一種重組大腸桿菌利用甘油生產丙氨酸的方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程領域，具體地說將參與丙氨酸生物合成的一個基因克 隆并與大腸桿菌高拷貝載體PUC19連接，將重組質粒轉入大腸桿菌中，使用氨芐青霉素作 為篩選標記，以加強該基因在大腸桿菌中的表達量，使丙氨酸可以在大腸桿菌中大量合成。
【背景技術】：
[0002] 丙氨酸（alanine)又名2-氨基丙酸，一種脂肪族的非極性氨基酸。分子式為 C3H7O2N，結構式如下所示，相對分子質量為89. 063。常見的是L-丙氨酸，是蛋白質編碼氨基 酸之一，哺乳動物非必需氨基酸和生糖氨基酸，只有L-丙氨酸能被人體吸收和利用。D-丙 氨酸存在于多種細菌細胞壁的肽聚糖或作為細菌的肽抗生素。D-丙氨酸的生產和應用近 年來得到廣泛的關注，D-丙氨酸是生產維生素 B6的原料，且具有良好的鎮(zhèn)痛效果。另外， D-丙氨酸可以作為調味劑應用于食品生產中，可以用于改善甜味劑的味道和調節(jié)有機酸的 酸味。除此之外，D-丙氨酸還是角質層保持水分的重要角色，可以作為一種良好的保濕劑 應用于化妝品行業(yè)。
[0003]
【主權項】
1. 一株可利用甘油生產丙氨酸的大腸桿菌BW25141，質粒pALA，基因工程菌ALA16117 和丙氨酸合成相關酶的基因 alaD。
2. 根據權利要求1中，利用甘油發(fā)酵生產丙氨酸的方法，包括培養(yǎng)所需條件和培養(yǎng)基 配方。
3. 根據權利要求1中利用甘油發(fā)酵生產丙氨酸的大腸桿菌基因工程菌的制備方法，包 括： a. 利用設計的引物擴增得到兩個相關合成酶的基因片段 b. 利用熱擊法將構建質粒轉化入大腸桿菌的方法 c. 用氨芐青霉素篩選陽性克隆并用于生產的方法。
4. 根據權利要求1中丙氨酸合成酶的相關基因設計的引物為：引物序列1，2。
5. 根據權利要求1中利用基因工程菌生產丙氨酸的發(fā)酵方法及培養(yǎng)基： LB 培養(yǎng)基（IL) :Tryptone(胰蛋白胨）：10g，Yeast Extract(酵母提取物）：5g， NaCl (氯化鈉）：10g。若配制固體培養(yǎng)基，則再加入15g Agar (瓊脂）。 M9培養(yǎng)基（IL) :Na2HP04,7H20(七水合磷酸氫二鈉）：12.8g，KH 2P04(磷酸二氫鉀）：3g， NaCl (氯化鈉）：0.5g，NH4Cl (氯化銨）：lg，Glycerol (甘油）：20g。Yeast Extract (酵母 提取物）：5g，IM MgSO4 · 7H20(七水合硫酸鎂）1ML，0. IM CaCl (氯化鈣）：1ML。 將所得基因工程菌在3ML含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37°C，250rpm培養(yǎng)12小時， 轉入M9培養(yǎng)基，M9培養(yǎng)基在使用前加入氨芐青霉素，37°C培養(yǎng)3小時，加入4 μ L濃度為 0. 5mM的IPTG誘導，并轉入30°C，250rpm培養(yǎng)24-48小時。
6. 根據權利要求5中，利用基因工程菌大量發(fā)酵生產丙氨酸的擴大培養(yǎng)方法，包括分 批補料，流加等發(fā)酵方法。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌利用甘油生產丙氨酸的方法。具有如下步驟：1)克隆參與丙氨酸生物合成的基因alaD，2)將此基因與大腸桿菌高拷貝載體pUC19連接以構建含有丙氨酸生物合成所需蛋白的編碼基因的重組載體，3)將重組質粒轉入大腸桿菌BW25141中，通過氨芐青霉素的篩選標記，從而獲得了大腸桿菌高產丙氨酸的菌株，4)通過發(fā)酵生產丙氨酸，并從發(fā)酵液中回收丙氨酸。該方法具有環(huán)保，高效，穩(wěn)定，價格低廉等優(yōu)點。
【IPC分類】C12N15-70, C12P13-06, C12N1-21
【公開號】CN104560840
【申請?zhí)枴緾N201310488475
【發(fā)明人】劉立棟
【申請人】常州邱鴻生物技術有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月18日