。幾方面的分析顯示凝集素通過識(shí)別和結(jié)合互補(bǔ)的糖結(jié)合物(glycoconjugate)參與細(xì)胞-細(xì)胞與細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用，且從而在不同的正常及病理過程中起關(guān)鍵作用。
半乳糖苷結(jié)合凝集素-3由已激活的巨噬細(xì)胞和致癌性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移的細(xì)胞高度表達(dá)。該多肽增高的表達(dá)與錨鏈-非依賴性生長。同型凝集及腫瘤細(xì)胞肺集落形成的能力提高有關(guān)聯(lián)，這表明半乳糖苷結(jié)合凝集素促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞在循環(huán)中的栓塞并增強(qiáng)了轉(zhuǎn)移。我們以前已報(bào)道靜脈注射CP增加了B16-F1鼠黑素瘤細(xì)胞肺部集落形成，而MCP減少了肺部集落形成。盡管CP增加的肺部集落形成最大可能是由于其促進(jìn)同型凝集的能力，MCP通過何種機(jī)制預(yù)防肺部集落形成仍未很好地建立。
層粘連蛋白(基底膜主要的非膠原成分)為一載有聚-N-乙酰乳糖胺序列的N-連接糖蛋白，并且參與細(xì)胞粘附、遷移、生長、分化、侵潤及轉(zhuǎn)移。以高親和性與含聚-N-乙酰乳糖胺序列的寡糖結(jié)合之半乳糖苷結(jié)合凝集素也以特異的糖依賴方式與層粘連蛋白的糖側(cè)鏈結(jié)合。
為了進(jìn)一步研究半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的功能特性，我們利用了CP和MCP，并且檢測了其是否將影響B(tài)16-F1鼠黑素瘤細(xì)胞半乳糖苷結(jié)合凝集素相關(guān)的特性。我們發(fā)現(xiàn)(a)MCP，而不是CP，抑制細(xì)胞粘附至層粘連蛋白；(b)MPC抑制無唾液酸胎球蛋白誘導(dǎo)的同型凝集，而CP則增強(qiáng)凝集；和(c)CP及MCP均抑制半固體培養(yǎng)基中錨鏈-非依賴性生長。
CP及EHS層粘連蛋白購自Sigma，St.Louis，Missouri。MCP由CP通過根據(jù)Albersheim等上文描述之方法的pH修飾加以制備。無唾液酸胎球蛋白以于80℃將胎球蛋白在0.05MH2SO4中輕度酸水解(Spiro法；Grand Island Biological Co.，Grand Island，New York)60分鐘。用于它處描述的經(jīng)無唾液酸胎球蛋白親和柱的一步純化法，自細(xì)菌細(xì)胞提取重組半乳糖苷結(jié)合凝集素-3。使用前將以乳糖洗脫的重組半乳糖苷結(jié)合凝集素-3充分地對CMF-PBS透析。從R.Lotan博士(University ofTexas，M.D.Anderson)處獲得抗半乳糖苷結(jié)合凝集素-3單克隆抗體。辣根過氧化物酶(HRP)-結(jié)合的免抗-鼠IgG＋I(xiàn)gM和2，2′-連氮基-二(3-乙基苯基噻唑啉磺酸)(ABTS)底物試劑盒購自Zymed，South SanFrancisco，California。在補(bǔ)充有10％加熱失活的胎牛血清、非必需氨基酸、2MM谷氨酰胺及抗生素的Dulbecco′s改良Eagles′最低限度培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)B16-F1鼠黑素瘤細(xì)胞。將細(xì)胞在7％CO2和93％空氣的潮濕環(huán)境下維持在37℃。
細(xì)胞與層粘連蛋白的粘附-將96孔板的組織培養(yǎng)孔以溶于無Ca2+和Mg2+磷酸緩沖鹽液(pH7.2，CMF-PBS)的EHS層粘連蛋白(2μg/孔)于4℃預(yù)涂布過夜，于室溫下以溶于CMF-PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)阻斷殘余蛋白結(jié)合位點(diǎn)2小時(shí)。以溶于CMF-PBS的0.02％EDTA收獲細(xì)胞并懸于無血清DMEM中。將5×104細(xì)胞在含或不含不同濃度CP或MCP之DMEM中加至各孔中。于37℃溫育2小時(shí)15分鐘后，以CMF-PBS洗去非吸附細(xì)胞。用甲醇將吸附細(xì)胞固定并照相。按照Olier等人的方法測定吸附細(xì)胞的相對數(shù)目。簡而言之，將細(xì)胞以甲基藍(lán)染色，然后加入HCI-乙醇以釋出染料。以平板閱讀器測量光密度(650nm)。
