一株地衣芽孢桿菌及其在降解高效氯氰菊酯中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株地衣芽孢桿菌，及其在降解高效氯氰菊酯中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 擬除蟲菊醋類農(nóng)藥（Pyrethroid Insecticide)是一類模擬天然除蟲菊素結(jié)構(gòu)人 工合成的高效低毒仿生型殺蟲劑，以神經(jīng)鈉離子通道為作用靶標(biāo)，具有用量低、藥效高、殺 蟲譜廣等優(yōu)點。高效氯氰菊醋（Beta-cypermethrin)是擬除蟲菊醋類殺蟲劑中應(yīng)用范圍較 廣的農(nóng)藥之一，由氯氰菊酯的兩對高效外消旋體混合物組成，其殺蟲活性遠(yuǎn)高于氯氰菊酯， 目前主要用于防治果蔬、茶葉、谷物等作物上的食葉或食果害蟲，以及防治蚊蠅、牲畜寄生 蟲等。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥雖然低毒，使用劑量低，但隨著頻繁使用，有關(guān)該農(nóng)藥的殘留問題 及其危害性也日益暴露出來。已有研宄顯示，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對某些有益昆蟲及水生生 物具有很高的毒性，對人體具有神經(jīng)毒性、蓄積毒性及生殖毒性，高效氯氰菊酯已被美國環(huán) 境保護(hù)局列為致癌物質(zhì)，因此消除或減少農(nóng)藥殘留是一大熱點問題。生物降解是解決農(nóng)藥 殘留的新途徑之一，目前對于降解高效氯氰菊酯的芽孢桿菌研宄報道有限，且由于土壤環(huán) 境復(fù)雜，菌種降解能力不能達(dá)到實驗室水平，因此本研宄不僅可以豐富高效氯氰菊酯降解 菌群，而且為其在生物修復(fù)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明通過富集培養(yǎng)、梯度馴化法篩選得到了一株地衣芽孢 桿菌，其對高效氯氰菊酯的降解率可達(dá)95. 10%。
[0004] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0005] 一株地衣芽孢桿菌，菌株名為BBCY-014,分類命名為：地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis，已于2014年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，保藏編號為CGMCC NO. 9839。
[0006] 本發(fā)明的地衣芽孢桿菌BBCY-014菌株，于2014年3月10日采用富集培養(yǎng)、梯度 馴化法分離于四川成都郫縣菜園土壤，經(jīng)16S rDNA鑒定為地衣芽孢桿菌，經(jīng)對高效氯氰菊 酯的生物降解實驗研宄，該菌在實驗室優(yōu)化條件下對60mg/L濃度的高效氯氰菊酯降解率 為 95. 10%〇
[0007] 本發(fā)明所篩選到的地衣芽孢桿菌BBCY-014菌株有很強(qiáng)的生命活力，在環(huán)境的作 用下具有產(chǎn)生各種酶的能力，兼有耐高溫、耐酸堿等特性。其所產(chǎn)生的特異性酶與高效氯氰 菊酯作用，使其酯鍵斷裂，生成相應(yīng)的中間產(chǎn)物，直到最后礦化。田間試驗表明，地衣芽孢桿 菌BBCY-014菌株對田間高效氯氰菊酯的殘留，7d內(nèi)的去除率達(dá)到90 %以上。
[0008] 本發(fā)明篩選的地衣芽孢桿菌BBCY-014新菌株具有降解農(nóng)藥高效氯氰菊酯的功 能，地衣芽孢桿菌為益生菌，因此其菌懸液能直接用于受農(nóng)藥污染的菜園土壤生物修復(fù)，具 有較好的修復(fù)效果，而且具有可持續(xù)、成本低的特點。
【附圖說明】
[0009] 一株地衣芽孢桿菌，菌株名為BBCY-014,分類命名為：地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis，已于2014年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，保藏編號為CGMCC NO. 9839。保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中 國科學(xué)院微生物研宄所，郵編：1〇〇1〇1。
【具體實施方式】
[0010] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0011] 實驗1地衣芽孢桿菌BBCY-014在實驗室條件下對高效氯氰菊酯的降解
[0012] ①菌株保藏培養(yǎng)基：常規(guī)方法制作改良LB斜面[(NH4) 2S041. 5g，KH2PO4O. 5g， K2HPO4L 5g，MgSO4O. 2g，NaCl 1(λ 5g，胰蛋白胨 10g，酵母浸出粉 5. 0g，超純水 1000mL，瓊脂 2% (w/v)，ρΗ7· 5,加入0· 2%吐溫80(w/v)] 121°C滅菌20min后，加入一定體積高效氯氰菊 酯母液配制為菌株保藏所需l〇〇mg/L濃度，以維持菌株降解能力。最后將培養(yǎng)的斜面菌苔 置于20%的甘油管中-80°C下保藏。
