提高布氏桿菌病活疫苗產(chǎn)品活菌率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域，具體地說，涉及一種提高布氏桿菌病活疫苗產(chǎn)品 活菌率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 布魯氏菌?。˙rucellosis)是由布氏菌屬（Brucella)成員引起的一種人畜共患 傳染病，嚴(yán)重威脅著人和多種動物的生命健康。OIE將其列為B類動物疫病，我國將其列為 二類動物疫病。該病流行范圍廣泛，遍及世界各地。病原為布魯氏桿菌，為細(xì)小、兩端鈍圓的 球桿菌或短桿菌，革蘭氏染色陰性，無鞭毛，不運動，不形成芽孢。羊在國內(nèi)為主要傳染源， 其次為牛和豬。研宄認(rèn)為，使用疫苗是預(yù)防和控制布病的有效方法。
[0003] 目前市場上普遍使用的疫苗主要是布氏桿菌病活疫苗（S2株）、布氏菌病活疫苗 (A19株）、布氏桿菌病活疫苗（M5或M5-90株）等，主要用于豬、牛、羊布氏桿菌病的防治。
[0004] 現(xiàn)有布氏桿菌病活疫苗生產(chǎn)規(guī)程如下：
[0005] 一級菌種制備：凍干菌種啟封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋白胨瓊脂平板 或其他適宜培養(yǎng)基上，在36-37°C培養(yǎng)2-3日。觀察菌落形態(tài)，選取合適菌落10個以上，移 植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，36-37°C培養(yǎng)48-72小時，作為一級菌種。在2-8°C，使用期 應(yīng)不超過1個月。
[0006] 二級菌種制備：取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁瓶或其他適宜培養(yǎng)基，置 36-37°C培養(yǎng)48-72小時，肉眼檢查純凈后，每個扁瓶加蛋白胨水（pH 6. 5-7.0)適量，將菌 苔洗下，接種于1-2萬ml的適宜液體培養(yǎng)基，置36-37?培養(yǎng)36-72小時，用肝湯瓊脂進(jìn)行 純粹檢驗，并置2-8 °C保存，使用期應(yīng)不超過30日。
[0007] 菌液培養(yǎng)：按培養(yǎng)基量加入適量的消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基體積的1 % 接種 二級菌種液，在36-37°C逐漸增大通氣量，培養(yǎng)36小時，培養(yǎng)過程中可根據(jù)需要加入50%的 葡萄糖溶液，每次加入量為培養(yǎng)基總量的1% -2%。
[0008] 按現(xiàn)有規(guī)程進(jìn)行布氏桿菌病活疫苗（A19株）、布氏菌病活疫苗（M5或M5-90株）、 布氏桿菌病活疫苗（S2株）生產(chǎn)培養(yǎng)得到菌液的活菌數(shù)A19約為300億/毫升左右，M5 約為500億/毫升左右，S2約為1200億/毫升左右，通過對菌液的進(jìn)一步濃縮，才能到達(dá) 1400-1800億/ml的菌活數(shù)。但是經(jīng)過保存期實驗，疫苗產(chǎn)品存放5個月后，其菌活數(shù)僅能 達(dá)到600-800億/ml，其活菌率約占33 % -57 %。
[0009] 綜上，采用現(xiàn)有規(guī)程生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的疫苗產(chǎn)品存在菌活率低、保存期短、生產(chǎn)成本 高等問題。
[0010] ZL201110180953. 7公開了一種布氏桿菌病活疫苗的制備方法，具體涉及提高布氏 桿菌病活疫苗（A19株）菌活數(shù)的方法，該方法通過在現(xiàn)有規(guī)程的基礎(chǔ)上改變通氣量的方式 提高菌活數(shù)，得到的菌活數(shù)能達(dá)到1500-1800億/ml。通過對該方法生產(chǎn)的活疫苗產(chǎn)品進(jìn)行 保存期試驗，結(jié)果表明疫苗產(chǎn)品存放13個月后，其菌活數(shù)僅能達(dá)到800-1000億/ml，其活菌 率約占44% -61%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的布氏桿菌病活疫苗的生產(chǎn)方法中生產(chǎn)的疫苗產(chǎn)品活 菌率低、保存期短、生產(chǎn)成本高等問題，提供一種提高布氏桿菌病活疫苗產(chǎn)品活菌率的新方 法。