無唾液酸胎球蛋白誘導(dǎo)的同型凝集-以溶于CMF-PBS的0.02％EDTA解離細(xì)胞并以1×106細(xì)胞/ml懸于含或不含20μg/ml無唾液酸胎球蛋白和0.5％CP或0.5％MCP的CMF-PBS中。將各份含0.5ml細(xì)胞懸液的溶液置于硅化玻璃管中于37℃以80rpm攪動(dòng)60分鐘。然后通過以溶于CMF-PBS的1％甲醛固定細(xì)胞終止凝集。樣品用于計(jì)算單個(gè)細(xì)胞數(shù)目，且根據(jù)下列等式計(jì)算所產(chǎn)生的凝集(1-Nt/Nc)×100，其中Nt和Nc分別代表存在受試成分及在對照緩沖液(CMF-PBS)中單個(gè)細(xì)胞的數(shù)目。
半乳糖苷結(jié)合凝集素-3與MCP的結(jié)合-將96孔板以含0.5％MCP和1％BSA的CMF-PBS涂布且干燥過夜。將重組半乳糖苷結(jié)合凝集素-3在含0.5％BSA的CMF-PBS中系列稀釋，加入存在或不存在50mM乳糖的0.05％吐溫-20(溶液A)，溫育120分鐘，此后將孔中水分排干并以含0.1％BSA和0.05％吐溫-20的CMF-PBS(溶液B)沖洗。加入溶于溶液A的大鼠抗-半乳糖苷結(jié)合凝集素-3并溫育60分鐘，然后以溶液B沖洗并與溶于溶液A的HRP結(jié)合的兔抗-大鼠IgG-IgM溫育30分鐘。沖洗后經(jīng)加入ABTS確定結(jié)合于各孔中的結(jié)合酶之相對量。于405nm處測水解程度。
半固體培養(yǎng)基的集落形成-以溶于CMF-PBS的0.02％EDTA解離細(xì)胞并以1×103細(xì)胞/ml懸于含或不含不同濃度CP或MCP的完全DMEM中。于37℃將細(xì)胞溫育30分鐘并再與預(yù)先加溫于45℃的溶于蒸餾水-完全DMEM(124，vol/vol)之1％瓊脂糖溶液混和1∶1(vol/vol)。取2ml混和物置于6cm直徑皿1％瓊脂糖預(yù)鋪層之上。于37℃將細(xì)胞溫育14天，在以加入溶于CMF-PBS的2.6％戊二醛固定后，用倒置相顯微鏡測定形成集落的數(shù)目。
以前已顯示層粘連蛋白可作為可溶性半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的配體，且B16-F1細(xì)胞在其細(xì)胞表面表達(dá)半乳糖苷結(jié)合凝集素-3分子。這些結(jié)果與CP與MCP對靜注B16-F1細(xì)胞的肺部集落形成的影響一起促使我們開始檢測其對B16-F1細(xì)胞粘附層粘連蛋白的作用，以便評價(jià)細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素-3在此過程中的可能作用。如圖6和7A-C所示，MCP以劑量依賴方式顯著抑制細(xì)胞粘附至層粘連蛋白，而CP對細(xì)胞結(jié)合或擴(kuò)散至層粘連蛋白上均無明顯作用。半乳糖苷結(jié)合凝集素-3乳糖的單糖抑制劑以高至100mM的濃度并不抑制細(xì)胞粘附至層粘連蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。用可溶性重組半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的競爭性結(jié)合測定不能阻斷細(xì)胞粘附至層粘連蛋白且抗-Mac-2單克隆抗體也在此方面無作用(數(shù)據(jù)未顯示)，這提示MCP的抑制作用不能僅歸于其破壞半乳糖苷結(jié)合凝集素-3與層粘連蛋白上N-乙酰乳糖胺基側(cè)鏈間的相互作用，因?yàn)榧?xì)胞可利用整合蛋白結(jié)合至層粘連蛋白蛋白核心。進(jìn)一步地講，抗Mac-2單克隆抗體不針對半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的糖結(jié)合功能區(qū)，而是針對其N-末端，因此，MCP阻斷粘附的確切機(jī)制與CP和乳糖相比仍不清楚。MCP的抑制作用不是由于細(xì)胞毒性，因?yàn)镸CP(0.5％)不影響細(xì)胞的活力或體內(nèi)的生長。
現(xiàn)已在腫瘤細(xì)胞體外進(jìn)行同型凝集的傾向性及其體內(nèi)轉(zhuǎn)移潛能之間建立了良好的相關(guān)性。B16黑素瘤細(xì)胞團(tuán)靜脈注射后較單個(gè)的細(xì)胞可產(chǎn)生更多的肺部集落。而且，已顯示抗半乳糖苷結(jié)合凝集素-3抗體抑制無唾液酸胎球蛋白-誘導(dǎo)的同型凝集(14)，這提示細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素多肽導(dǎo)致了在其與糖蛋白側(cè)鏈相互作用后的同型凝集的形成。如圖8和9A-C所示，MCP顯著減少了同型凝集的形成，而CP則起增強(qiáng)作用。