[0013] ②種子液/菌懸液的制備：將菌株接種于含l〇〇mg/L高效氯氰菊酯的改良LB培養(yǎng) 液中[(NH 4)2SO4L 5g，KH2PO4O. 5g，K2HPO4L 5g，MgSO4O. 2g，NaCllO. 5g，胰蛋白胨 10g，酵母浸 出粉 5.0g，超純水 1000mL，ρΗ7·5,加入 0.2%吐溫 80(w/v)]，37°C搖床培養(yǎng)（180r/min)至 對數(shù)期，用無菌生理鹽水離心洗滌（8000r/min，4°C)三次，重懸，調(diào)整細(xì)胞光密度0D_約為 1.0,制成種子液/菌懸液。
[0014] ③液體培養(yǎng)基：（NH4)2SO4L 5g，KH2PO4O. 5g，K2HPO4L 5g，MgSO4O. 2g，NaCl 10. 5g，胰 蛋白胨10g，酵母浸出粉5. 0g，超純水1000mL，pH7. 5,加入0. 2%吐溫80(w/v)，高效氯氰菊 醋濃度 60mg/L，121°C 滅菌 20min。
[0015] 配制如③液體培養(yǎng)基，高效氯氰菊酯濃度60mg/L，在無菌條件下添加按②種子液 的制備方法制備的地衣芽孢桿菌BBCY-014菌懸液，接種量7. 0% (v/v)，培養(yǎng)基初始pH7. 5， 液體培養(yǎng)基錐形瓶裝液量為20mL/100mL，37°C搖床培養(yǎng)（180r/min)66h。
[0016] 結(jié)果：66h后，高效氯氰菊酯濃度降為2. 94mg/L，地衣芽孢桿菌BBCY-014的菌懸液 對高效氯氰菊酯的降解率為95. 10%。
[0017] 實驗2地衣芽孢桿菌BBCY-014在菜園土壤中對高效氯氰菊酯的降解
[0018] 試驗于2014年11月起在成都郫縣紅光鎮(zhèn)某菜園，土壤作物為油白菜。土壤理化性 質(zhì)經(jīng)測定為：砂質(zhì)粘土，土壤pH6. 7,有機(jī)質(zhì)17. 9g/kg，總氮含量2. 3g/kg，總磷含量0. 38g/ kg。在菜園中劃分4塊面積約為IOm2的土壤，其中兩塊土壤噴灑按實驗1中②種子液的制 備方法制備的菌懸液，菌懸液噴施量為4. 5 X 108cfu/g。每天定時采土樣，按5點采樣法，用 專用取土工具，取0?IOcm地表土，一周后測定對照組（未噴施地衣芽孢桿菌菌懸液）和 噴菌組（噴施地衣芽孢桿菌菌懸液）的高效氯氰菊酯的殘留量，結(jié)果見表1，噴施菌懸液的 土壤中高效氯氰菊酯殘留濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于未噴菌的對照組，說明地衣芽孢桿菌BBCY-014能 有效降解菜園土壤中的高效氯氰菊酯，對菜園土壤能起到生物修復(fù)的作用。
[0019] 表1菜園土壤修復(fù)過程中土壤中高效氯氰菊酯的殘留量的變化
[0020]
【主權(quán)項】
1. 一株地衣芽孢桿菌，其特征在于：菌株名為BBCY-014,分類命名為：地衣芽孢桿菌 Bacillus licheniformis，已于2014年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 9839。
2. 權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌在降解高效氯氰菊酯中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：具體應(yīng)用時，培養(yǎng)地衣芽孢桿菌，制成菌 懸液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述菌懸液是通過以下方法制備得到 的： 將地衣芽孢桿菌接種于含l〇〇mg/L高效氯氰菊酯的改良LB培養(yǎng)液中，37°C、180r/min 搖床培養(yǎng)至對數(shù)期，用無菌生理鹽水在8000r/min、4°C條件下離心洗滌三次，重懸，調(diào)整細(xì) 胞光密度OD6c?為1. 0,即得； 所述含l〇〇mg/L高效氯氰菊酯的改良LB培養(yǎng)液是通過以下方法制備得到的：取 (NH4)2SO4L 5g，KH2PO4O. 5g，K2HPO4L 5g，MgSO4O. 2g，NaCl 10. 5g，胰蛋白胨 10g，酵母浸出粉 5. 0g，超純水1000mL，混合混勻，調(diào)整pH至L 5,加入(λ 2%吐溫80,100mg/L高效氯氰菊酯， 即得。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株地衣芽孢桿菌，菌株名為BBCY-014，分類命名為：地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis，已于2014年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.9839。發(fā)明的地衣芽孢桿菌，在實驗室優(yōu)化條件下對60mg/L濃度的高效氯氰菊酯降解率為95.10％；田間試驗表明，對田間高效氯氰菊酯的殘留，7d內(nèi)的去除率達(dá)到90％以上。發(fā)明的地衣芽孢桿菌具有降解農(nóng)藥高效氯氰菊酯的功能，地衣芽孢桿菌為益生菌，因此其菌懸液能直接用于受農(nóng)藥污染的菜園土壤生物修復(fù)，具有較好的修復(fù)效果，而且具有可持續(xù)、成低的特點。CGMCC No.983920141024
【IPC分類】C12R1-10, A62D101-28, C12N1-20, A62D101-04, A62D3-02
【公開號】CN104560836
【申請?zhí)枴緾N201510053324
【發(fā)明人】唐潔, 史穎, 張慶, 車振明, 曾朝懿, 唐鑫, 蔣珍菊, 姚開
【申請人】西華大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年2月2日