[0012] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的一種提高布氏桿菌病活疫苗產(chǎn)品活菌率的方 法，所述方法包括一級菌種制備、二級菌種制備和菌液培養(yǎng)。
[0013] 其中，在一級菌種制備階段，凍干菌種啟封后，用蛋白胨水溶解，劃線移植于胰蛋 白胨瓊脂平板或其他適宜培養(yǎng)基上，在36-37°C培養(yǎng)2-3日。觀察菌落形態(tài)，選取合適菌落 10個以上，移植于胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基，36-37°C培養(yǎng)48-72小時，作為一級菌種。在 2-8 °C，使用期應(yīng)不超過1個月。
[0014] 在二級菌種制備階段，取一級菌種接種于胰蛋白胨瓊脂扁瓶或其他適宜培養(yǎng)基 上，置36-37°C培養(yǎng)48-72小時，肉眼檢查純凈后，向扁瓶中加入蛋白胨水將菌苔洗下，接種 液體培養(yǎng)基，置36-37 °C通入潔凈壓縮空氣培養(yǎng)36-72小時后，進(jìn)行純粹檢驗，并置2-8 °C保 存。使用期應(yīng)不超過30日。
[0015] 在菌液培養(yǎng)階段，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氨氮含量應(yīng)不低于1.6mg/ml，總氮量不低于 5. 5mg/ml，另外向培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基重量0. 003?0. 005%的消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基體 積的1% -2%接種二級菌種，同時按培養(yǎng)基體積的4% -6%加入濃度為50%的葡萄糖溶 液，在36-37?按照逐步增大通氣量的方式通入潔凈壓縮空氣進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)36小時；在 通氣培養(yǎng)過程中，根據(jù)需要加入濃度為50%的葡萄糖溶液，每次加入量為培養(yǎng)基總重量的 1 % -3%，且培養(yǎng)36小時后培養(yǎng)基的pH值為6. 9-7. 2 (優(yōu)選pH7. 0)。培養(yǎng)結(jié)束后取樣進(jìn)行 純粹檢驗及活菌計數(shù)，應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
[0016] 前述的方法，在菌液培養(yǎng)階段，所述逐步增大通氣量是指單位時間內(nèi)空氣通入單 位培養(yǎng)基氣量，具體如下：
[0017] 0 ?3 小時：0· 1 ?0· 15m3/L ·小時
[0018] 3 ?6 小時：0· 15 ?0· 2m3/L ·小時
[0019] 6 ?9 小時：0· 2 ?0· 23m3/L ·小時
[0020] 9 ?12 小時：0· 23 ?0· 24m3/L ·小時
[0021] 12 ?18 小時：0· 24 ?0· 26m3/L ·小時
[0022] 18 ?24 小時：0· 26 ?0· 3m3/L ·小時
[0023] 24 ?36 小時：0· 3 ?0· 33m3/L ·小時
[0024] 本發(fā)明中使用的消泡劑為聚醚多元醇。
[0025] 所述潔凈壓縮空氣是指普通空氣經(jīng)無油壓縮機壓縮，再經(jīng)吸附式壓縮空氣干 燥器及多級過濾器、除味活性炭過濾器和末端0.22 μπι濾器除菌過濾，其中塵埃粒徑 彡 0· 01 μπι，脫臭彡 99. 5%，殘油彡 0· 003ppm。
[0026] 本發(fā)明中涉及的布氏桿菌病活疫苗包括但不限于S2株、A19株、M5株或M5-90株。
[0027] 本發(fā)明提供了一種提高布氏桿菌病活疫苗產(chǎn)品活菌率的生產(chǎn)工藝，為布氏桿菌病 活疫苗的生產(chǎn)提供了新技術(shù)。通過提高50%葡萄糖溶液加入量，提高培養(yǎng)基氨氮、總氮含 量，控制空氣通入量來提高活菌數(shù)，能夠有效提高布氏桿菌病活疫苗的活菌率，并保持較高 的菌體活力，提高凍干后保存期內(nèi)細(xì)菌的存活率。利用本發(fā)明方法培養(yǎng)得到的菌液的菌活 數(shù)可達(dá)到1800-2200億/ml，保存期13個月其菌活數(shù)能達(dá)到1