最可能的是非支鏈MCP產(chǎn)生類似于特異性糖抑制劑即乳糖的作用，從而遮蓋了細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素-3分子與無唾液酸胎球蛋白的半乳糖苷殘基的相互作用，導(dǎo)致同型凝集的減少。相反，可以想象假設(shè)分支的糖多聚物的結(jié)構(gòu)特征使CP可作為鄰接細(xì)胞之間交聯(lián)的橋梁，導(dǎo)致增強(qiáng)的同型凝集的形成。將其一起加以考慮，可以提示MCP通過破壞對腫瘤細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移病變起關(guān)鍵作用的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-間質(zhì)相互作用來預(yù)防轉(zhuǎn)移。
前文所述的MCP抑制B16-F1細(xì)胞與層粘連蛋白的粘附及同型凝集可能由于其與細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素的相互作用，因?yàn)橐郧耙扬@示CP以乳糖依賴方式結(jié)合B16-F1細(xì)胞表面。為說明半乳糖苷-3與MCP的結(jié)合，我們采用了一種酶聯(lián)免疫吸附測定法，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)重組半乳糖苷結(jié)合凝集素-3以劑量依賴方式與固定化MCP結(jié)合且該結(jié)合被乳糖完全阻斷(圖9)。這些結(jié)果使我們可將MCP的同型凝集抑制作用歸因于其與細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素-3分子的結(jié)合。另一方面，我們不知道MCP(而不是CP)如何減弱B16-F1細(xì)胞對層粘連蛋白的粘附。由于CP(為鏈的復(fù)合多糖聚合物)的pH調(diào)節(jié)，同一糖組合物的非支鏈糖鏈的產(chǎn)生，有可能MCP較CP更傾于結(jié)合至細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素-3分子。將抗-整合蛋白抗體抑制鼠B16黑素瘤細(xì)胞附著至層粘連蛋白底物的事實(shí)一并考慮，我們猜測MCP從空間上抑制層粘連蛋白受體的整合蛋白族對層粘連蛋白的識(shí)別，或者細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素與層粘連蛋白上的聚-N-乙酰乳糖胺序列的相互作用可能與整合蛋白協(xié)調(diào)一致對細(xì)胞粘附至層粘連蛋白起作用。MCP與和半乳糖苷結(jié)合凝集素-3具有同樣糖特異性的半乳糖苷結(jié)合凝集素-1的相互作用可能影響其削弱B16-F1細(xì)胞對層粘連蛋白的粘附和同型凝集的可能性最有可能被排除在外，因?yàn)榘肴樘擒战Y(jié)合凝集素-1為分泌蛋白質(zhì)。
將細(xì)胞于半固體培養(yǎng)基中生長的能力即錨鏈獨(dú)立性“用作細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)檫@一特性只有已轉(zhuǎn)化的和致癌的細(xì)胞通常會(huì)顯示。以前已提示腫瘤細(xì)胞通過細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素-3與糖蛋白糖殘基的相互作用的能力與其和瓊脂糖(一種D-半乳糖和L-脫水半乳糖的聚合物)半乳糖殘基的相互作用有關(guān)，且與在此半固體培養(yǎng)基中集落形成的效能有關(guān)。也已顯示抗-半乳糖苷結(jié)合凝集素-3單克隆抗體抑制腫瘤細(xì)胞在瓊脂糖中的生長，并且半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的表達(dá)與已轉(zhuǎn)化表型的抑制呈反相關(guān)。以小鼠半乳糖苷結(jié)合凝集素-3cDNA對正常小鼠成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致獲得錨鏈非依賴性生長特性。為進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素對細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中生長起關(guān)鍵作用的可能性，我們檢測了CP和MCP對B16-F1黑素瘤細(xì)胞的錨鏈非依賴性生長的作用。如圖11所示，CP和MCP以劑量依賴方式抑制了B16-F1細(xì)胞集落在半固體基質(zhì)中的生長。與此類似，乳糖也以劑量依賴方式抑制錨鏈-非依賴性生長(數(shù)據(jù)未列出)。CP和MCP的這種劑量依賴抑制作用并不局限于對B16-F1黑素瘤細(xì)胞。UV-2237-10-3鼠纖維肉瘤細(xì)胞、HT1080人纖維肉瘤細(xì)胞及A375C1.49人黑素瘤細(xì)胞在軟質(zhì)瓊脂糖中的生長也相同程度的被抑制?？赡芸扇苄缘腃P和MCP與瓊脂糖半乳糖殘基競爭與半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的結(jié)合，這以去除了細(xì)胞的細(xì)胞增殖所需基質(zhì)最低限度的支持的方式產(chǎn)生明顯的生長抑制。CP和MCP以及抗-半乳糖苷結(jié)合凝集素-3抗體可能作為-仍未識(shí)別的糖共聚物生長因子的桔抗劑起作用，該生長因子與半乳糖苷結(jié)合凝集素-3相互作用，或者它們在空間上阻礙已知生長因子靠近膜受體，這些觀點(diǎn)仍可能有爭議。然而，B16-F1細(xì)胞體外的錨鏈依賴性生長以及對同基因小鼠的致癌性并不為MCP(0.5％)所抑制的事實(shí)可能使我們排除前述的可能性。由于細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中生長的能力被用作細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)，所以細(xì)胞表面半乳糖苷結(jié)合凝集素-3的獲得可能是轉(zhuǎn)化后過程中的一個(gè)早期步驟。
權(quán)利要求
1.一種治療性治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法，它包括給患有癌癥的哺乳動(dòng)物口服有效量的經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠為pH調(diào)節(jié)的柑桔果膠。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所說的pH調(diào)節(jié)的柑桔果膠其表觀平均分子量約為1-15kd。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的癌癥為前列腺癌。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的癌癥為人前列腺癌。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠是以與一種藥物學(xué)可接受的可消化之載體混合的形式存在。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所說癌癥的治療為抑制轉(zhuǎn)移。
8.一種用于治療性治療哺乳動(dòng)物癌癥的組合物，它包括一種經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠與一種藥物學(xué)可接受之可消化的口服載體的混合物。
9.權(quán)利要求8所述的組合物，其中所說的經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠為pH調(diào)節(jié)的柑桔果膠。
10.權(quán)利要求9所述的組合物，其中所說的pH調(diào)節(jié)的柑桔果膠其表觀分子量為約1-15Kd。
11.權(quán)利要求3所述的方法，其中所說的pH調(diào)節(jié)的柑桔果膠之表觀平均分子量為約10Kd。
12.權(quán)利要求10所述的組合物，其中所說的pH調(diào)節(jié)的柑桔果膠之表觀分子量為約10Kd。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠為水溶性。
14.權(quán)利要求8所述的組合物，其中所說的經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠為水溶性。
15.一種預(yù)防癌癥的方法，它包括給哺乳動(dòng)物口服經(jīng)調(diào)節(jié)的果膠。
全文摘要
一種治療哺乳動(dòng)物癌癥的方法。本發(fā)明涉及癌癥患者口服可抑制原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的pH調(diào)節(jié)柑桔果膠。
文檔編號C08B37/00GK1157567SQ95194958
公開日1997年8月20日 申請日期1995年6月14日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月7日
發(fā)明者A·雷治, K·J·皮恩塔 申請人:巴巴拉·安·卡馬諾斯癌癥協(xié)會(huì), 韋恩州立大學(xué)